兔抗人CD1d分子α3结构域抗体制备及鉴定

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1、兔抗人CD1d分子a3结构域抗体制备及鉴作者：陈章权，黄震，梁晓东，何天文，陆田田【摘要】目的：制备兔抗人CD1d分子a3结构域(hCD1da3)多克隆抗体。方法：PCR法扩增出人hCD1da3编码区基因，将其克隆入原核表达载体pET28中，转化大肠杆BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达，用Ni2+NTAAgarose亲和层析法纯化重组蛋白，以之为免疫原免疫家兔，制备多克隆抗体，并用ELISA、Westernblot及免疫组织化学法检测抗体。结果：成功构建ThCDIda3原核表达载体p

2、ET28/hCD1da3,高效表达并纯化hCD1da3蛋白，间接ELISA检测所制备抗体的效价为1:6400,Westernblot显示该抗体能与hCD1d特异结合，免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人小肠组织中的天然hCDIdo结论：通过制备重组hCD1da3蛋白为免疫原，免疫家兔，成功地制备了效价高、特异性好的抗hCD1dc(3多克隆抗体。【关键词】CD1da3结构域表达抗体制备[Abstract]AIM:Topreparetherabbitantibodyagainstthea3domai

3、nofthehumanCD1d(hCD1da3),METHODS:ThegenefragmentcodingforhCD1da3wasamplifiedbyPCRandclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET28,thenexpressedinE.coliBL21(DE3).TherecombinantproteinhCD1da3waspurifiedwithNi2+NTAagarosecolumnandusedasimmunogentoimmunizeth

4、erabbit.ThetiterandspecificityoftheantihCD1da3antibodyfromtherabbitwereanalyzedbyELISA,Westernblotandimmunohistochemistry,respective!y.RESULTS:TherecombinanthCD1da3wassuccessfullyexpressedandpurified,andthepolyclonalanithCD1da3antibodywassuccessfullyp

5、repared.Thetiteroftheantiserumwas1:6400byELISA.WesternblotanalysisshowedthisantibodayreactedspecificallywithhCD1d.ImmunohistochemistryanalysisshowedtheantibodycouldrecognizethenativehCD1dinthehumanintestinaltissue.CONCLUSION:TheantiCD1da3antibodyfromt

6、herabbitwithhightiterandspecificityhasbeenpreparedwithpurifiedrecombinanthCD1da3asimmunogen,whichlaysafoundationforfurtherresearchintodetectionandfunctionalstudyofCD1d.[Keywords]CD1d;a3domain;expression;antibody;preparationCD1分子独立于MHC分子之外的一类特殊的抗原提呈分子。

7、CD1d是其CD1家簇5个成员中的重要一员，它提呈的抗原主要为脂质分子，供NKT细胞识别［1］,在免疫调节、NKT细胞的发育及与感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤疾病的发生发展过程中起重要作用［2-4］oCD1d分子由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其胞外区含3个结构域：从氨基端开始依次为cd、a2和a3结构域［5］。Kojo等⑹发现CD1d分子存在a3结构域缺失的变异体，但尚未见进一步的生物学功能研究报道。我们在研究中也发现，在一些肿瘤患者体内存在类似的CD1d变异体，这些突变的CD1d分子存在的生物

8、学意义尚不清楚，有待研究。抗体是研究免疫分子的重要工具，目前市场上尚未见有商品化的针对CD1d的a3结构域（CD1da3）特异性抗体，也未见有该抗体制备的研究报道。为此，我们用通过PCR扩增获取了CD1da3编码区基因，表达其重组蛋白，制备其特异性抗体，同时分析了其应用的可能性。1材料和方法1.1材料大肠杆DH5c（、大肠杆菌BL21QE3）为本室保存。雄性新西兰大白兔由广东医学院实验动物中心提供。克隆载体pGEMT、反转录试剂盒为Promega公司产品。RNA提取试剂、表达载体p