多聚酶链式反应扩增DNA片段（用）.ppt

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1、温故知新1:组成DNA分子的基本单位是什么?这些基本单位是如何连接成DNA分子的?DNA分子结构有什么特点？脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）12345OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’脱氧核苷酸链结构简图磷酸二酯键5’5’3’3’细胞中DNA分子的复制过程是怎样的？细胞中DNA分子的复制需要哪些条件？温故知新2DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使D

2、NA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(一小段RNA)细胞内DNA复制的条件1、PCR（多聚酶链式反应）技术：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。2、原理：利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。一、基础知识（一）PCR原理：DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(一小段RNA)3、PCR反应的条件80—100℃：耐热的DNA聚合酶：缓冲

3、溶液：维持反应的pH值不变(一般是一小段单链DNA)细胞中DNA复制条件(二)PCR反应的过程1、变性：温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚成为单链。2、复性（退火）：温度下降到50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。3、延伸：温度上升到72℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。PCR循环第一步：加热变性(80-100℃)双链DNA解聚成为单链模板序列模板序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与模板序列复性（退火）:引物与模板DNA单链的互补序列配对结合模板序列模板序列

4、引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸(72℃左右)合成新的DNA链模板序列模板序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,82430次循环后扩增的数量4、PCR循环的结果②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。第一轮结果12341234第二轮结果二、实验操作1、PCR仪（一）

5、设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器。2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml。3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。PCR仪微量离心管微量移液器1、准备2、移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。②注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。

6、①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4、离心5、反应②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。循环数变性复性延伸预变性94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6、注意事项①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头,一次性吸液枪头用一次更换一次。（一）理论上DNA扩增数目的计算三、课题成果评价1、一条DNA，

7、复制n次，DNA为：2n2、a条DNA，复制n次，DNA为：a2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。2、过程①稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。③计算④计算DNA含量（g）＝50*x（260nm的读数）x