DNA提取纯化.ppt

《DNA提取纯化.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、Chapter3DNA的提取与纯化基因工程需要三种不同的DNA:全细胞DNA(总DNA,totalcellDNA)质粒DNA噬菌体DNA学习内容：制备细胞总DNA培养、搜集细菌细胞制备细胞提取物DNA纯化、浓缩质粒DNA提取根据分子大小分离根据结构分离质粒扩增提取噬菌体DNA噬菌体的培养、收集、纯化纯化M13DNA1.制备总DNA基本步骤：1)培养、收集细菌细胞2)打碎细胞，释放内容物3)去掉DNA以外的成分4)DNA溶液的浓缩1.1培养、搜集细菌细胞两种类型的细菌培养基的成分：M9培养基(确定成分培养基)：g/LNa2HP

2、O4(6.0)KH2PO4(3.0)NaCl(0.5)NH4Cl(1.0)MgSO4(0.5)葡萄糖(2.0)CaCl2(0.015)LB培养基(不确定成分培养基)：g/Ltyptone(10)提供氨基酸以及肽段Yeastextract(5)提供氮源、糖类、有机和无机营养NaCl(10)1.1培养、收集细菌细胞37°C，150-250rpm培养10小时左右。达到最大浓度2-3×109cell/ml。600nm下的OD值，1OD相当于0.8×109cell/ml。Harvestingbacteriabycentrifugatio

3、n1.2制备细胞提取物利用溶菌酶、EDTA或两者结合。溶菌酶是存在于蛋清或眼泪、唾液等分泌物中，能消化细胞壁的多聚物。EDTA络合保持细胞结构完整的钙离子，也可以抑制DNA酶的活性。提取液中同时还加入SDS，使细胞膜破裂，协助细胞壁的溶解。Preparationofacellextract.Preparationofacellextract1.3DNA的纯化去掉DNA以外的成分蛋白酶K/苯酚——蛋白质RNA酶——RNARemovalofproteincontaminantsbyphenolextraction.◆Purific

4、ationofDNAfromacellextractDNA的浓缩最常用的浓缩方法是乙醇沉淀（同时含有Na离子的条件下）。DNA沉淀可用玻璃棒挑出，或者离心沉淀（杂质）。1.4DNA的浓缩以及浓度、纯度的测定1.4DNA的浓缩与浓度、纯度的测定DNA浓度的测定260nm下测定吸光度，1OD相当于50μg双链DNA/ml（40μg单链DNA或RNA/ml）。电泳检测核酸具有结合染料的能力溴化乙锭Ethidiumbromide,EtBr,EBEB与DNA结合的多少与DNA分子的大小及其分子的数目成正比，因此荧光强度的大小可所反映DN

5、A片段的大小及其数量。DNA浓度的测定琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖(Agarose)是从海藻中提取的一种线状多糖高聚体。琼脂糖凝胶电泳的制备和检查配制缓冲液等配制琼脂糖凝胶装备电泳装置核酸上样核酸迁移观察TAETBETPE琼脂糖凝胶电泳的制备和检查溴酚兰作用？琼脂糖凝胶电泳的制备和检查P102电泳检测1.4DNA的浓缩与浓度、纯度的测定DNA纯度的测定A260/A280=1.8，<1.8表示含有酚或蛋白质，>1.8说明有RNA。Theuseofananion-exchangechromatographyresininDNApuri

6、fication.DNA的纯化—离子交换层析法P1011.5植物总DNA的提取CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)去污剂，CTAB在低盐浓度下与核酸结合，在高盐浓度下又与核酸分离。适用于糖、脂含量较高的植物。SDS法(十二烷基磺酸钠)去污剂，使细胞膜破裂，协助细胞壁的溶解CTAB法提取植物DNA2质粒DNA提取根据质粒DNA的大小（质粒分子最大不超过大肠杆菌染色体的8%）根据DNA的构造◇碱裂解法Alkalinedenaturation◇EB—CsCl密度梯度离心法Ethidiumbromide-caesiumchlorided

7、ensitygradientcentrifugation2质粒DNA提取2.1根据分子大小提取质粒DNA在蔗糖存在时用EDTA和溶菌酶处理，可以破坏部分细胞壁，而保持细胞膜的完整；用非离子去垢剂如TritonX-100处理，诱导细胞裂解；离心分离，小分子质粒位于裂解液上清；而细菌大分子DNA则沉淀下来。2.1根据分子大小提取质粒DNA问题：裂解液中不可避免的包含一些染色体DNA。质粒分子非常大时，将与细胞残留物共沉淀。2.2根据分子构造提取碱裂解法在非常窄的pH范围内，非超螺旋化的DNA会变性，而超螺旋化的质粒DNA不变性。在

8、裂解液中加入氢氧化钠，调pH值至12.0~12.5，破坏氢键，使非超螺旋化的DNA变性。加入酸，变性的细菌DNA进一步聚集形成沉淀，通过离心的方法去除。同时利用SDS裂解，KAc中和可以去掉大部分的蛋白质和RNA。上清液中只剩下超螺旋化的质粒DNA了。Plasmidpurif