实验分子荧光法测定硫酸奎宁的含量.doc

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1、实验分子荧光法测定硫酸奎宁的含量一、实验目的1．了解仪器的性能与结构；熟悉仪器的操作步骤；2．学会绘制激发光谱和荧光谱图：（即确定最大的激发λEX和发射λEm）3．定量测定硫酸奎宁的含量（标准曲线法）二、实验原理硫酸奎宁，是喹啉类衍生物，能与疟原虫的DNA结合，形成复合物抑制DNA的复制和RNA的转录，从而抑制原虫的蛋白合成。适用于氯喹和耐多种药物虫株所致的恶性疟。硫酸奎宁分子量：782.96。分子式：(C20H24N2O2)2·H2SO4·2H2O它是强荧光物质，有两个激发波长250nm和350nm，荧光发射峰在450nm。在低浓度时，荧光强度与荧光物质量浓度呈正比：If=kC三、实验

2、内容1.仪器与试剂仪器：日本日立公司F-4600荧光分光光度计。试剂：（1）10μg·mL-1硫酸奎宁标准储备液：准确称取0.1000g硫酸奎宁，用0.05mol·L-1H2SO4溶液溶解，全部转移至l00ml容量瓶中，用0.05mol·L-1H2SO4溶液稀释至刻度，摇匀。取此溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用0.05mol·L-1H2SO4溶液稀释至刻度，摇匀。（2）0.05mol·L-1H2SO4溶液1000mL：取浓H2SO42.717mL用纯净水定容于1000mL容量瓶中,即得。(浓硫酸溶质质量分数为百分之98,密度=1.84g/cm^3)四、实验步骤1．系列标准溶液的配制

3、取5只25mL的容量瓶，分别加入10.0μg·mL-1硫酸奎宁标准溶液0.00，1.00、2.00、3.00、4.00mL，用0.05mol·L-1H2SO4溶液稀释至刻度，摇匀。分别为标0，标1，标2，标3，标4，标0做空白试剂。2．仪器操作步骤（1）检查仪器所有电源开关处于关闭状态，然后通电；（2）打开主机开关，电脑开关等；（3）通过电脑进入分析程序3.绘制激发光谱和荧光发射光谱：（以1.2μg/mL的标样找最大λEm和λEX）（1)仪器正常后设定试验参数，更改实验名称等；（2）进行预扫后，开始对所有标液及样品扫描；画出标准曲线A)将λEX固定在350nm,选择合适的实验条件,在40

4、0～600nm范围内扫描即得荧光发射光谱(可排除λEX的干扰)，从谱图找出最大λEm值；B)将λEM固定在450nm,选择合适的实验条件,在200～400nm范围内扫描即得荧光激发光谱(可排除λEM的干扰)，从谱图找出最大λEX值.C)绘制标准曲线将激发波长λEX固定在350nm（或250nm）左右处，荧光发射波长λEM固定在450nm左右处，在选定条件下，测量系列标准溶液的荧光强度。D）未知试样的测定取1只25mL的容量瓶，加入10.0μg·mL-1硫酸奎宁标准溶液2.5mL,用0.05mol·L-1H2SO4溶液稀释至刻度，摇匀。在标准系列溶液同样条件下，测量试样的荧光发射强度。E)

5、绘制荧光强度If对硫酸奎宁溶液浓度C的标准曲线，并由标准曲线求算未知试样的浓度Conc(μg/mL)。4.扫描完数据存盘后上传至网盘；5.退出分析程序，关机，关电源，取出比色皿，洗净保存所有玻璃器皿，实验结束。6.实验报告由网盘中下载数据写出。五、注意事项硫酸奎宁溶液必须当天配制、避光保存。六、思考题1．能用0.05mol·L-1HCl来代替0.05mol·L-1H2SO4稀释溶液吗？为什么要同时测定硫酸的空白溶液？2．哪些因素可能会对硫酸奎宁荧光产生影响？3.荧光分光光度计为什么要设两个单色器？4.荧光分光光度计和紫外分光光度计有哪些不同点？