sod、pod、cat、mda和可溶性蛋白的测定

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1、SOD、POD、MDA、可溶性蛋白、脯氨酸、电导率、可溶性糖的测定一、磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的KH2PO4溶液称取分析纯KH2PO427.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。B液：0.2M的K2HPO4溶液称取分析纯K2HPO4•3H2O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。或（A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O31.21克，用蒸馏水定容至1000毫升。B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O71.64克，用蒸馏水定容至1000毫升。）二、酶液的制备：称取0.5g样品放入研钵中，加2毫升0.05MPH

2、=7.8的磷酸缓冲液及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10毫升离心管中，再加3毫升磷酸缓冲液冲洗研钵，4℃冷冻离心20分钟（若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。三、SOD的测定：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2)130mMMet(甲硫氨酸)：取1.9399克Met用磷酸缓冲液定容至100ml；棕色瓶避光4℃保存。（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容

3、至100ml；棕色瓶避光4℃保存。(4)100μMEDTA-Na2:取0.0372gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，棕色瓶避光保存；(5)20μMFD(核黄素):0.00753gFD用蒸馏水定容至1000ml。随用随配。棕色瓶避光保存；SOD反应混液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：H2O的比例为15：3：3：3：2.5，按母液顺序配制，然后依次加入核黄素和酶液。2.SOD的测定：取型号相同的试管，吸取20微升的酶液，加入3毫升，4000Lux照光30分钟，同时取两支试管，一支做对照，一支做空白（对照、空白不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（C

4、K）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，反应后遮光保存，以空白调零，560nm比色。每个试验重复三次（3试验+3空白+3对照）3.结果计算SOD总活性（吸光度/g·FW）=（ACK—AE）×V／（W×0.5×Vt×ACK）单位：NBT光还原50%为单位SOD比活性（酶单位/mg蛋白）=SOD总活性/蛋白质浓度SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。注意：1.要10ml离心管，不

5、要大试管，否则枪头够不着，不好吸；2．提取液预冷；3.测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量4.照光时间和强度严格控制，试管要透明，质地均一。-3-四、POD的测定：1.0.1MPH6.0磷酸缓冲液的配制：A液219.25+B液30.75，定容至1000毫升；2.POD反应液的配制：0.1MPH6.0的磷酸缓冲液50毫升于烧杯中，加入愈创木酚28微升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O219微升混合，保存于冰箱中。3.POD的测定：20微升酶液+3毫升反应液于比色皿中，以PBS为对照调零，在470nm下每隔1分钟读数一次，共读三次，以每分钟吸光度变

6、化值（ΔA470/min·mgpr或ΔA470/mgFW）表示酶活力的大小。结果计算：POD活性POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/gmin)ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）五、MDA的测定：1.MDA反应液的配置：0.6克TBA（硫代巴比妥酸），先用少量1MNaOH溶解，用10%TCA（三氯乙酸）定容至100毫升。1.MDA的测定：1毫升酶液+2毫升0.6%的TBA，封口沸水浴15分钟，迅速冷却后1500转10min离心，取上清液，在600、5

7、32、450nm三个波长下比色。2.结果计算：MDA浓度C(umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450MDA含量(umol/gFW)=C×V/WV为提取液体积(ml)，W为样品鲜重(g)六、可溶性蛋白的测定反应液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。100μg/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液:10mgBSA,0.9％氯化钠溶解，