胡萝卜AFP基因上游启动子的克隆、鉴定及AFP基因转化水稻的研究

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1、中山大学硕士学位论文胡萝卜AFP基因上游启动子的克隆、鉴定及AFP基因转化水稻的研究姓名：王树启申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：王金发2003.6.9论文题目：胡萝hAFP基因上游启动子的克隆、鉴定及AFP基因转化水稻的研究专业：遗传学硕士生；王树启指导教师：王金发教授摘要(利用基因工程改良植物品种，可以不受种质资源的限制，有广阔的应用前景。冷诱导启动子的应用对植物抗冻基因工程有实用意义。已证实胡萝h体内有可冷诱导表达的抗冻蛋白基因，本实验塞已克隆到该抗冻蛋白基因，进一步克隆该基因具有潜在冷诱导性质的启动子是本研究的

2、目的。太为了克隆胡萝hAFP基因的启动子，设计了一个简便、实用的启动予克隆方案——载体锚定PCR法：将用单一限制酶完全消化的胡萝h基因组DNA与pBluescript载体连接，得到以限制酶为标识的胡萝p基圆组文库，并以此为模板，利用GSP(基因组特异引物)和载体通用引物进行PCR扩增。f结果以Hindlll构建的文库经二次PCR得到一条约700bp的特异片段，经序列测定。在AFP基因上游的序列有458bp。初步的序列分析表明这段序列具有高等植物启动子的特征。。{。为验证所克隆候选启动予的功能，构建了两个植物转化载体；pCl3

3、00p．afo和pcl381zpafp。年Ⅱ用包含了AFP基因及其候选启动子的pCl300p．afp转化烟草Nc82，转化植株经过PCR和Southern—blot鉴定，证实外源片段已经整合到烟草的基因组中。分别提取非冷诱导的和在4"C冷处理24小时的转基因烟草总RNA进行RT-PCR检测，结果都检测到了AFP基因的转录。伪i过SDS--PAGE检测未经冷诱导以及在4X3冷处理72小时的转基因烟草的总蛋白，与对照的非转化烟草总蛋白相比，二者都在分子量略高于31kDa处出现一条特异的蛋白条带，分子蠹与抗冻蛋白的大小基本相符。以

4、上结果说明我们所克隆到的AFP基因的候选启动子具有高等植物启动子的功能，而且潜在的诱导模式并非“开启．关闭”的模式。、{最后：我们还将AFP基因连入禽有单子叶植物强启动子Actl的植物转化载体上，构建了pCl3Actafp，并用于转化一个不耐寒的水稻品种中花11。得刭了抗溯霉素的转化水稻，PCR鉴定结果表明AFP基因已经转入了水稻。关键词：AFP蝴；载体锚定PCR．冷诱导i转基因烟草，·水稻转化CloningandIdentityoftheUpstreamPromoteroftheAFPgeneinCarrot，andstu

5、dyofTransformingRicewithAFPgeneMajor：GeneticsName：WangShuqiSupervisor：Prof．WangJinfaABSTRACTPlantgeneengineeringhasagoodoutlookonapplicationinimprovethequalityofplant．Applicationofinduciblepromoterisapplicableforplantanti—freezegeneengineering．Ithadbeenidentifiedth

6、atacarrot’Santi—freezeproteinexpressedbyincrementaftercold-treatment．ThatAFPgenehadbeenclonedbyourlab．Theaimofthisresearchiscloningthepotentialcold—induciblepromoterofAFPgeneincarrot．InordertoclonethepromoterofAFPgene，afacileandfeasibleprotocolwasdesigned．Theprotoc

7、olwasnamedvector-anchoredPCR：LinksinglerestrictiondigestedcarrotgenomicDNAintoplasmidpBluescript．Producedgenomelibrarymarkedbytherestrictionenzyme．PCRwithtemplateofthelibrariesandprimersofGSP(genomespecialprimer)anduniversalprimers(T7andT3)wasprocessed．A700bpspecif

8、icsegmentwasproducedofHindlHlibrarybynestedPCR，andresultofsequencingindicated458bpofthatsegmentisbelongtOtheupstreamofAFPgene．Primarysequenceanal