RNA干扰技术在育种方面的应用

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1、RNA干扰技术在育种方面的应用魏强'王莉彳崔林虎？(通化市种子管理站,吉林通化134000)摘要：RNA干扰(RNAi,RNAinference)即双链微小RNA片段能使英同源的mRNA发生特异性降解，从而实现基因转录后沉默的手段⑴，这种模式广泛存在于动物、植物和真菌中。这种新兴的RNA干扰技术是分了水平的转基因育种重要手段Z—,冇着育种年限短，定向改良品种等多项优势。本文概述了RNAi的研究历史，对RNA介导的转基因沉默的机制、特点和实施方法等进行了概括，并对其在农业方面的应用进行了阐述。关键词：RNAi；转基因育种；基因沉默面临着日益增长的人口，耕

2、地而积不断减少的今天，粮食问题成为解决生计的重要课题z—,不断地培育出优良的晶种是解决粮食问题的重要手段之一。然而传统育种有着育种周期长、种质资源有限，占用过多的人力、物力等弊端，而转基因育种是当前最为快捷的育种方式，育种周期短、特异性强。RNAi技术在过去的10年中得到广泛的研究，是当今最热门的研究项1=1之一，RNAi技术的出现给转基因育种提供了新的手段和方法，能够特异性的繁育品种，在转录后水平上特异性地控制某个性状表达，从阳起到改R品种的作用。RNAi技术已在马铃薯、水稻、小麦等作物中得到成功应用。1RNAi技术的研究发现20壯纪90年代初，N.

3、Romano等⑵通过增加基因拷贝数来增强矮牵牛花紫色色素的表达，不仅没有达到预期开紫花的效果，反而部分或全部开白颜色花，由此推断其色索合成的机制被干扰或者关闭，他们将这一机制定义为共抑制。C.Cogoni等⑶1994年发现外源类胡萝卜素基因导入链他霉中，其内源的类胡萝卜索表达虽下降，他们将这种现象叫消除作用。1995年S.Guo等⑷在利用反义干扰技术探究线虫的基因功能吋，发现无论是正义片段还是反义片段均能阻碍靶向Par-1因的表达。1998年A.Fire等问发现正义片段能起到干扰作用是因为混入了反义片段，并首次将靶向Par_j基因正、反义片段同时转入线

4、虫卵中，发现具干扰抑制作用比单独反义片段强100倍，并由此提出RNAi的概念，从此掀起RNAi技术研究热潮。随着不断的探索，在果蝇、拟南芥、小鼠等均存在这种干扰抑制现象，并且普遍在动物、植物和真菌中均有体现。随着RNAi技术的不断研究，人们开始逐渐意识到RNAi技术在功能基因组的开发研究、药物研发、动植物育种等方而的研究上有着尤为重要的意义。2RNAi的作用机制这些年来，对RNAi的干扰机制有很多研究，最有说服力的研究是基因转录后沉默效应。在多种酶的共同参与下，转录后的信使RNA(mRNA)被特异性地切成小片段，从而达到转录后慕因沉默的效果。2.1启动

5、阶段起始过程是进入细胞的dsRNA(double-strandedRNA)被Dicer酶识别并特异性地切割成21〜25个核廿酸片段(nt)的siRNA(smallinterferingRNA)。后者与其结合的靶向mRNA的序列具有同源性，siRNA的2个单链为21〜23M的小片断，其中位于最后的亍末端为磷酸基，3,末端为疑基并带有2个突出的核甘酸。此结构说切siRNA是通过RNaselll剪切长dsRNA所产牛:，且貝有RNaseTII剪切反应的所有特征。2・2效应阶段细胞屮含河一种由解旋酶、核酸内切酶、外切酶等构成的蛋白复合物，是效应阶段的主要参与物

6、质，siRNA在解旋酶的作用下将双链打开，并形成单独的止义片段和反义片段，其中反义片段与蛋白复合物相结合，Bernstein⑹等人将此复合物命名为RNA诱导的沉默复合物(RISC,RNAinducedsilencingcomplex)□活化后的RISC能够特异性识别mRNA,通过碱基互补呢对与其结介，而后在核酸内切酶的作用下特异性地将mRNA切割成12〜23nt的小片段，达到转录后抑制靶基因表达。2・3扩增阶段21壯纪初，Lipardi[71等人对果蝇胚胎进行提取，研究发现siRNA不仅可以抑制靶基因表达，还可以作为引物，以mRNA为模板，由RNA聚合

7、酶(RdRP,RNAdependentRNApolymerase)进行催化，产生更多的dsRNA,而这些dsRNA能被完全切成siRNA,完成一次扩增循环，通过这样的扩增机制能使得RNAi效应逐渐被放大，因此只要少量的dsRNA就能完成RNAi作用。3RNAi的作用特点3・1高特异性研究发现siRNA进行识别序列时只有正义链3端的2个碱基不起主耍作用，位于siRNA序列中的其他碱基只要有lnt的碱基发牛•突变，其对基因的抑制作用就会消失，因此RNAi可以靶向定位mRNA使其相应基因表达沉默，对于非特异性慕因不发生反应。3・2高效性注入细胞内的少最dsR

8、NA会通过扩增阶段获得大最的dsRNA,由此产生更强的作用机制。3・3RNAi的选择性外源性d