第八章高效液相色谱的色谱柱和流动相

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1、色谱分析应用化学系高效液相色谱的色谱柱和流动相色谱柱HPLC柱填料1、全多孔球形硅胶填料最为普遍硅胶基质分为微孔(小于2nm)，中孔(2-50nm)，大孔(大于50nm)硅胶，多用中孔和大孔硅胶填料2、其它金属氧化物基质填料TiO2、ZrO2、高分子聚合物等基质的填料，能够改善耐碱性和减弱硅羟基效应。硅胶色谱柱填料的优势硅胶有良好的机械强度硅胶的孔结构和比表面积容易控制硅胶填料具有比较好的化学稳定性和热稳定性硅胶表面具有丰富的硅羟基，可以进行化学键合修饰硅胶色谱柱填料的残余硅羟基效应碱性分析物严重拖尾，分离度低。加入碱性流动相添加剂抑制反相色

2、谱柱填料保留性能随温度的变化lnk’与1/T在一定温度范围内呈线性关系提高硅胶基质反相色谱填料的色谱性能提纯硅胶，利用高纯(99.999%)硅胶色谱填料对硅胶进行充分封端（尾）利用空间位阻掩蔽残余硅羟基键合相分子中嵌入极性基团（胺基、脲基、酰胺基）双齿键合相高效液相色谱的流动相常用反相色谱流动相：甲醇-水、乙腈-水常用正相色谱流动相：正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇、正己烷-四氢呋喃常用离子色谱流动相：稀硝酸、稀氢氧化钠需要考虑流动相自身中紫外检测波长下的吸收强弱，溶剂紫外截止波长见表9-4。高效液相色谱方法的选择反相色谱可以分析多数样品。极性极

3、强的水溶性样品在反相色谱中保留很弱，难以有效分离，可以用正相色谱（氨基柱、二醇基柱）有机溶剂-水流动相分离。弱酸、弱碱样品抑制电离，反相分离。分析离子，首选离子色谱。生物分子的分离模式有反相、离子交换、体积排阻、疏水作用、亲和色谱模式。色谱条件的影响色谱柱影响分离度，越长分离度越大，内径越小分离度越高。柱填料影响分离度，颗粒越小柱效越高，分离度越大，但柱压越高（5μm到3μm柱效提高30%柱压却升高1倍）。流动相影响保留，洗脱能力越强，分析时间越短，如：反相色谱流动相中有机组分增加保留减弱。流速越高，保留时间越短，但柱压液越高。柱温越高，保留

4、时间越短，分离度有所降低。在等度洗脱难以获得短的分析时间和满意色谱峰形时，可以进行梯度洗脱。40度169bar90度94barSB-C84.6X75mm3.5um866953-906流通池:5mm,2.5uL20~60%B(10min.)2mL/min.SB-C84.6X150mm5um883975-906流通池:10mm,8uL20~60%B(30min.)1mL/min.5um色谱柱尺寸:4.6x50mm3.5um色谱柱尺寸:4.6x50mm-CN-苯基C8液相色谱键合相的类型和色谱性质的主要影响因素高效液相色谱键合固定相的类型主要有四类

5、：硅-氧-碳键型固定相硅-氮-碳键型固定相硅-氧-硅-碳键型固定相硅-碳键型固定相1、硅-氧-碳键型固定相制备方法之一：高压、过量醇、280度条件下与硅胶的硅羟基发生反应。制备方法之二：亚硫酰氯处理硅胶获得表面氯化硅胶，再与过量醇进行醇解反应。缺点：容易被水解2、硅-氮-碳键型固定相制备方法：先将硅胶表面氯化，再使伯胺与氯化硅胶反应。对有机溶剂和pH=3-8的水介质稳定。3、硅-氧-硅-碳键型固定相制备方法：硅胶表面的硅羟基与有机氯硅烷或有机硅氧烷进行硅烷化反应。对有机溶剂和pH=2-8.5的水介质是稳定的。4、硅-碳键型固定相制备方法：氯化

6、硅胶和有机锂或格氏试剂反应。稳定性优于硅-氧-碳键型固定相，但生成的产物覆盖度较低。键合固定相的性质1、表面覆盖度完全水解的硅胶表面有8umol/m2硅羟基，由于位阻的存在只有约一半的硅羟基可以进行反应。好的填料要把残余硅羟基掩蔽起来，利用掩蔽试剂与参与硅羟基反应，以消除其不良影响。表面覆盖度越高，色谱保留越强。2、键合相链长的影响对于反相色谱固定相键合相链长越长保留越强对于正相色谱固定相链长的影响不明显。3、键合固定相基质性质的影响基质的种类、表面积、化学性质影响键合量、覆盖度等，都会对键合相有一定的影响。高效液相色谱的色谱柱和流动相色谱柱

7、HPLC柱填料1、全多孔球形硅胶填料最为普遍硅胶基质分为微孔(小于2nm)，中孔(2-50nm)，大孔(大于50nm)硅胶，多用中孔和大孔硅胶填料2、其它金属氧化物基质填料TiO2、ZrO2、高分子聚合物等基质的填料，能够改善耐碱性和减弱硅羟基效应。硅胶色谱柱填料的优势硅胶有良好的机械强度硅胶的孔结构和比表面积容易控制硅胶填料具有比较好的化学稳定性和热稳定性硅胶表面具有丰富的硅羟基，可以进行化学键合修饰硅胶色谱柱填料的残余硅羟基效应碱性分析物严重拖尾，分离度低。加入碱性流动相添加剂抑制反相色谱柱填料保留性能随温度的变化lnk’与1/T在一定温

8、度范围内呈线性关系提高硅胶基质反相色谱填料的色谱性能提纯硅胶，利用高纯(99.999%)硅胶色谱填料对硅胶进行充分封端（尾）利用空间位阻掩蔽残余硅羟基键合相分子中嵌