酶工程 第三章 酶的分离纯化

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1、第三章酶的分离纯化3.1酶分离纯化的技术路线3.2细胞破碎3.3酶的分离方法3.4酶的浓缩、干燥与结晶3.5酶制剂的保存3.1酶分离纯化的技术路线细胞破碎酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心，过滤，沉淀，层析，电泳，萃取，结晶等。粗蛋白质(crudeprotein):采样→均质打破细胞→抽出全蛋白，多用盐析沉淀法；粗略去除蛋白质以外的物质。(2)部分纯化(partiallypurified):初步的纯化，使用柱层析法。(3)均质酶(homogeneous):目标酶进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPLC。酶分离纯化三个阶段3.2细胞破碎1）机械破

2、碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。细胞破碎方法及其原理JJ-2组织捣碎匀浆机WSK卧式高效全能珠磨机破碎过程产生大量的热能，在设计操作时应考虑换热能力问题。(1)研磨法适用于绝大多数微生物细胞原理：珠磨机的破碎室内填充玻璃或氧化锆微球。在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。(2)捣碎法动、植物材料高速捣碎器操作简便，破碎效果好，但易引起局部温

3、度过高，必须考虑酶的特点谨慎使用。(3)匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，在撞击力和剪切力等的综合作用下破碎。物理破碎渗透压法冻融法超声波法通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏。超声波破碎仪(1)渗透压法最温和的细胞破碎法适于易于破碎的细胞，如动物细胞和G-菌。将细胞置于高渗透压的介质中，达到平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中。在渗透压的作用下，水渗透通过细胞壁和膜进入细胞，使细胞壁和膜膨胀破裂。(2)冻融法

4、将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化(反复多次操作)(3)超声波破碎法原理：在超声波作用下液体发生空穴作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，从而使细胞破碎。很强烈，适用于多数微生物的破碎。有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween化学破碎有机溶剂表面活性剂各种化学试剂对细胞膜的作用使细胞破碎条件温和、具有选择性。缺点：酶的价格昂贵自溶法：不好理由：①自溶液中成份十分复杂；②有破坏待分离酶的危险。酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏3.3酶的分离方法3.3.1沉淀分离3.3.2

5、离心分离3.3.3过滤与膜分离3.3.4层析分离3.3.5电泳分离3.3.6萃取分离3.3.1沉淀分离通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶选择性变性沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来复合沉淀法（共沉淀）利用酶与杂质在有机溶剂中的溶解度不同有机溶剂沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，不同的两性电解质有不同的等电点等电点沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同盐析沉淀法分离原理沉淀分离方法在一定的温度和pH值条件下（β为常数

6、），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析；在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析。原因：盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反离子作用改变了杂蛋白和酶分子表面的电荷，同时离子的存在改变了溶液中水的活度，使分子表面的水化膜改变。最常用的中性盐：硫酸铵。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。盐析沉淀法盐溶？盐析？原因：有机溶剂使溶液的介电常数降低，使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，使其溶解度降低而沉淀。

7、常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等有机溶剂沉淀法3.3.2离心分离离心分离：借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术。根据欲分离物质及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。常速离心机(低速离心机):最大转速＜8000r/min，相对离心力（RCF）＜1×104g，用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机:最大转速为（1～2.5）×104r/min，相对离心力1×104～1×105g，用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。高速冷冻离心机：高速离心机装设有冷冻

8、装置。超速