分子生物学讨论人类基因组DNA提取.ppt

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1、人类DNA基因组提取分子生物学第一次讨论蒋伯岳朱之苑崔增桢1人类基因组DNA提取的原理2哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除特殊要求外，白细胞、肝或脾组织是最常用的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或者绒毛膜细胞。人类基因组DNA提取的原理3●人类基因组DNA提取应考虑以下原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶

2、液中DNA的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整；（3）将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。DNA整体表现为酸性，带负电。是极性化合物，微溶于水，不溶于乙醇，苯酚，氯仿，乙醚等有机溶剂，形成沉淀。从而被分离提取出来。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀，从而被除去。4人类基因组DNA提取的原理人类基因组DNA提取的方法5●从全血中提取●从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中

3、提取●从胎儿的羊水细胞或者绒毛膜细胞中提取（常用于产前诊断）葡聚糖悬浮法分离抗凝全血中的白细胞:加2.5mL4%葡聚糖溶液于试管中，将5mL新鲜抗凝全血加于葡聚糖溶液之上，净置30min后，吸取黄色上清〔白细胞悬液)，离心得白细胞，洗涤。6酚醇法从全血中提取DNA在5mL15mmol/LTES溶液中悬浮白细胞，加蛋白酶K250一350微克，10%SDS260微升，充分混匀，置37℃过夜。7酚醇法从全血中提取DNA冷却至4℃加等体积Tris饱和酚，充分混匀，4℃3000r/min离心30min吸取上层溶液移至另

4、一离心管。加等体积Tris饱和酚，重复上一步Tris饱和酚抽提。8酚醇法从全血中提取DNA加等体积氯仿/异戊醇，充分混匀，4℃3000r/min离心5min，吸取上层溶液移至另一离心管。重复数次。吸取上层溶液至2.5倍体积冷无水乙醇中，轻摇至DNA析出。用75%冷乙醇清洗3一4次。加适量TE溶液溶解DNA。鉴定DNA。9酚醇法从全血中提取DNAEDTA：是一种血液抗凝剂，同时抑制核酸酶活性，防止DNA被水解。SDS：10%（W/V）十二烷基硫酸钠：是一种去污剂，能导致蛋白质变性，从而破坏蛋白质与DNA的结合，

5、使DNA释放出来。酚：是蛋白质的变性剂，并将变性的蛋白质溶解其中。而DNA则溶解于水相。氯仿：是蛋白质的变性剂，促进两相分离，并除去DNA溶液中的酚。10试剂作用蛋白酶K溶液：是一种很强的蛋白水解酶，在SDS中稳定。水解各种蛋白质（包括糖蛋白和肽类，和脂类，胺类物质）。同时由于RNA酶和DNA酶是蛋白质，也可被水解，从而防止DNA被水解。无水乙醇：使DNA析出75%乙醇：洗涤DNA沉淀11试剂作用用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。试剂盒的产生正是为了使实验人员能够摆脱繁重的试剂配制及优

6、化过程，所以试剂盒中一般配备有相应的使用说明书，用户按照说明书不需或只需少量的优化即可得到满意的结果。12试剂盒酚氯仿法：相对复杂，需要配置多种试剂，但提取量和纯度有保证，可一次抽取多量静脉血。试剂盒法：高效，快速，方便，提取DNA相对于酚氯仿法高，但一次抽取DNA量较少。13两种方法的比较限制性核酸内切酶切割原理、方法及结果分析1、定义：1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。限制性核酸内切酶的分类及特点类型限制性修

7、饰作用识别位点切割位点Ⅰ型有有特异识别位点下游100到1000bpⅡ型有无特异可知、固定Ⅲ型有有特异识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测。17规则：第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名第二、三个字母（小写）：该细胞的种名第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中不同限制性内切酶的编号例如：EcoRⅠ、HindⅢ等内切酶的命名限制性核酸内切酶切割原理1、Ⅰ类和Ⅲ类酶：在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上

8、切割DNA分子，然后从底物上解离。2、Ⅱ类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrome）的DNA片段；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。一般需要较纯的底物DNAMg2+Tris-HCl缓冲液，通常在37℃保温以酶解DNA。限制性核