人类基因组DNA提取

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1、人类基因组DNA提取、限制性核酸内切酶切割的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用药学第二讨论小组人类基因组DNA的提取提取方法:1·从全血中提取2·从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取(全血）原理：细胞裂解液：裂解细胞膜，收集细胞核SDS：破裂核膜蛋白酶K：使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来苯酚﹑氯仿：抽提去除蛋白质无水乙醇：沉淀DNA75%乙醇：洗涤DNA沉淀真空干燥后，溶解于TE中即得到高分量的DNA（全血）操作方法：细胞裂解与RNase/蛋白酶K消化1.取100μl抗凝全血置于1.5mlEppend

2、orf离心管中，再加入100μl裂解液和20μlRNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55℃温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。2.加入10μl3M的NaAc(pH4.8)，随后加入1250μl结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000rpm离心30秒。DNA与吸附柱结合3．用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12，000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。注意：待转移上清约1300μl，离心吸附柱容量约650μl，故需每次转移上清650μl到离心吸

3、附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。DNA的纯化:4.再加入600μl洗涤缓冲液（washingbuffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000rpm离心30秒。5．重复步骤4一次，12，000rpm离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。6．小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5mlEppendorf离心管，并加入50μl洗脱缓冲液(elutionbuffer)到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置1分钟，于12，000rpm离心30秒。7．取出Ep

4、pendorf离心管，其中便是所提取基因组NA。（口腔上皮脱落细胞）原理哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA,除特殊要求外，白细胞，肝或脾组织是最常用的的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞，有时为了简易，还可以无创伤的采集材料，如用口腔上皮脱落细胞，发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或绒毛膜细胞；（口腔上皮脱落细胞）操作方法：1、用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，

5、倒掉上清液；重复1次。2、沉淀中加1ml1×细胞核裂解液(STE)，打散细胞团、混匀，再加酶解混合液（含350μlSTE、150μl10%SDS和10μl20mg/ml蛋白酶K），摇匀，至出现粘稠透明状。37℃温箱过夜或50℃3~4小时。3、加等体积饱和酚（或1/3体积的饱和NaCl），轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。4、小心移上清至另一离心管（尽量避免吸取中间层），加等体积氯仿混匀5分钟，室温2000rpm离心5分钟。5、重复步骤4一次。6、将上清移入另一离心管中，沿离心

6、管壁向DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100μlTE中。7、TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。限制性核酸内切酶一、概念限制性核酸内切酶：能识别双链DNA分子内部的特异位点并裂解磷酸二酯键二、分类分类依据：酶的基因、蛋白质结构、依赖的辅助因子及与DNA结合和裂解的特异性特性I类II类III类内切酶的蛋白结构单一

7、多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶限制和修饰活性3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基所需辅助因子ATM,Mg2+,SAMMg2+ATM,Mg2+,SAM寄主特异性位点识别序列EcoB:TGA(N)8TGCTEcoK:AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG切割位点在距离识别位点至少1000pb处随机切开一条单链位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3‘端24-26pb处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特

8、异性位点寄主特异性位点识别为甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用作用不大三、作用机制以环状或线性的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核苷酸糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断开，产生具有3’-羟基和5‘-磷酸基的DNA片段。四、切割方法识别和切割位点4-6个碱