酶工程3酶的分离纯化

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1、第三章酶的分离纯化酶分离纯化的目的酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需的纯度。分离纯化过程包括3个基本步骤：1抽提2纯化3制剂Crudeproductconcentrationversussellingprice(Dwyer,1984)某些生化物质在原料液中的浓度与价格的关系(1984年)物质名浓度(C)价格(P，＄)尿激酶510－53108荧光素酶810－32106胰岛素410－19104头孢菌素10102乙醇1102310－1在分离纯化中必须注意：1防止酶的变性失活；2在分离纯化过程中的每一步都应检测酶的活性，以

2、确定酶的纯化程度和回收率。第一节酶活力的测定几个名词1酶活力或酶活性2酶活力单位3mol催化活性（分子活性）和转换数（催化中心活力)4酶的比活力酶活力（又称酶活性）(enzymeactivity)（IU/g或IU/mL)指酶催化一定化学反应的能力；用在一定条件下，所催化的反应初速度来表示；是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。酶活力单位(enzymeactivityunit)表示酶活力大小的尺度；一个国际单位（IU）是指在特定条件下（250C），每分钟内转化1mol底物或催化形成1mol产物所需的酶量一

3、个Kat是指每秒钟内转化1mol底物所需的酶量，1Kat=6107IU。mol催化活性（分子活性）和转换数（催化中心活力）mol催化活性是指单位时间内，每个酶分子所转换的底物分子数目；转换数（Kcat)是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分子数目。如果酶分子中只有一个活性中心，那么mol催化活性与转换数相等，如果酶分子中含有n个活性中心，那么转换数则为mol催化活性除以n。酶的比活力（specificactivity)酶的比活力是酶纯度的量度，是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单位为IU/mg。比活力越大，酶纯度越高。酶活力的测定方法：

4、１终止反应法２和连续反应法。终止反应法在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。连续反应法无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。酶不可逆失活的原因和机理蛋白质（酶）的失活机理蛋白质不可逆失活的原因蛋白酶水解或自溶作用表面活性剂和去垢剂聚合作用氧化作用机械力变性剂重

5、金属离子和巯基试剂冷冻和脱水热极端pH蛋白质不可逆失活脲和胍高浓度盐螯合有机溶剂辐射作用蛋白质的稳定化蛋白质稳定化蛋白质稳定化途径如何防止蛋白质的可逆伸展如何防止蛋白质不可逆失活反应发生稳定蛋白质（酶）的方法酶分离的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性第二节酶溶液的制备酶溶液的制备：把酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液酶溶液的制备包括：

6、材料预处理及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽体液的浓缩等几个步骤。一、材料预处理及细胞破碎材料预处理：酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶酶和晶酶）。微生物胞外酶可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥胞内酶要先收集菌体，经细胞破碎后提取动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织等植物材料应去皮等以免单宁等物质着色污染细胞破碎：物理和化学两大类方法1、物理破碎：—研磨（手磨，球磨和石磨），—机械捣碎（匀浆器和高速组织捣碎器等），—高压法，—爆破性减压法，—专用波振荡，—快速冷冻融化法等。2、化学破碎：—渗透作用—自溶：—酶处理—表面

7、活性剂（I）渗透作用将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖和EDTA的稀Tris缓冲液中，离心，加入MgCl2剧烈搅拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来。（II）自溶向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透性改变保持一定时间后可以使细胞自溶；（III）酶处理用溶菌酶专一性地分解原核微生物细胞壁，使胞内酶释放（IV）表面活性剂膜结合的晶酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表面活性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。二、抽提—大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；—抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的

8、溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。1、提取的主要方法：（1）盐溶液提取（2）酸溶液提取（3）碱溶液提取（4）有机溶剂提取2、酶提取过程的注意