人胃癌体外耐药模型的建立及新型甾体联苯类化合物抗肿瘤活性研究.pdf

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1、学校代码10459学号或申请号201422283273密级专业业硕硕士学位学位论文人胃癌体外耐药模型的建立及新型甾体联苯类化合物抗肿瘤活性研究作者姓名：王玉清导师姓名：刘宏民教授专业学位名称：药学培养院系：药学院完成时间：2017年5月AdissertationsubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterTheEstablishmentofthe5-Fluorouracil-ResistantHumanGastricCancerCellLineandtheStudyonAnticance

2、rEffectofNovelSteroidalCompoundByYuqingWangSupervisor:Prof.HongminLiuPharmacySchoolofPharmaceuticalScienceMay,2017学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声

3、明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日摘要首先，我们采用浓度递增法刺激人胃癌细胞MGC803，建立了人胃癌体外耐

4、药细胞模型MGC803/5-FU，并初步探讨了MGC803和MGC803/5-FU的生物学性质及耐药株MGC803/5-FU的耐药机制。在这部分的研究中，我们以人胃癌细胞MGC803为亲本细胞株，以化疗药物5-氟尿嘧啶低浓度持续刺激，并逐渐加大刺激浓度，建立人胃癌体外耐药细胞模型MGC803/5-FU。耐药细胞株建立后，我们采用CCK8法检测了亲本细胞株及耐药细胞株对5-氟尿嘧啶、顺铂、紫杉醇、阿霉素的耐药性及耐药细胞株撤药6个月内的耐药稳定性。同时，5-氟尿嘧啶作用亲本细胞与耐药细胞后，经DAPI染色和AnnexinV/PI染色进一步验证耐

5、药株MGC803/5-FU对5-FU的耐药性；然后，我们通过PI染色、平板克隆和绘制生长曲线等检测了MGC803和MGC803/5-FU生物学性质的差异。最后，通过Westernblot检测亲本细胞和耐药细胞P-gp、TS、β-catenin等蛋白表达量的差异，分析可能的耐药机制。经过8个月的诱导，成功建立了人胃癌体外耐药细胞模型MGC803/5-FU，耐药指数为13.02，但交叉耐药现象不明显；同时，耐药细胞株撤药六个月内耐药指数能够保持在9到13之间，耐药稳定性较好。5-氟尿嘧啶作用后，相同浓度下，耐药细胞的凋亡率明显低于亲本细胞。与亲本

6、细胞相比，耐药细胞G0/G1期比例增加，S期比例减少；耐药细胞生长速度减慢，群体倍增时间增大，克隆形成率降低。耐药细胞中TS蛋白表达量增加，同时Wnt/β-catenin通路相关蛋白发生改变。在耐药模型的基础上，我们接着研究了新型甾体联苯类化合物ZYL-263对胃癌细胞MGC803及其耐药细胞MGC803/5-FU的抗肿瘤活性及其机制。我们采用CCK8法和平板克隆法检测化合物ZYL-263对MGC803及MGC803/5-FU细胞生长增殖的影响。DAPI染色和AnnexinV/PI染色检测ZYL-263对两株细胞细胞凋亡的影响；同时，DCFH

7、-DA染色检测ZYL-263对两株细胞活性氧的影响。最后，ZYL-263作用两株细胞后，Westernblot检测Bcl-2、Bax、Total-Caspase-7、Cleaved-Caspase-7、Total-PARP-1、Cleaved-PARP-1、TS等蛋白表达量的变化。I结果显示，ZYL-263对MGC803及MGC803/5-FU有较好的生长抑制作用，同时MGC803/5-FU的IC50低于其对MGC803的的IC50；同时，ZYL-263能够抑制两株细胞的克隆形成。ZYL-263能够使两株细胞的细胞核发生皱缩和明显的凋亡，且M

8、GC803/5-FU的凋亡率高于MGC803的凋亡率。ZYL-263作用两株细胞后，胞内活性氧水平明显增高。ZYL-263能够降低两株细胞内的Bcl-2、Total