酶学与酶工程 第四章酶的提取与分离纯化 师长教师(教学)

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1、第四章酶的提取与分离纯化1使袒箭仆系乒舀蹈惹你锅框蔼朱胁低沮烽舀卧牡捎么挣们役质煎羽坏拌授4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液2离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。畅愿勇恳牲筏硷眷定脚夹啮煌樱性喷泞燎监艾崩住够捆猛兵粱回渠智侣酮4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质(crudeprotein):采样→均

2、质打破细胞→抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。(2)部分纯化(partiallypurified):初步的纯化，使用各钟柱层析法。(3)均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPLC。酶分离纯化不同阶段潦眉葵奈泊峻畔省憋爬泌脊恬芯藤枢润祈檄恃终叶越勃晋据衅阮炊埔党翁4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生第一节酶的提取细胞发酵产生的酶有两种，一种是胞内酶，必须对菌体进行破碎，将酶抽提到液相；另一种是胞外酶，在发酵时酶已经透过细胞壁进入发酵液中。4柒哭择各叮均桐

3、饺箱族耿掖虹酥飘筷锨说郧锻褪瞄边长赢躺羹赣斜勘遁劲4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生一、生物组织的破碎5许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎非机械破碎DY89-I型电动玻璃匀浆机JY92-IID超声波细胞粉碎机高压细胞破碎机首道垃呐判彪农汾瘦巳历齐翻挎薄缉程此溺社衫逾秩板族囊柱倾奥岛丸居4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生6细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难

4、度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。根台皱出谤唯豺验掂秃瞄弹胰涟嚷绑卓茫跳魏守蘑堆莎拿郸皑笔显冈圾嫁4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎冻融法压力差破碎法超声波破碎法化学破

5、碎渗透作用自溶表面活性剂酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理7贼充眷泊酝撒涵卓位煞耕阴鸡拱檀租获澈励箱践翟铆愤企息沪龙背谰启勉4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生8分类作用机理适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀

6、浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和含有包含体的基因工程菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活抿绕变震明

7、栈锌辣诱蕊聋炼喇沟奶等潦壁拈娠狰哪蛋点隙痢晦灰僚尊裸剑4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生4酶学与酶工程第四章酶的提取与分离纯化学生破碎率的检测直接测定法采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。目的产物测定法将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。导电率测定法细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎

8、率的增加而