sd大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察

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1、SD大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察作者：袁亚江梅晰凡，高蔚然，张赫【摘要】目的建立大鼠肋软骨细胞(RCC)分离、培养的方法,探讨其传代过程中细胞外基质及其形态的变化。方法采用胰酶和II型胶原酶两步消化法结合机械吹打获得分散的单个RCC，观察单层培养的不同代数RCC的细胞形态变化;采用免疫细胞化学方法检测不同代数RCC蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达。结果大鼠肋软骨经两步消化后，可获得高纯度的软骨细胞，经免疫组化及甲苯胺蓝染色呈阳性结果，同时观察到RCC在传代过程中细胞发生了去分化现象。结论软骨细胞可以通过传代培养获得扩增，但

2、仅限于四代以内细胞。【关键词】大鼠;软骨细胞;单层培养;去分化　　Abstract:ObjectiveToestablishtheseparatingandculturingmethodsforratcostochondralchondrocyte(RCC),andtoinvestigatetheirmorphouschangesinthecourseofcellpassage.MethodsUnderthehelpofcollagenaseIIandtrypsinsdigestion,thescatteredsingleRC

3、Cwasobtained.TheobservationofmorphologicalchangesofRCCcellsculturedbymonolayercultureindifferentgenerationswascarriedout.And11thedetectionoftheexpressionofcollagenIIandproteoglycanofRCCcellsindifferentgenerationsbyimmunocytochemicalmethodwasalsoimplemented.ResultsHig

4、hpuritycartilagecellswereobtainedfromratcostalcartilagesafterdigestedbycollagenaseIIandtrypsin.Itwasconfirmedbyimmunohistochemistryandtoluidinebluestaining.ThededifferentiationofRCCcellswasobservedwhentheRCCcellswereculturedbymonolayerculture.ConclusionsRCCcellscanbe

5、amplifiedbypassageCulture,butonlywithinthecellsoffourgenerations.　　Keywords:rat;cartilagecell;monolayerculture;dedifferentiation　　关节软骨损伤后，因局部血供缺乏，所以多年来一直被认为软骨细胞本身不具有修复与再生能力。1989年Webber[1]的研究结果却显示:软骨细胞能进行自我修复，只是它们的修复能力在体内环境中不能得到激发。　　自20世纪80年代以来，人们对关节软骨的再造和修复研究的焦点已转向细胞

6、疗法(cell-basedtherapy)，即移植足够数量的软骨细胞来修复关节软骨的缺损。Yanchun11Liu等[2]偿试应用自体关节软骨细胞为种子细胞，以聚轻基乙酸(polyglycolicacid,PGA)及Pluronic为支架材料，对猪膝关节全厚软骨缺损(直径8mm)进行修复，在24周时取得了最佳修复效果。修复的缺损表面光滑，与周围正常软骨无法区分，新生软骨在组织学、生化组成上与正常关节软骨非常接近，最大抗压能力达到了正常关节软骨的60%以上。　　本实验拟为软骨种子工程种子软骨细胞的优化获取提供一种有效的可行方法，并

7、探讨其分化能力及分化后的生物学性状。　　1材料与方法　　1.1材料II型胶原酶(Sigma公司)，胰蛋白酶(Hyclone公司)，标准胎牛血清(Gibco公司)，高糖DMEM培基(Gibco公司);青霉素及链霉素(新华制药公司)CO2恒温培养箱(HERACell);兔抗鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体(mAb)、PV两步法免疫组化试剂盒(购自北京中杉金桥生物有限公司)。　　1.2软骨细胞的采集选用新生3～5天的SD大鼠乳鼠1只，浸入75%的医用酒精中，5min×3次，处死并消毒;无菌条件下取大鼠肋软骨，用PBS(含青、链霉素各100U/mL

8、)冲洗2次，剔除软骨表面肌肉、骨膜及纤维组织，将软骨用眼科剪至1mm×1mm的碎块，加入3倍体积的0.25%的胰酶37℃消化半小时，中间吹打111次，弃掉胰酶后加入同胰酶相同体积的DMEM(含15%胎牛血清)终止消化，然后800r/min离心5min，弃上清加2