usp22基因启动子的克隆与鉴定

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1、南昌大学硕士学位论文USP22基因启动子的克隆与鉴定姓名：周英妹申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：郑美蓉201206摘要摘要目的：对泛素水解酶22(Ubiquitin．specificprocessingenzyme22，USP22)基因转录起始位点上游启动子区域进行克隆与鉴定，界定出USP22基因核心启动子的范围，为USP22基因表达调控的深入研究奠定基础。方法：运用eDNA5味端快速扩增(5'RACE)方法对USP22基因转录起始位点的确定。以人基因组为模板，利用巢氏PCR方法对USP22基因5’端侧翼区包括转录起始点在内进行扩

2、增，PCR产物两端分别引入KpnI和BgllI酶切位点。凝胶回收扩增产物，TA克隆，DNA测序鉴定扩增片段正确无误。将PCR扩增产物定向克隆入荧光素酶表达载体PGL一3Basic，构建含USP22启动子序列和荧光素酶报告基因的重组质粒。脂质体介导以上重组质粒与内参质粒PRL—TK共同转染HepG2细胞和HeLa细胞，运用荧光素酶报告基因分析法，检测不同片段启动子转录活性，同时设立阴性对照组(PGL．3Basic)。对所得数据进行统计分析，鉴定出USP22核心启动子区域。结果：鉴定USP22只有一个转录起始点，位于翻译起始点ATG上游一176bp。克隆

3、出8个USP22启动子片段，酶切及测序结果证实USP22启动子系列递减片段插入到荧光素酶报告基因载体PGL．3Basic中，构建USP22promoter／PGL·3Basic真核表达载体。重组质粒瞬时转染入HepG2细胞和HeLa细胞后，荧光素酶检测结果表明USP22promoter在肿瘤细胞中具有很强的转录活性，调控USP22基因表达的核心启动子片段推测是一210～．7区域，且在．595""．326之间可能有增强子，在．866．595之间可能有抑制子。结论：确定USP22基因转录起始位点(Transcriptionstartingsites，TS

4、S)，克隆和鉴定USP22基因的核心启动子，为进一步研究对USP22转录调控起关键作用的DNA元件的深入研究奠定基础。关键词：USP22基因；启动子；报告基因AbstractABSTRACTObjective：ToidentifytranscriptionstartingsitesofUSP22(Ubiquitin-specificprocessingenzyme22)geneupstreaminthepromoterregionclone，anddefinethescopeofthecorepromotersofUSP22genes，whichpr

5、ovideafoundationforfurtherstudytranscriptionmechanismsofUSP22gene．Methods：IdentifiedtheUSP22transcriptionstartingsites(TSS)using5’rapidamplificationofeDNAends(5’RACE)analysis．The5’UTRofUSP22genecontainingTSSwereamplifiedbynest’Spolymerasechainreaction(PCR)．TheKpnIandBglIIrestri

6、ctionenzymecuttingsitewereaddedthe5’PCRprimers，respectively．ThePCRproductionwaspurifiedbygelelectrophoresisandinsertedintoPMD-18Tvector．ThepositivevectorswereselectedforDNAsequencing．TheColTectDNAfragmentswerecuredfromTvectorandinsertedintoluciferasereportvectorPGL-3Basic．Recom

7、binantplasmidcontainedtheUSP22promotersequenceand1uciferasereportgene．TherecombinantplasmidsandreferenceplasmidPRL-TKwereCO—transfectedintoHepG2cellsandHeLacellsbylipofectamine2000．Theluciferaseactivitiesweremeasuredbydualluciferasereportersystem，whileestablishinganegativecontr

8、olgroup(PGL一3Basic)．Results：TheUSP22geneTSSwasdetermin