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1、YUNNANNORMALUNIVERSITY发酵工程学实验组号：7-8节第七小组学号：124120434学院：生命科学学院专业、班级：12生物技术实验课程名称指导教师及职称唐湘华开课学期2014至2015学年下学期云南师范大学教务处编印实验名称：(-)特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究实验时间笫十三周实验室睿智3-121小组合组是小组成员高胜全李朝和刘云谣罗光洪张志豪实验目的：1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、了解酶学性质的研究.二、实验原理：1、理论依据(1)、果胶酶概况(2)、果胶酶的酶活测定方法(3)
2、、微生物发酵生产特定产物受培养基成分、培养条件和附加条件等的制约(4)、酶催化反应的进行受多种因素的影响2、果胶酶概况果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。3、果胶酶的酶活测定方法粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定
3、反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。还原糖法（DNS法）：测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。DNS法：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3,5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540册进行测定。4、微生物发酵生产产品受以下条件制约：培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子培养条件：温度、pH、溶
4、解氧等附加条件：诱导物、表面活性剂等5、酶催化反应的进行受多种因素的影响底物浓度酶浓度温度pH激活剂抑制剂三、实验材料（一）试剂1、酶活测定用试剂和DNS2、新鲜果汁（二）仪器烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等；天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。（三）培养基种筛选使用2、定曲霉Asp-2固体发酵用1、菌种筛选使用培养基基本培养基:果胶1%，磷酸氢二钠0.5%,蛋白月东1%,pH4.5,琼脂2.0%0⑵分离培养基果胶0.5%,磷酸氢二钠0.5%,琼脂2.0%,p!14.5
5、（3）发酵培养基果胶1%,磷酸氢二钠0.5%,蛋白月东1%,pH4.5o2、黑曲霉Asp-2固体发酵培养基种斜面培养基（查氏培养基）NaN030.2%K2HP040.1%KC10.05%MgS040.05%FeS040.001%蔗糖3%琼脂2.5%自然pH种子培养基荻皮3.0%,橘子粉2.0%,硫酸鞍0.5%,葡萄糖1%,KH2P040.1%pH4.5固体发酵培养基：5瓶/组就皮10g,橘子粉2.5g,（NH4）S040.lg（0.8%干料计）葡萄糖0.125g（1%干料计），水15ml要求：按组统一配制后分装三角瓶先将（NH4）S04、葡萄糖用水溶
6、解，再加其它。四、实验方法、步骤及注意事项:（一）固体发酵果胶酶Jiff1、菌种准备菌种活化：试管保存菌种f斜面活化f30°C培养约60h液体培养：将菌种接种入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶内，30°C,200rpm,培养约40h,备用。2、氮源的选择和选择的氮源添加量对产酶的影响（第一组）选择硫酸鞍、蛋白月东、牛肉膏按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白月东，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。在发酵培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%（按干料计）浓度的已选择的氮源，保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（约
7、5%,即1.5ml）相同培养条件下（30°C,60h）发酵，测定酶活。3、碳源的选择和选择的碳源添加量对产酶的影响（第二组）选择果胶、葡萄糖、橘子粉按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白月东，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。在液体发酵培养基中分别添加0、0・5%、1.0.2%、3.%的选择的碳源，保持培养基的其它成分不变，在相同条件下接种液体种子（约5%,即1.5ml）,相同培养条件下，30°C,发酵60h，测定酶活。4、培养基含水量对产酶的影响（第三组）在发酵培养基中加入蒸憾水，使培养基中的含水量分别约为50%、55%、60%、65%和70%
8、；保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（5%,即1.5ml）相同培养条件下（30°C,48〜60h）发酵，
