粳稻全基因组物理图谱及非洲野生稻BIBACTAC文库的构建

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1、河北农业大学博士学位论文粳稻全基因组物理图谱及非洲野生稻BIBAC/TAC文库的构建姓名：李亚宁申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：刘大群;张洪斌20040427摘要粳稻全基因组物理图谱及非洲野生稻BIBAC／TAc文库的构建随着水稻基因组序列草图的完成，研究和确定其基因组中各基因序列的功能已成为科研人员所面临的重要课题。为了加速水稻基因组序列功能的大规模分析，本研究建立了亚洲一年生栽培稻，粳稻“日本晴”OryzasativaL．ssp．japonicaGV．Nipponbare全基因组范围的，并与现有的水稻遗传图谱相结合的综合图谱。该图谱是采用D

2、NA测序胶限制性酶切技术，在粳稻“日本晴”的两个细菌人工染色体(BAC)基因文库和一个可转化人工染色体(BIBAC)基因文库的基础上建立的。图谱的构建共使用了20，835个BAC和BIBAC克隆，这些克隆涵盖了7．2倍的粳稻仝基因组，包含了99％的粳稻全基因组DNA序列。在DNA测序胶上用HindIII酶和HaeIII酶把BAC和BIBAC克隆进行双酶切DNA鉴定后，对胶片进行扫描，通过计算机数据分析，把它们组装成由克隆重叠片断组成的叠连群。结果表明，此物理图谱中共包含了579个BAC／BIBAC克隆组成的叠连群，它们的总物理距离为525Mb。为了验证图谱

3、构建的准确性，本研究中使用了DNA分子标记筛选，基因组序列比对等不同的方法对图谱进行了核实。基于构建的这一粳稻“Fj本晴”全基因组的物理图谱，本研究还进一步使用了59个RFLP分子标记和36个末端测序的BIBAC／BAC克隆，建立了基于可转化人工染色体的“日本晴”第八号染色体的精细物理图谱。此染色体精细图谱共包含11个叠连群，总长度为38．9Mb。本研究中构建的粳稻物理图谱以其在几方面突出的特点和优势，使之较己发表的其他物理图谱对水稻功能基因组的研究提供了更为强有力的工具。首先，所构建的这一新的物理图谱中使用的BIBAC基因文库，是特别为农杆菌介导的大片段

4、外源DNA直接转化到植物基因组而设计的。最近的一些研究结果已表明B1BAC克隆能够通过农杆菌介导的转化方法把大片段外源DNA分子转移到植物细胞中去。因此，此图谱为包括基因与非基因序列的全基因组功能的大规模分析及研究，提供了一个易于使用的平台，对水稻基因克隆和基因功能的鉴定有着不可替代的作用。第二，本研究建立的图谱中使用的BIBAc克隆是构建于富含AT的限制性内切酶HindIII，它不同于由限制性内切酶BamHI和EcoRI构建的BAC文库。这使得本物理图谱所使用的三个大片断DNA文库能够互为补充，因此能更为全面的涵盖水稻基因组序列，避免文库构建中因酶切位点

5、而出现的缺失，对后基因组学的研究也更为有利。第三，以本图谱叠连群中选出的637个克隆进行末端测序得到的652个克隆末端测序结果(rBESs)作为标记，使本图谱可以与现有的水稻序列图谱相比对和结合，构建更为完善的物理图谱、遗传图谱与序列图谱相结合的综合图谱。第四，粳稻“日本晴”第八号染色体精确物理图谱的构建，将会多方面地促进水稻染色体基因组的研究。第五，本研究中基于可转化人工染色体的粳稻全基因组物理图谱的成功构建，进一步证明了DNA测序胶限制性酶切方法是构建全基因组大片段DNA序列物理图谱的可靠的、行之有效的方法和途径。野生稻是水稻遗传改良的重要资源，为加强

6、对野生稻基因组序列功能的研究和基因的定位克隆，本研究还构建了与非洲栽培稻亲缘关系最近的巴蒂野生稻(Oryzabarthii)可转化人工染色体BIBAC基因文库和TAC基因文库。这两个基因文库分别构建于插入了BamHI部分酶切的巴蒂野生稻大片段DNA的BIBAC载体pCLD04541和TAC载体pYLTAC7上，并分别排列于40个384孔微孔板上。每个基因文库含15，360个克隆。通过对BIBAC文库中的克隆进行NotI酶切，再经电泳分析其插入片断大小，结果表明BIBAC克隆片断平均大小为130kb，有2％的克隆中不含插入片断，初步估计构建的BIBAC文库覆

7、盖了3．2倍的巴蒂野生稻全基因组序列。对TAC文库的克隆片断大小分析表明，TAC克隆插入片断平均大小为1i6kb，其中8％的克隆不含插入片断，初步估计TAC基因文库覆盖了2．7倍的巴蒂野生稻全基因组序列。因此，巴蒂野生稻可转化人工染色体BIBAC／TAC基因文库共包含30，720个克隆，覆盖全基因组的5．9倍，涵盖了99％的基因组DNA序列。本研究中构建的巴蒂野生稻BIBAC／TAC文库是迄今为止第一次建立的野生稻的可转化人工染色体基因文库。由于BIBAC和TAC载体具有农杆菌介导的转化大片段DNA分子的能力，因此，非洲野生稻巴蒂野生稻可转化人工染色体基因

8、文库的构建将加速野生稻基因的定位克隆和分析，为研究野生稻和栽培稻在