结核分枝杆菌新型疫苗的构建及免疫学评价

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1、结核分枝杆菌新型疫苗的构建及免疫学评价ConstructionandimmunogenicityevaluationofnovelvaccinesagainstMycobacteriumtuberculosis.作者姓名：寇一鸣专业名称：微生物学研究方向：微生物与免疫指导教师：高峰教授学位类别：理学博士培养单位：生命科学学院论文答辩日期：2018年6月2日授予学位日期：年月日答辩委员会组成：姓名职称工作单位主席梁争论研究员中国食品药品检定研究院委员凌虹教授哈尔滨医科大学刘平黄研究员中国农科院哈尔滨兽医研究

2、所魏民教授东北师范大学涂长春研究员军事医学科学院军事兽医研究所未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则应承担侵权的法律责任。，吉林大学博士（或硕士）学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个

3、人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本。文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：％日期：＞彦年６月１曰中文摘要结核分枝杆菌新型疫苗的构建及免疫学评价结核病是世界上严重威胁人类健康的传染病。世界卫生组织(WHO)统计结果表明，2016年新增结核病患者约1040万，并且有170万人因结核病而死亡。卡介苗（BCG）是目前世界范围内唯一使用的抗结核疫苗。虽然BCG控制儿童结核病十分有效，但对成人结核病的预防效果在

4、不同地区表现出极大差异（0~80%）。随着耐药和耐多药结核病的出现和流行率的增加，迫切需要开发更加理想的新型结核疫苗。引起结核病的主要病原菌结核分枝杆菌是胞内寄生菌，细胞免疫应答对机体抵抗此类胞内寄生菌的感染至关重要。开发出能诱导机体产生强的抗结核分枝杆菌的细胞免疫应答是目前该领域研究的一个主要方向。目前处于临床试验阶段的新型结核疫苗主要有减毒活疫苗、蛋白亚单位疫苗及病毒载体疫苗等三类。这些疫苗的选择的抗原主要是动物研究或人体试验中已经证实的可以产生较强免疫应答的分泌性蛋白，如TB10.4，ESAT6，M

5、PT64，Ag85B和Ag85A等。上述疫苗尝试利用病毒或BCG表达抗原，或利用含有特定佐剂的重组蛋白作为免疫原诱导机体产生抗结核杆菌的细胞免疫应答。虽然抗结核疫苗研发取得了一些成果，但至今仍没有新的抗结核病疫苗产品上市。因此，本论文拟通过构建表达Ag85B-TB10.4融合蛋白的痘病毒（MVAH4）和腺病毒（AdH4）疫苗、高表达Ag85B-TB10.4的痘病毒（MVATH4）疫苗和Ag85B/TB10.4-BLP蛋白亚单位疫苗，研究同源和异源病毒载体Prime-boost免疫方案、不同抗原表达能力的病

6、毒载体、及BLP用作佐剂对抗结核疫苗的动物免疫效果，为新型抗结核疫苗的研发提供实验数据和理论依据。病毒载体疫苗能够诱导机体产生较强的细胞免疫应答。痘病毒（MVA）和腺病毒（Ad）载体是目前疫苗研发领域常用的两种病毒载体，在抗结核疫苗研发过程中具有重要的潜力。目前处于临床试验阶段的重组病毒载体抗结核疫苗中，多数采用单一重组病毒进行多次免疫的方案。而近些年的研究发现，采用不同病毒载体的prime-boost免疫方案，可以有效避免机体的抗载体免疫应答，从而提升疫苗的效果。因此，本研究构建了能表达Ag85B-TB

7、10.4融合蛋白的MVAH4和AdH4两种重组病毒载体结核疫苗，并研究了同源和异源prime-boostI免疫方案产生的免疫应答的区别。AdH4和MVAH4均能诱导小鼠产生免疫应答。含有AdH4(AdH4-AdH4、AdH4-MVAH4和MVAH4-AdH4)的免疫方案诱导产生更高水平的抗原特异性抗体，产生更高水平的IFN-γ，以及更高比例的活化的CD8+T细胞（CD69+CD8+T细胞）。并且不同的免疫方案都诱导产生比较均衡的Th1和Th2免疫应答。AdH4-MVAH4免疫组的脾细胞在Ag85B蛋白的M

8、HC-I表位肽的刺激下，产生分泌IFN-γ的脾细胞数量明显多于其他免疫组。此外，AdH4-MVAH4免疫组分泌Th1相关细胞因子（IFN-γ和TNF-α）的水平也明显高于其他组。这些结果说明，包含AdH4的免疫方案与只含有BCG或MVAH4的免疫方案相比，可以更有效的诱导体液和细胞免疫应答。此外，AdH4-MVAH4的免疫方案可能会产生更理想的保护效果。AdH4-AdH4或MVAH4-MVAH4同源prime-boost免疫结