人类基因组DNA的提取与鉴定

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1、实验一人类基因组DNA的提取与鉴定实验目的1、学习人类基因纟RDNA的提取原理和方法。2、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。实验原理哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA,除特殊要求外，白血球、肝或脾组织是最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如川口腔上皮脱落细胞、发根细胞。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似,但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制DNase对DN

2、A的降解；（2）尽最减少对溶液屮DNA的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整；（3）将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。制备基因组DNA是进行呈因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kbo在DNA捉取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有10“bp,可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞屮提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法

3、获得的DNA不仅经酚切后可用于Southem分析，述可用于PCR的模板、文库构建等实验。一、材料一份提取总DNA的细胞或组织1.5mlEppendorf管、微量移液器打吸头、15ml离心管、三角瓶（500或1000ml）<>二、设备离心机、电子天平、恒温水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、微波炉或沸水浴、透射紫外灯。三、试剂1・细胞核裂解液（STE）：0」mol/LNaCl,10mmol/LTris-HCl,1mmoI/LEDTA2.0.8%（W/V）标准琼脂糖；3.0.5xTBE

4、缓冲液4.其他试剂：TE缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇（24:1,V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲液、漠化乙锭（EB）四、操作步骤（酚法抽提染色体DNA）(一)DNA的提取1.采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上濒、用牙刮颊部，囁咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清；重复1次。2.沉淀中加lmlIX细胞核裂解液(STE),混匀，再加350j.ilSTE和150gl10%SDS,摇匀，至出现粘稠透明状。加lOpil20mg/m1蛋白

5、酶K,摇匀。37°C温箱过夜或50°C3〜4小时。3.加等体积饱和酚，轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。4.小心移上清至另一离心管，加等体枳氯仿混匀5分钟，室温2000rpm离心5分钟。5.小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。6.将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醉，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNAo用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶

6、于20-100^1TE中，测OD值。7.TE溶解的DNA,在4°C下可保存一年，如耍求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置・70°C保存。(二)DNA的鉴定及定量1.比色法：DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋口质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1和当于大约50pg/ml双链DNAo如用lcm光径，用出0稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD?"值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA(mg/m

7、l)=50xOD260读数x稀释倍数/1000oDNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在oOD23o/OD260的比值应在0.4・0.5Z间，若比值较高说明冇残余的盐存在。用重蒸水将比色杯冲洗干净，用重蒸水或TE把提取的样吊稀释100倍。将紫外分光光度计的波长设为260nm,以重蒸水或TE做为对照，测定OD值。OD?60二；DNA的浓度二50ODm稀释倍数二o将波长换成280nm&230

8、nm,用同一样品再次测定OD值：OD280=；OD230=；OD260/OD28O=；OD260/OD230=；结论：所提取的DNA-1.电泳鉴定取样品1川、电泳缓冲液5卩1、6X加样缓冲液山1（含漠酚蓝和二甲苯青FF指示剂及甘汕），混匀，在0.8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳，用噬菌体XDNA作为标准。DNA区带应比较集中，泳动速度与XDNA相同或稍慢，证明分子量均＞50kb。一般见不到泳动速度比浣酚蓝快的RNA区带。如果DNA不成区带，而是散开分布在入DNA为漠酚蓝Z间,则说