POD 测定方法

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1、植物体POD的测定※<原理>了解过氧化氢酶活性测定的几种方法，掌握用愈创木酚法分别测定过氧化氢酶和过氧化物酶的活性。过氧化物酶广泛颁布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。※<实验材料、试剂与仪器设备>1、实验仪器　722型分光光度计、离心机、秒表、电子天平、研钵2、实验试剂　愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液［100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50m

2、L，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存于冰箱中］3、实验材料　任何植物材料※<实验步骤>1、粗酶液的提取　称取植物(小麦叶片)材料0.1g，加20mmol/LKH2PO45mL，于研钵中研磨成匀浆，以10000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO45mL溶液提取一次，全并两次上清液。2、酶活性的测定　取比色皿2只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液

3、3mL，上述酶液1mL(如酶活性过高可适当稀释)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔30s读数一次。以每分钟表示酶活性大小，即以△OD470/min.mg蛋白质表示，蛋白质含量测定按Folin法进行。※<结果计算>以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min.g(鲜重)]表示之。也可以用每min内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)表示。过氧化物酶活性[u/(g.min)]=式中：ΔA470——反应时间内吸光度的变化。W——植物鲜重，g。VT——提取酶液总体积，

4、mL。Vs——测定时取用酶液体积,mL。t——反应时间，min。项目详细信息介绍项目名称过氧化物酶(POD)活性的测定（比色法）所属实验课程植物生理学实验学年度2007-2008学期01专业分类生物化学关键词过氧化物酶(POD)活性的测定实验要求选修带课教师陈颖实验目的过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光度计测量生成物的含量。基本描述1．称取植物材料1g，加入，0.1mo1/L磷酸缓冲(pH7.0)10ml(分三次加入，最后两次用于洗研钵

5、)，在研钵中研磨成匀浆，以4000r／min离心15分钟，倾出上清液。2．取一试管加3.8ml0.3%愈创木酚反应液，加100ul3％过氧化氢，加酶液100ul（视酶活性大小而定，如酶浓度高可稀释后再测定），摇匀，立即在分光光度计470nm下测吸光度，从加入酶液时立即开启秒表记录时间，1分钟时读数一次（也可2min，视材料而定）。3．以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以△A470/min.mg蛋白质（或鲜重g）表示之。过氧化物酶活性(U)=△A470/min×稀释倍数/g.Fw该实验涉及到的主要仪器设备null

6、实验总人数30每组人数4实验学时2是否特色否实验地点植物生理学实验室3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—13.6gNaAc.3H2O（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml30%H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯

7、中依次加入2ml0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min过氧化物酶(POD)活性的测定【实验原理】植物体内的黄素氧化酶类代谢产物常包含H202，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中的葡萄糖氧化酶等。H202的积累可导致破坏性的氧化作用。过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)是清除H202的重要保护酶，能将H202分解为02和H20,从而使机体免受

8、H202的毒害作用。其活性与植物的抗逆性密切相关。(CAT)催化如下反应：2H202→2H20+02本实验通过测定H202的减少量来测定CAT的活性。在H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚。可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。【试剂药品1.50mmol/lpH7.0的磷酸缓冲液2.0.3%H202:吸0.5ml30