SOD POD CAT酶活测定

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1、0.067mol/LpH7.0磷酸缓冲液分子量0.067molPH7.0(1000ml磷酸缓冲液)所需量（ｇ）Ｎa2HPO4.2H2O178.05　　　7.1184gＮa2HPO4.12H2O358.2214.4004gKH2PO4136.093.6292gＮa2HPO4.2H2O7.1184g(或Ｎa2HPO4.12H2O14.4004g)+KH2PO43.6292g定容到1000ml容量瓶中一根系活性的测定1、实验材料、试剂与仪器设备1.实验试剂乙酸乙酯(分析纯，次硫酸钠(Na2S2O4，分析纯)，粉末，1%TTC溶液，磷酸缓冲液(1/15mol/L，pH7.0)，1m

2、ol/L硫酸。2.仪器设备小烧杯3个，研钵1个，移液管：0.5mL1支、10mL1支、5mL3支，刻度试管6支，分光光度计，电子天平，温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。2、实验内容操作步骤2、定量测定(1)TTC标准曲线的制作取0.4％TTC溶液0.2ml放入大试管中，加9.8ml乙酸乙酯，再加少许Na2S2O4粉末摇匀，则立即产生红色的TTF。此溶液浓度为每毫升含有TTF80μg。分别取此溶液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF20μg、40μg、80μg、120μg、160μg

3、的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参照，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品0.5g，放入小烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液(pH7.0)各5ml，使根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1—2h，此后立即加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。(与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，37℃下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上)。（3）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯3—4mL，充分研磨，以提出TTF。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2—3次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光

4、光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参照测出吸光度，查标准曲线，即可求出TTC原量。2.计算结果CW×h×1000根系活力[mgTTF/（g.h）]=式中：C——四氮唑还原量，μg;W——根重，g;h——时间，h。二叶绿素含量测定：95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.88D649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245三抗氧化酶活性的定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506gNa2HPO4·12H2O+2.

5、65285gNaH2PO4·2H2O,定容到4L。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。2.1丙二醛（MDA）的测定：20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）；0.5%硫代巴比妥酸（T

6、BA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/LpH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P124） 2.2超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT(400ml)混合反应液:392mlPBS(Ph

7、=7.8),+0.0206gNBT+0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4mlEDTA-Na溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。（另配）100mlPBS溶液加EDTA-Na3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。2.3过氧化物酶（POD）的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251gNa2HPO4·12H2O+3.042975gN