弓形虫LDH2基因启动子的克隆及初步鉴定

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1、山东大学博士学位论文弓形虫LDH2基因启动子的克隆及初步鉴定专业病原生物学博士研究生张加勤博士生导师古钦民中文摘要刚地弓形虫(Toxoplasmagondii，Zgondii)是一种机会性致病原虫，能够感染包括人在内的所有哺乳动物，引起人兽共患寄生虫病。在机体免疫功能受累时，慢性感染或隐性感染阶段的弓形虫缓殖子迅速活化，可引起致命的危险，是弓形虫病防治的重点所在。但是弓形虫缓殖子寄生在宿主细胞内，常规抗生素治疗效果不理想，至今仍未找到治疗弓形虫慢性感染的有效措施。研究表明，无论是在有氧条件下分裂增殖的速殖子，还是无氧条件下处于相对静止的缓殖子，其能量几

2、乎全部来源于糖类代谢。乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，LDH)是糖类无氧酵解中催化丙酮酸和乳酸互相转换的酶，和辅酶NAD+的循环再利用密切相关，在无氧条件下弓形虫能量代谢中具有举足轻重的地位。研究发现弓形虫LDH的结构、理化特性、免疫学特性及酶促动力学等方面和人类LDH存在很大的差异。所以，LDH能够成为杀灭弓形虫药物的潜在作用靶点。同时对LDH转化的相关研究还有助于对弓形虫速殖子向缓殖子转换机制的理解。LDH2是刚地弓形虫RH株表达的两种乳酸脱氢酶同工酶中的一种，其mRNA仅在弓形虫缓殖子中检测到，其表达产物也只出现在缓殖子中；

3、而LDHl的mRNA在速殖子和缓殖子中均有发现，但其表达产物只出现在速殖子中。序列分析表明两者核苷酸序列有64％一致，在蛋白水平二者约有71％的同源性，但在理化、免疫学特性和酶学方面等却有很大的差异。由此可以推测，在刚地弓形虫RH株中LDH两种同工酶之间的转换是一个阶段性的转变过程，LDHl被LDH2替代可能发生在速殖子向缓殖子转化的过程中。其具体的调节机制是发生在转录阶段还是转录后阶段，及其中的确切机制尚有待于实验进一步阐明。山东大学博士学位论文鉴于缓殖子阶段是弓形虫致病的重要阶段，且危害性大，而LDH是弓形虫缓殖子能量唯一来源——糖类无氧代谢的终末

4、催化酶，因此，LDH的种类及活性与弓形虫缓殖子的生存和致病能力密切相关，对LDH2基因的研究显得尤为重要。为此，本课题进行了以下几方面的研究：第一部分弓形虫LDH2基因5'-俱U翼序列的克隆研究目的：获取刚地弓形虫LDH2基因的5’．侧翼序列，为研究该基因的表达调控机制奠定基础。研究方法和结果：根据公用数据库的序列信息和文献资料设计合成引物，运用ThermalAsymmetricInterlacedPCR(TAIL．PCR)扩增刚地弓形虫LDH2基因的57．侧翼序列，并TA克隆至lJpMDl8-T载体中进行测序，得到一大小为993bp的弓形虫LDH2基

5、因的57．侧翼序列DNA片段。结论：成功克隆了刚地弓形虫LDH2基因的5’．侧翼序列并测序，为研究该基因的表达调控机制奠定了试验基础。第二部分弓形虫LDH2基因S'-倾U翼序列生物信息学分析研究目的：对生物信息学在弓形虫LDH2基因转录调控研究中的应用进行初步的摸索与探讨。研究方法和结果：我们从多角度对LDH2基因5’．侧翼序列及编码区域进行生物信息学分析，总结前人对LDH2基因已有的研究成果，预测基因转录起始位点以及启动子的所在区域。在综合分析各方面的结果后，得出相关结论，并以此为依据，指导后续实验的进行。取得如下结果：1．MethPrimer对Cp

6、G岛的预测结果并不唯一。在LDH2基因全序列中，MethPrimer搜索到11个潜在的CpG岛位点，其中5个CpG岛位于起始密码子上游，表B)jLDH2基因编码序列的确与CpG岛相连。2．Promoterscan预测LDH2基因的候选启动子在输入序列的第320bp--一509bp处(LDH2基因的．540bp~．351bp)，其得分是53．25，预设阈值为50．00。3．McPromoter预测在输入序列的第lOObp和第600bp附近的序列有较高的得分，分别在O．02和0．03，但相对于预设阈值而言得分不是很高。而第600bp山东大学博士学位论文处的

7、候选启动子与NNPP和Promoterscan的预测结果均有部分区域相重合。4．Promoter2．0分析结果为，在输入序列的第900bp处很有可能存在具有启动活性的序列，但是没有给出转录起始位点。5．NNPP得出唯一的分析结果，在输入序列的第326bp一--376bp之间存在有启动子活性的序列，候选启动子的得分为0．98，远大于预设阈值O．80。该工具得出的候选启动子区域与Promoterscan分析得出的结果有部分区域重合，而NNPP的优势在于其所提供的启动子预测区间较短。其余的工具均未预测到具有启动活性的序列或可能存在的转录起始位点。结论：各种生

8、物信息学分析工具对LDH2基因候选启动子区域的预测结果并不完全相同。综合所有的分析结果，我们成