大量Pichiapastoris酵母基因组DNA的提取

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1、生物技术通报·研究报告·BIOTECHNOLOGYBULLETIN2011年第4期大量Pichiapastoris酵母基因组DNA的提取刘晓志高健韩柱王志明陈伟斌(华北制药集团新药研究开发有限责任公司抗体药物研制国家重点实验室，石家庄050015)摘要:巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统是目前应用最广泛的外源基因表达系统之一，提取酵母基因组是研究酵母必需的方法之一。针对常用的几种毕赤酵母基因组DNA的制备方法进行比较，并对玻璃珠法进行改进。改良的玻璃珠法不但具有省时省力、操作简便且结果稳定的优点，适合于

2、大量DNA的提取。该方法的革新将对酵母重组子的PCR鉴定检测及表达产品DNA相关检测提供更高效稳定的保证，将成为酵母等类似微生物基因组DNA制备的首选方法。关键词:Pichiapastoris酵母基因组蜗牛酶法玻璃珠法改良玻璃珠法DNAExtractionforLargeGenomeofPichiapastorisLiuXiaozhiGaoJianHanZhuWangZhimingChenWeibin(NewDrugResearchandDevelopmentCo．，Ltd．ofNorthChinaPharmaceutic

3、alCorporation，StateKeyLaboratoryofAntibodyDrugDevelopment，Shijiazhuang050015)Abstract:Pichiapastorisexpressionsystemthathasbeenwidelyusedforexpressingforeignprotein．Therefore，hasdrawngrowingattentiontodevelopmethodsforextractingyeastgenome．Inthispaper，severalkinds

4、ofyeastgenomicDNApreparationmethodswerecom-pared，andtheglassbeadmethodwasimproved，whichnotonlysavestimebutalsocanbeoperatedeasilywithsatisfactoryresultsoflargenumberofDNAextraction．ThisapproachcouldbeusedasthegenomeDNApreparationmethodforyeastandothermicrobial．Key

5、words:PichiapastorisGenomeDNASnailenzymemethodGlassbeadmethodImprovedglassbeadmethod巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的用于酶切消化，这就对酵母基因组DNA的提取外源基因表达系统之一。近年来已有600多种外源技术提出了挑战。［1］蛋白在该表达系统中获得表达。毕赤酵母表达毕赤酵母拥有较厚实的细胞壁，因此对于基因系统中外源目的基因能够稳定表达，必须整合到酵组DNA提取的主要问题就集中在如何高效破坏细母染色体中。为了确保能够正确表达，首先要确

6、认胞壁。毕赤酵母的细胞壁厚约25nm，约占细胞干外源基因是否正确插入，必须对酵母重组子染色质量的30%，并且具有坚韧的结构。它的结构分3体DNA进行鉴定和筛选，提取高质量的酵母基层，外层是甘露聚搪，内层为葡聚糖，均是具有复杂［2］因组DNA。酵母基因组DNA制备比大肠杆菌结构的分枝状聚合物，中间层含有丰富的蛋白质。难度大，原因是由于酵母细胞壁难于破坏，酵母传统破坏细胞壁的做法大致可以分为两类:酶法和［3－5］基因组DNA不能很好地释放出来。制备的机械法。酶法包括使用Zymolyase、蜗牛酶和蛋白酶酵母基因组DNA作为模板

7、进行PCR等常规方法K等;机械法包括超声波破碎法、液氮研磨法和玻璃时，如果基因组DNA的质量要求不高，很可能出珠法等，各种方法都存在一定的缺点。现假阳性或假阴性的现象，极大地影响了鉴定可本研究将两种方法结合，旨在使得毕赤酵母基靠性及和筛选进度。另外，在进行Southern杂交因组DNA的提取变得快速、简便，提取的DNA质量等试验时需要至少10μg高质量的基因组DNA及稳定性也较其他方法具有明显优势。本试验利用收稿日期:2010-10-15基金项目:国家“十一五”重大新药创制项目(2009ZX09102)作者简介:刘晓志，男

8、，博士，研究方向:生物药物的质量研究及质量控制;E-mail:liuxiaozhi666@163．com168生物技术通报BiotechnologyBulletin2011年第4期试剂盒、蜗牛法酶法、玻璃珠法和改良玻璃珠法提取清加入1/10体积的3mmol/L醋酸钠溶液，再加两酵母基因组DNA，每种方法