基因工程的工具酶ppt课件.ppt

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1、第三章基因工程的工具酶第一节基因工程的工具酶第二节DNA的切割反应第一节基因工程的工具酶一、限制性内切酶（Endonucleosase）二、T4-DNA连接酶（T4-DNALigase）三、核酸酶四、聚合酶五、DNA修饰酶一、限制性核酸内切酶（Endonucleosase）（一）限制性内切酶的发现与分类1）限制－修饰系统：细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰。2）限制性核酸内切酶的类型主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源

2、三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处（二）II类限制性内切酶的命名及特性命名原则HaemophilusInfluenzued嗜血流感杆菌d株属名　　　　种名　　株名HindIIIHindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶（三）II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点几种最常用的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶名称识别序列和切割点BamHⅠ

3、ClaⅠEcoRⅠHindⅢHindⅡKpnⅠNotⅠPstⅠSalⅠSau3AⅠSfiⅠSmaⅠXbaⅠXhoⅠG↓GATCCAT↓CGATG↓AATTCA↓AGCTTGTPy↓PuACGGTAC↓CGC↓GGCCGCCTGCA↓GG↓TCGAC↓GATCGGCCNNNN↓NGGCCCCC↓GGGT↓CTAGAC↓TCGAG二、T4-DNA连接酶（T4-DNALigase）来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修复3‘端羟基和5’端磷酸基因，脱水形成3‘-5’磷酸二酯键。三、核酸酶作用：降解磷酸二酯键分为：外切酶内切酶（一）Bal31(来自于细菌Alteromona

4、sespejiana)单链特异内切，双链特异外切，依赖于Ca2+用途：构建限制酶图谱　　　产生末端缺失突变DNA超螺旋线性化（二）E.coli外切酶III只降解DNA分子的一条链，产生单链的DNA分子。（三）S1核酸酶（来源于米曲霉菌）特性：1.降解单链DNA或RNA，降解DNA的速度大于降解RNA的速度2.降解发生的方式为内切3.酶切活性需4.0-4.5pH环境，Zn2+激活4.酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降解活性比单链低75000倍（四）DNaseI:来自于牛胰腺，既可以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链（五）RNaseH：切割DNA

5、—RNA杂交双链中的RNA序列，使杂交双链变成单链DNA结构四、聚合酶（一）（二）Klenow酶该酶无5‘-3’外切活性，保留了5‘-3’聚合活性及3‘-5’外切活性。基因工程中利用该酶：修复限制性内切酶造成的5'突出的粘性末端　　标记DNA探针　　催化cDNA第二条链的合成　　末端终止法测序3’5’GA新链合成方向5’C（三）T4DNA聚合酶（四）T7DNA聚合酶测序酶（五）TaqDNA聚合酶耐高温，主要用于PCR反应DNA聚合酶活性RNaseH活性DNA内切酶活性　核酸结合活性（六）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：以RNA为模板

6、聚合cDNA链3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTTT3’cDNA3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18反转录酶Mg2+dNTP反转录酶的基本特性：（RNaseH）双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链5’3’RNA3’5’DNA5’3’RNA3’5’DNA3’5’DNA反转录酶反转录酶五、DNA修饰酶有大量的修饰酶，主要的有以下几种：1）碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基团。2）polynucleotidekinase:来自

7、于T4侵染的大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团。5‘3‘3‘5‘ppOHHO3）末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase）来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。5’3’3’5’ATGCATAGCADNA重组技术中最常用的工具酶酶主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切断DNA链DNA聚合酶Ⅰ或其大片段（Klenow）①缺口平移制作标记DNA探针②合成cDNA的第二链③填补双链DNA3’凹端④DNA序列分析TaqDNA聚合酶聚合酶链反应（PCR）DNA连接酶连接两个DNA分子或片段多核