（乌云塔娜）中国梨S12-RNase基因启动子克隆及转基因研究

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1、中国梨S〔2・RNase基因启动子克隆及转基因研究乌云塔娜1,刘学英才1中南林业科技人学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；$湖南长沙410004湘潭人学化工学院生物技术研究所，湖南湘潭411105摘要利用TAIL-PCR成功扩增了长度为1448bp的中国砂梨品种'懋功£优RNase基因5,端上游序列；将其与梨S2・、S3->S4・、S5->03・、S2rRNase基因启动子序列对发现&RNase启动子TATA盒上游存在一约200bp的同源区域。为检测其表达特性，构建了一系列梨S12-RNase基

2、因启动子5’端缺失植物表达载体并转化哥伦比亚野生型拟南芥；GUS染色显示，仅有含S仔pro・(1〜5-GUS-pBII01.2的转基因植株雌蕊被染色，且其染色程度按照植物表达载体S/2-pro-(1->5)-GUS-pBII01.2顺疗;减弱；其他转基因植株及部位均未被染色，GUS染色结果表明S,2-FlNase基因启动子为雌蕊特异表达启动子，・1448〜-258bp区I'可存在为雌蕊特异表达元件。关键字梨S仔RNase基因，启动子，TALPCR,雌蕊特异表达，转基因研究我国是梨属植物种质资源起源中

3、心之一，境内蕴藏有丰富的梨属植物资源(滕元文等,2004)；研究表明，梨属配子体自交不亲和植物(gametophyticself-incompatibility,GSI),口花授粉结实率通常不到10.0%；梨口交不亲和性是由单基因位点(S基因位点)的复等位基因吕se基因)所控制(Satoetal.,1988),该基因座包含S-RNase基因和F・box基因，其中S-RNase基因在雌蕊中特异表达，控制雌蕊自交不亲和性状，据此推测梨S-RNase启动子是雌蕊特异表达启动子。为验证这一点，本文利用TAI

4、L-PCR扩增中国砂梨(P”uspyrifolia)品种'懋功gRNase基因5端上游序列，利用启动子功能分析软件对其进行分析，并进一步构建了一系列砂梨S仔RNase基因启动子5端缺失植物表达载体PS12-GUS-PBII01.2转化哥伦比亚野生型拟南芥，GUS染色分析该启动子功能元件，也为进一步特异性启动子的应用提供了理论基础。1材料和方法1.1植物材料中国砂梨(Pyruspyrifolia)品种'懋功'叶片，自中国农业科学院郑州果树研究所；拟南芥为Columbia(Col-O).根癌农杆菌(Ag

5、robacteriumtumefaciens)GV3101和和植物双元表达载体PBI101.2均受赠于湖南师范大学生科院植物发育与分子生物学实验室。人肠杆菌(Esherichiaco//)DH5a由本实验室保存。1.2主要试剂植物DNA提取试剂盒、2xTaqMasterMix、普通琼脂糖凝胶DNA冋收试剂盒均购自北京天根生物有限公司，PMD18-T试剂盒购自TaKaRa(大连)生物技术公司；各种限制性内切酶，T4DNA连接酶购自ferments公司，英它生化试剂和常规试剂均为超纯或分析纯。所有PCR

6、引物及测序均由金思特科技南京有限公司合成。1.3实验方法1.3.1梨基因组DNA的提取以梨幼嫩叶为材料，用植物DNA提取试剂盒提取。1.3.2梨S12-RNase基因启动子的TAIL-PCR克隆及验证根据己知梨&RNase基因编码序列5端边界保守序列设计3条特异性反向引物SPR1：5,-TATTTGTTCAAGAGCGAGGC-3,,SPR2：5,-CCGTGGACGAAGACAATATT-3,,SPR3：5,-GCCGGCTGATATTGCTGCGTAAATT-3,；用它们分别和1个具有低Tm值(

7、44〜46°C)的短的随机简并引物［简称AD引物，本文AD1〜AD6(LiuandWhittier,1995；Liuetal.,1995；Tsugekietal.,1996)相组合，以基因组DNA作为模板，3轮TAIL-PCR扩增特异片段。根据上述扩增所得到的梨S・RNase基因的宁侧翼序列测序结果并结合GeneDoc.VectorNTI软件分析结果，设计引物FP5：5r-TGTTCACCCCAAATGTAGAC-3,利用FP5和P2(乌云塔娜，2003)进行梨S-RNase基因的5侧翼序列PCR验

8、证。1.3.3梨S12-RNase基因启动子序列及元件分析PLACE(Higoetal.,1999)和PlantCARE(Lescotetal.,2002)等网上数据库对S^-RN日se基因启动子的顺式作用元件预测分析oVectorNTI10.3分析软件进行序列比对，利用Clustalx(Thompsonetal.,1997),MEGA4(Tamuraetal.,2007),Phylip(Joseph,2004),Treeview(Page,1996)等构建进化树。1