混合酶消化法大鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定

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1、混介酶消化法人鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定基金项Fh福建省口然科学基金项H（编号：2908）作者单位：350004福建医科大学省立临床学院（孙玲）；福建省立医院（侯建明）通讯作者：侯建明【摘要】目的通过不断的摸索，寻找一•种获得细胞数量较多且纯的原代成骨细胞的体外培养方法，为下一步实验研究奠定基础。方法取出生24h内的SD人鼠脱臼处死，取岀颅盖骨,剪成1mmX1mmX1mm大小的组织片;釆用胰酶和I型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞；釆用“差速贴壁法”进行纯化。通过对细胞形态学的镜下观察，碱性磷酸晦染色及I型胶原免疫组化法等对细胞

2、进行鉴定。结果镜下观察所获得的细胞具冇成骨细胞的典型特征，细胞多为单核，呈三角形、多边形、长梭形等形态，并伸有粗人伪足；碱性磷酸酶染色及I型胶原免疫组化染色呈阳性。结论采用混合酶消化法可获得数量较多11活性较好的细胞，再采用“差速贴壁法”可以去除成纤维细胞等杂质细胞，获得纯度较高的成骨细胞。【关键词】成骨细胞；原代培养；人鼠；混合酶消化法PrimarycultureandidentificationofratseranialcoverosteocytesSUNLing,HOUJian-ming.FujianMedicalUniersit

3、y,Fuzhou350004,China[Abstract]ObjectiveThroughcontinuousexploration,wewanttosearchforamethodofcultivatingtheorigirialgenerationosteoblastsinvitrowhichcangetsalargerquantityandpuretheoriginalgenerationofosteoblasts,toprepareforthenextexperimentresearch.Methods24hoursoldof

4、SDratswereexecutedbydislocating.Thecranialcoverbonesofratswereremovingandcutingintotheblocksoflmmxlrmnxlmmsize.ThecrinialbonesweredigestingbymixedenzymewhichcontainsenzymeandItypecollagenase.Theosteoblastwerepurifiedbyselectiveplatingtechnique.Theosteoblastswereidentifie

5、dthroughmorphlogyobservation,alkalinephosphatasedyeing,collagenlimmunohistochemicalstaining.ResultsTheculturedcellshavethetypicalfeaturesofosteoblast・Thecellsaretrianglc,polygonal,longspindieshape,etc.andmostlyarcmononuclearcells,havelargepseudopodia・Alkalincphosphatased

6、yeingcollagenIinununohistochemicalstainingarebothpositive.ConclusionAlargequantityandactivityofthegoodcel1swereobtainedbymixedenzymedigestionmethod・Highpurityosteoblastswereobtainedbyselectiveplatingtechniquethatcanremoveimpuritiessuchasfibroblastcolls.[Keywords]Osteobla

7、st；Primaryculture；Rat；Mixedonzymedigestion随着中国人口老龄化的到来，骨质疏松的发病率呈上升趋势，骨质疏松的发病机制和治疗的研究也越來越引起人们的重视。为了探讨各种基因在成骨细胞中的衣达以及外源性基因对成骨细胞的影响，建立一•种简单，高效的成骨细胞培养方法成为口前各种科学研究的必要条件。冃前原代培养的成骨样细胞方法很多，各种方法获得的细胞数量、活性多不一致。笔者的研究在于通过不断的摸索，获得一种既操作简单，乂能获得细胞量较多且成活率较高的原代细胞培养方法，为下一步的实验萸従坚实的基础1材料与方法1

8、.1主要仪器、试剂及实验动物出生24h内的SD人鼠6只（吴氏实验动物），DMEM培养基（Hyclonc）>胎牛血清（Hyclone）^0.25%胰酶（加EDTA）（Hyclone）>I型胶原酶（Sigma）