《氨基酸组成分析》PPT课件

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1、第三章氨基酸组成分析氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在75～200Da之间，其化学通式为R-CH(NH2)-COOH，在生物体内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生物来源的多肽中出现D型氨基酸。氨基酸分析技术的发展始于1820年，由Braconnot最早将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来，但直到21世纪，用化学方法或微生物方法测定氨基酸，仍是一项持续数周或数月的繁琐的工作。色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。1941年，Martin等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，Moore、Stein应用离子交换柱

2、直接分离游离的氨基酸，在1958年，Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是经典的方法。第一节氨基酸组成分析的目的现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化，但也给定量带来了困难，一般很难通过常规的称量或测蛋白质溶液在280nm的光吸收值来准确定量蛋白质。所以如果在蛋白质酶解或测序前，取蛋白质样品的一部分进行氨基酸组成分析，根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况，一种可能是蛋白质的N端封闭，另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分是非蛋白质物

3、质，解决这个问题的很好途径便是做氨基酸组成分析以确定样品的成分。除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外，医学上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。第二节蛋白质的水解方法氨基酸分析的第一步是将蛋白质或多肽水解，常规方法是采用5.7mol/L盐酸在真空状况下于110℃水解24h，也有在150℃下快速水解90min。Waters公司有商品化仪器(水解工作台)出售。将100～500µmol的蛋白质或肽转移到水解指管中冷冻抽干，在水解反应器中加入5.7mol/L盐酸200µl，含2％苯酚(m/V)，将指管置于反应器中，抽真空并充氮气反复三次(图3.1c，真

4、空控制也是实验重复性的一项重要因素)110℃保温22h。其中，苯酚是作为一种抗氧化剂来防止半胱氨酸(Cys)和甲硫氨酸(Met)的氧化。如果遇到一些不易裂解的肽键，如Val—Val，Ile—Leu等，水解时间可适当延长至72h，但长时间水解会部分破坏含羟基的氨基酸[丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，酪氨酸(Tyr)]。影响氨基酸分析结果的三大因素是：水解、衍生、色谱。水解是第一步，水解的完全与否对结果影响很大。在实验中通常采用一些标准蛋白质，如细胞色素c(Cytc)、核糖核酸酶(RNase)或胰岛素(insulin)为标样进行水解、衍生和色谱分析来计算回

5、收，从而考验蛋白质分析的可靠程度和评价方法的适用性。但由于各种蛋门质含有的氨基酸多少不同，并且每一种氨基酸的量也不一样，有的氨基酸含量可多到十几个，有的氨基酸含量只有1～2个，这影响到氨基酸的回收。生物应用公司（ABI）曾设计过一种“测试肽”，即人工合成18种不同氨基酸的肽(除Gln、Asn外)，这样每种氨基酸出现的频率都是1，用此肽来校正回收，看来机会均等，是一种可以采纳的方法，但在实际样品中，不太可能出现这种理想情况。第三节特殊氨基酸的保护和定量不同条件下，各种氨基酸的回收有所不同，但色氨酸均遭破坏，通常解决方法有以下5种。1.水解酸中加添加剂这些添加

6、剂包括琉基乙酸和β-琉基乙醇，我们通过实验认为液相水解时加入巯基乙醇对色氨酸保护效果较好，色氨酸的回收可达80％。有报道Perkin-Elmer公司针对其产品ABI420A的特点，推出试剂十二烷基硫醇，专门保护色氨酸，据称回收率达97％。2.有机酸3mol/L巯基乙磺酸(mercaptoethanesulfonicacid)或4mol/L甲磺酸(methane-sul-fonieacid)在水解时对色氨酸有一定的保护作用。3．碱用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护色氨酸不被破坏。4．酶蛋白酶水解法有时也有应用，其优点是条件温和，对天冬酰胺和谷氨酰胺及色氨

7、酸均无破坏作用，但酶水解法往往不完全，必须用酸水解法校正。5．光谱法分光光度法和二阶微分光谱法可测定色氨酸，前者应用较早，在蛋白质分子中，如不含半胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根据其在6mol/L盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收，测定色氨酸和酪氨酸的含量，此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸的比值为0.2～1时的情况。酪氨酸常被用来确定蛋白质中芳香族氨基酸的含量，计算公式复杂。HewlettPackard公司推出的DAD检测器配合其化学工作站软件，能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。虽然蛋白质和多肽的氨基酸分析法对大多数氨基酸是快速、准确和灵敏的，但在

8、半胱氨酸定量时仍遇到很大困难，解决这个问题的途径有两种，一种是还原