流动相的pH值和离子强度对牛血清蛋白高效液相色谱手性柱分离性能的影响.pdf

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1、第4O卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第1期2012年1月ChineseJournalofAnalyticalChemistry89～94流动相的pH值和离子强度对牛血清蛋白高效液相色谱手性柱分离性能的影响熊雅进苏文翠章伟光范军郑盛润林纯(华南师范大学化学与环境学院／特种材料研究所，广州510006)摘要利用羰基咪唑一柱上衍生法制得牛血清蛋白(BSA)生物手性柱，并研究它在高效液相色谱中对3种对映异构体(色氨酸、匹多莫德及4_苯基一1,3一恶唑烷一硫酮(L一苯))的手性分离性能。实验结果表明：随着pH值从5．0上升到7．0

2、，由于L一色氨酸与BSA有固定的作用位点，使得其保留值随着pH值的增加而大幅增大。而D一色氨酸与BSA无固定作用位点，其保留值随pH变化基本不变，分离度由1．15上升到8．91，增加了6．8倍；酸性样品匹多莫德与BSA主要是静电作用，与色氨酸相反，其对映体的保留值随着pH的增加逐渐减小，分离度逐渐下降，pH7．0时为单峰，pH5．0时Rs=1．27；中性样品L一苯的分离度随着pH值的增加有小幅增大。随着离子强度的减小，3对对映体的保留都增强，分离度增大，增加的幅度依次为色氨酸>匹多莫德>L一苯。关键词牛血清蛋白(BSA)；高效液相色谱

3、；手性分离；pH值；离子强度1引言在过去几十年里，色谱工作者对多类HPLC手性选择剂，如环糊精类，大环抗生素类，多糖类以及蛋白质类等叫开展研究。蛋白质是由L一氨基酸组成的复杂生物大分子，其特殊的立体选择结构造就了表面特殊的手性环境和作用位点，使得蛋白质手性固定相(CSP)具有特殊的手性识别能力】，可用于拆分其它CSP所不能拆分的药物。因此，受到研究者的极大关注。目前，已有多种蛋白质固定相，如牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HsA)、一酸性糖蛋白(AGP)、卵粘蛋白(OvM)、胃蛋白酶和纤维素水解酶等，实现商品化，应用在手性分离研究中

4、。由于蛋白质固定相受外部环境，如pH值、温度、离子强度等影响较大，蛋白质手性柱的分离能力也受到诸多因素的影响。深入探讨影响蛋白质手性柱分离能力的因素，有利于进一步研究生物手性固定相的拆分机理，优化拆分条件。1982年，Allenmark等首次研究BSA-CSP[9~11]。之后，关于血清蛋白生物手性柱的研究主要集中于拆分色氨酸、安息香、华法令等手性分析物[12,13】，主要研究色氨酸和华法令等对映体的拆分条件优化，而从HPLC角度探讨血清蛋白与手性物质问的作用机理的研究报道较少。色氨酸属于生物活性样品，是一种芳香族、杂环、非极性a一氨

5、基酸。L一色氨酸是组成蛋白质的常见20种氨基酸中的一种，是哺乳动物的必需氨基酸和生糖氨基酸。在自然界中，某些抗生素中有D一色氨酸。匹多莫德是一种常用的酸性药物，是由人工合成的免疫刺激调节剂。通过刺激非特异性自然免疫，体液免疫和细胞免疫产生效应，目前还没有关于其HPLC手性拆分的报道。L一苯为一种化学合成的手性物质，多作为合成其它手性物质的中间体，本身呈中性偏弱碱性。本研究在已有研究[14,15基础上，参照文献『16]制备了以硅胶为基质键合的牛血清蛋白手性HPLC柱，采用BSA-CSP拆分匹多莫德和L一苯，优化了拆分色氨酸的色谱条件，考

6、察了它们对3对对映异构体在BSA手性柱分离效果的影响，并初步探讨了BSA手性固定相的拆分机理。2实验部分2．1仪器与试剂pH211精密酸度计(上海日岛科学仪器有限公司)；液相色谱装柱机(美国Alltech公司)；高效液相201卜03—11收稿；201卜07-21接受本文系2010科技部科技型中小企业技术创新基金(No．10C26214412704)、广东省国际合作一重点引进项目(No．2010B050300021)和广东省教育部产学研结合项目(No．2009B090300081)资助E-mail：wgzhang@scnu．edu．cn

7、分析化学第40卷色谱仪(美国，LiballianceSerialⅢ，SSI23201)。5um，300A球形硅胶；N，N，_羰基二咪唑(cDI)，3一氨基丙基一乙氧基硅烷(AlfaAesar公司)；乙腈、甲醇(色谱纯)；H：NaPO、HNa：PO(分析纯，天津大茂)；去离子水(经过0．45p,m微孑L滤膜，溶剂过滤器过滤)；BSA，色氨酸(Trp，广州市齐云生物技术有限公司)；L一苯(参照文献『17]合成)，匹多莫德。手性分析物的纯度均超过99％，其结构如图1所示。2．2牛血清蛋白生物手性柱的制备参照文献[14]，合成氨化硅胶。以80

8、00psi的压力填人不锈钢柱(150minx4．6mm)。以N，羰基二咪唑(CDI)为偶联剂，用柱上衍生法将牛血清蛋图13种手性对映体的结构白键合到上述硅胶上(图2)。经NaCI冲洗去除多ng·1ru。tureofth“