琼脂糖凝胶电泳试验课件.ppt

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1、琼脂糖凝胶电泳技术实验三一、实验目的学习与掌握DNA电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分子量，及分离不同大小DNA片段。二、材料、试剂和仪器材料：质粒、银杏DNA试剂：DL2000Marker、琼脂糖、50×TAEelectrophoresisbuffer、6×loadingbuffer、EB贮存液、双蒸水仪器：电泳仪、微波炉、成像系统、电子天平、移液器、一次性薄膜手套、量筒、烧杯、三角瓶、吸头等三、实验原理概言之：DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DN

2、A分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254~365nm紫外照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。（此法可观察到凝胶中2ng左右的DNA）。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约200bp~50kb。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，当其加热到沸点后再冷却凝固就形成良好的电泳介质，其孔径决定于其浓度。电泳介质中的孔径对电泳迁移中的带电分子产生一种阻力，阻力的大小取决于带电分子的大小

3、及其物理性状。在生理条件下，核苷酸的磷酸基团是带负电荷的，所以DNA分子是多聚阴离子，在电场中向正极迁移。DNA分子带电量与其大小成正比的。在一定电场强度下，若无任何介质阻碍迁移，则大DNA分子比小DNA分子跑得快。但在实际电泳中，由于使用了琼脂糖分子筛介质，对大分子DNA产生了较强的阻力，因此大分子DNA尽管有较高的带电量，仍难以快速前进；小分子DNA由于能够穿越介质网孔，其带电量尽管相对较小，但仍能快速迁移到正极。因此，不同的DNA分子在琼脂糖凝胶中产生了不同的迁移距离，这种迁移距离的差异使得不同大小DNA得以

4、分离。核酸迁移率的影响因素：影响核酸电泳的因素1）核酸的性质核酸的电荷量、分子大小、分子空间构象决定了不同核酸分子具有不同的迁移率。线性双链DNA分子，分子量的常用对数与泳动率呈反比关系；而分子的空间构象影响影响泳动速率，如分子量相同的质粒DNA的迁移速率则是：闭环型>线性>单链开环型。其他结构如：(A)单链RNA或单链DNA的分子内局部配对；(B)与蛋白质结合的DNA复合体2）凝胶孔径大小琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel，PAG）是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化

5、调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段。凝胶胶浓度（%）线状DNA分子的有效分离范围琼脂糖0.35~60(kb)0.70.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~42.00.1~3PAG3.5100~2000(bp)5.080~5008.060~40012.040~20015.025~15020.06~100不同（空间）类型核酸的凝胶电泳：单链RNA或单链DNA——变性胶电泳：在缓冲液和凝胶中加入尿素或甲醛等核酸变性剂，使分子内配对结构打开，使其带电量和分子形状无关，仅与分子大小有

6、关。质粒（具有高级结构的DNA）——一般的琼脂凝胶电泳；但由于结构的不同可能会出现不同的条带。比较大的DNA分子——脉冲式电泳与蛋白质结合的DNA复合体——凝胶电泳阻滞分析（electro-mobilityshiftassay,EMSA）。3）电场强度和电场方向低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比，通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm凝胶。对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨力和整齐的带型。可以通过脉冲电场凝胶电泳分离极大片段的DNA。4）

7、电泳环境缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间进行缓冲液循环，并经常更新TAE。缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导电性极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带负电荷，向正极泳动。在进行电泳时，荧光染料EB可插入到

8、碱基中，从而增加线状和开环DNA的长度，使其刚性更强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。1.利用EppendorfBiophotometer测定基因组DNA、质粒pGEX-4-T的浓度和纯度。1）将所给DNA样品用无菌蒸馏水分别稀释2倍和10倍，并编号：DNA1、DNA2，pG1、pG2；2）用无菌蒸馏水清洗干净的比