过氧化物酶POD的测定.doc

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1、过氧化物酶活性的测定愈创木酚法目的意义过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酚类物质代谢、物抗性密切相关。通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法及其原理。过氧化物酶催化H202氧化酚类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的产物。本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H202将愈创木酚氧化生成茶褐色产物，此产物在470nm波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm波长下的吸光度变化得知过氧化物酶的活性。三、材料、设备和试剂1．材料马铃薯或小麦芽、未成熟的苹果、新鲜茶叶等。2．设备721型分光光度计、离心机

2、、秒表(或手表)、天平、研钵、磁力搅拌器。3．试剂愈创木酚、30％过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6．0)。反应混合液配制取100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28µl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚完全溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19µl以，混合均匀，保存于冰箱中。三、操作方法1．酶液制备称取植物材料1g，加入20mmol/LKH2PO4溶液5m1，于研钵中研磨成匀浆，在33000r/min下离心10min，上清液转入25m1容量瓶中，残渣再用5ml

3、KH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液，定容，混匀，贮于冷凉处备用。2．比色测定取光径1cm比色杯2只，于1只中加入已混匀的反应混合液3m1，KH2PO4溶液1ml，作为参比液；另一只中加入反应混合液3ml，酶液1m1(如酶活性过高可稀释之)，立即记时并置于分光光度计中。在470nm下测定光密度，每隔1min读数一次，连续测30min，每次测定前重新用对照校准。若气温较低，应适当提高室温，以37℃为最适宜。四、实验结果1．以时间为横坐标，光密度为纵坐标作图。反应前期过氧化氢酶活性随反应时间直线上升，升到最大值后，其相关曲线出现转折点，转折出现

4、的早晚取决于温度。在曲线的前期部分找到一段近似直线的部分，和直线起点时间t1和光密度A1、直线终点时间t2和光密度A2。2.计算以没minA470变化0.01为1个过氧化物酶活单位（µ），计算其活力及比活力。酶活力（0.01A470·min-1）=A2-A1/（t2-t2）×0.01×D酶的比活力（u·g-1）=酶活力（µ）/样品重（g）或样品中蛋白质含量（mg）A2-A1：吸光度的变化t2-t2：时间变化D：稀释倍数，即提取的酶液总量为反应系统内酶液的倍数。U：酶活力单位（即0.01A470·min-1）