大鼠腹膜纤维化相关miRNA的初步筛选与验证

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答辩委员会主席：麦韭玉熬援【浙江太堂匡堂瞳附属箍二医瞳】论文答辩日期：2Q13』5』2鱼 温州医学院硕士学位论文目录缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29以后的研究方向⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3l附录一简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34综述及参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35发表的临床论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48 温州医学院硕士学位论文全文缩略词表2 温州医学院硕士学位论文3 温州医学院硕士学位论文大鼠腹膜纤维化相关microRNA的初步筛选与验证目的：初步探索microRNA(miRNA，miR)是否参与腹膜透析相关腹膜纤维化。方法：将sD雄性大鼠24只(体重150-J：109)随机平均分为3组：(i)正常对照组；(ii)生理盐水组：每日腹腔注射0．9％生理盐水20ml；(iii)高糖组：每目腹腔内注射4．25％含葡萄糖腹膜透析液20ml。4周后，进行2h腹膜平衡试验(PET)，检测大鼠腹膜功能，处死大鼠，取大鼠腹膜组织，行光镜检查(HE、Masson染色)，免疫组化(SP法)检测Q平滑肌肌动蛋白(Q—SMA)和胶原I(C01．I)的蛋白表达，RT-qPCR检测Q—SMA和C01．I的mRNA表达，基因芯片分析检测各组miRNA。选取芯片分析显著差异表达的miRNA，进行RT-qPCR验证。结果：与空白对照组比较或与生理盐水组比较，高糖组大鼠的透出液葡萄糖浓度／初始腹透液葡萄糖浓度(D2／Do)和超滤量均明显减少，透出液尿素氮浓度厂血浆尿素氮浓度(D／P。。。)明显增3H(P值均0．05)。高糖组大鼠腹膜间皮下基质增厚、血管增生及炎症细胞浸润明显增加。与空白对照组比较或与生理盐水组比较，高糖组大鼠腹膜组织Q．SMA和C01．I的蛋白及mRNA的表达量均显著升高(尸0．05)基因芯片分析提示：(1)与空白对照组比较或与生理盐水组比较，miR．31、miR一93、miR-100、miR。152和miR一497在高糖组大鼠腹膜组织中均呈显著性低表达，miR-122在高糖组大鼠腹膜组织中呈显著性高表达；(2)与空白对照组比较，miR-192、miR-194、miR．200b、miR．138和miR．146a等miRNAs也在高糖组大鼠腹膜组织中均呈显著性低表达；(3)与生理盐水组比较，miR一199a．5p、miR-200e、miR-24．2、miR．27b、miR．30b一5p等miRNAs也在高糖组大鼠腹膜组织中均呈显著性低表达；(4)与空白对照组比较，miR．192、miR．194和miR．200b在生理盐水组大鼠腹膜组织中也呈显著性低表达。选取芯片分析显著差异表达的9条miRNAs(miR．31、miR．93、miR一100、miR一152、miR．497、miR．122、miR一192、miR-194和miR-200b)，进行RT-qPCR验证。结果显示：与空白对照组比较或与生理盐水组比较，miR-31、miR．93、 温州医学院硕士学位论文miR．100、miR-152、miR．497、miR-192、miR．194和miR一200b等8条miRNAs在高糖组大鼠腹膜组织中的表达均呈显著性低表达(P值均<0．05)，miR-122在高糖组大鼠腹膜组织中呈显著性高表达(P<0．05)；生理盐水组与空白对照组的组间比较，上述9条miRNAs在大鼠腹膜组织中的表达均无显著差异(P值均>O．05)。结论：(1)4．25％葡萄糖腹膜透析液，连续腹腔注射28天，可以建立大鼠PF模型。(2)miR．31、miR．93、miR．100、miR-152、miR-497、miR一122、miR-192、miR-194和miR一200b等多条miRNAs可能参与高浓度葡萄糖腹膜透析液诱导的大鼠腹膜纤维化。关键词：腹膜纤维化；miRNA；腹膜透析。 温州医学院硕士学位论文thePreliminaryScreeningofMiRNARelatedtoRatPeritonealFibrosisObjective：ToinvestigateandvalidatetherelationshipbetweenmiRNAandperitonealfibrosisassociatedwithperitonealdialysis．Methods：Twenty—fourSDratswererandomlydividedintothreegroups：(i)Controlgroup(n28)；(ii)Normalsalinegroup(n=8)：dailyintraperitonealinjectionwith0．9％normalsaline；(iii)Hypertonicdialysategroup(n=8)：dailyintraperitonealinjectionwith4。25％peritonealdialysissolution．Afterfourweeks．a2一hourperitonealequilibrationtest(PET)wasperformedandratsweresacrificed．Peritonealmembranehistologywasevaluatedbylightmicroscopy,theproteinandmiRNAexpressionofQ—SMAandCol—1wereestimatedbyimmunohistochemistryandRT-qPCR．Meanwhile，theexpressionofmiRNAswereestimatedbyusingmicroarrayanalysis，andvalidatedbyRT-qPCR．Results：ComparedwiththecontrolgroupOrnormalsalinegroup，theultrafiltration(UF)andglucosereabsorption(Dz／D0)weresignificantlylower(P<0。05)，anddialysate—to—plasmaurearatio(D／Purea)wassignificantlyhigher(P<0．05)inthehypertonicdialysategroup，andtherewasnosignificantdifferencebetweenthecontrolgroupandnormalsalinegroupp0．05)，whichindicatedperitoneumwashighsolutetransport，andperitonealfunctionwasdecreasedinthehypertonicdialysategroup．Inthehistologicalexamination，theperitoneumwasthickerandedematous，fibroblasticactivity,neovascularization，weremoreprominentinthehypertonicdialysategroup．Moreover,comparedwiththecontrolgroupornormalsalinegroup，theproteinandmRNAexpressionofa-SMA、Col·1weresignificantlyhigherinthehypertonicdialysategroup(P<0．05)，andtherewerenosignificantdifferencesbetweenthecontrolgroupandnormalsalinegroup(P>O．05)．Theresultsofmicroarrayanalysisshowedthat(1)comparedwiththecontrolgrouporthenormalsalinegroup，miR-31，miR-93，miR-100，miR-152andmiR·497weresignificantlydown—regulatedinthehypertonicdialysategroup，miR-122wassignificantlyup-regulatedinthehypertonicdialysategroup；(2)comparedwiththecontrolgroup，miR一192，miR一194，miR一200b，miR-138andmiR-146awere6 温州医学院硕士学位论文significantlydown—regulatedinthehypertonicdialysategroup(3)．Comparedwiththenormalsalinegroup，miR-199a-5p，miR-200c，miR-24-2，miR一27bandmiR-30b-5pweresignificantlydown-regulatedinthehypertonicdialysategroup(4)Comparedwiththecontrolgroup，miR-192，miR-194andmiR一200bwerealsosignificantlydown-regulatedinthenormalsalinegroup．TheresultsofRT-qPCRshowedthatcomparedwiththecontrolgrouporthenormalsalinegroup，above8miRNAs(miR一31，miR-93，miR一100，miR-152，miR一497，miR一192，miR一194，miR一200b)weresignificantlydown—regulatedinthehypertonicdialysategroup(P<0．05)，miR-122wassignificantlyup-regulatedinthehypertonicdialysategroup(P<0．05)，andtherewerenosignificantdifferencesbetweenthecontrolgroupandnormalsalinegroup(P>0．05)．Conclusion：(1)Theratmodelofperitonealfibrosiscanbeestablishedbydailyintraperitonealinjectionwith4．25％peritonealdialysissolutionfor28days．(2)rniR-31，miR一93，miR-100，miR一152，miR一497，miR-122，miR-192，miR一194andmiR一200bmaybecloselycorrelatedwiththeratperitonealfibrosisinducedby4．25％peritonealdialysissolution．Keywords：peritonealfibrosis；miRNA；peritonealdialysis．7 温州医学院硕士学位论文在2l世纪，全球范围的慢性肾脏病(chronickidneydiseases，CKD)以及由此导致慢性肾功能衰竭(chronicrenalfailure，CRF)的发病率与患病率均明显升高，故CRY已逐渐成为全球范围内继心脑血管疾病、肿瘤和糖尿病后严重威胁人类健康的一大公害。终末期肾脏疾病(endstagerenaldisease，ESRD)患者的生命维持主要依赖肾脏替代治疗。肾脏的替代治疗主要包括血液透析(hemodialysis，HD)、腹膜透析(peritonealdialysis，PD)和肾移植。近年的多中心大规模研究证明PD在ESRD患者治疗中具有不可替代的地位，成为早期透析的最佳选择Il。J。PD是利用腹膜作为生物性透析膜，依赖弥散和超滤作用，清除体内代谢废物和纠正水电解质紊乱。故连续性不卧床腹膜透析(continuousambulatoryperitonealdialysis，CAPD)有以下优点：①每天24h连续性透析，可以更好地维持机体内环境的稳定，几乎不发生透析失衡综合征。②患者可在家中自行治疗，不需来医院，更为方便，而且费用也较HD低廉。③血流动力学稳定。CAPD特别适用于心血管疾病及老年患者。但是，腹膜纤维化(peritonealfibrosis，PF)是维持性腹膜透析患者退出PD的主要原因之一。导致PF的影响因素包括：长期PD患者因为腹膜透析液(peritonealdialysissolmion，PDS)的生物不相容性[高糖、高渗、低PH值、葡萄糖降解产物(glucosedegradationproducts，GDP)、糖基化终末产物(advancedglycosylationendproduct，AGE)]，反复发生的腹膜炎症，大量细胞因子[白细胞介素．113、白细胞介素一6、白细胞介素。18、肿瘤坏死因子．Q(tumornecrosisfactor-a，TNF。Q)等]，生长因子[成纤维细胞生长因子．2(fibroblastgrowthfactors．2，FGF．2)、转化生长因子．13(transforminggrowthfactor．B，TGF。13)、结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)等1的协同作用，导致人腹膜间皮细胞(humanperitonealmesothelialcells，HPMCs)及腹膜成纤维细胞产生致纤维化效应，使腹膜间皮细胞受损及细胞外基质在腹膜大量沉积14J。近年来，防治腹膜纤维化的研究逐渐成为热点，例如改善腹透液的生物不相容性、抗纤维化药物的研制(如血管紧张素转化酶抑制剂和受体拮抗剂【5])及基因治疗(通过对细胞进行基因修改，合成各种抗炎因子和纤溶因子)等。后者研究是否能广泛运用于临床，还需进一步研究。本实验将从RNA水平研究PF的机制，探索miRNA是否参与PF，旨在为防治PF提供新的治疗策略。 温州医学院硕士学位论文微小RNA(microRNA，miRNA)是近10年来发现的一类重要的内源性非编码单链小RNA分子，长度约为18～24个核苷酸，通过与靶m_砌NA特异性结合导致靶mRNA降解或抑制其翻译，从转录后水平调控靶基因的表达16J。miRNA参与生长发育、器官形成、造血、细胞增殖分化和肿瘤生成等多数重要的病理生理过程。近年来越来越多的研究显示，miRNA与纤维化疾病相关【7．8】。例如，肾脏纤维化【91，肝脏纤维化[101，心脏纤维化[11也1，肺纤维化1131，系统性硬化病【14】等。目前，已有研究显示，miR．589与HPMCs发生上皮细胞问充质转分化(epithelial．mesenchymaltransition，EMT)有关1151。同时，miR．129．5p(周循，博士学位论文，中南大学，2010)、miR．194(邹莎琳，硕士学位论文，中南大学，2009)和miR．302e(陈豫萨，硕士学位论文，中南大学，2010)也与HPMCs的EMT相关(数据尚未发表)。而关于miRNA与PD相关PF的动物体内研究，国内外尚无报道。本研究采用腹腔注射高糖PDS制作大鼠PF动物模型，通过腹膜平衡试验，腹膜组织的光镜检查(HE、Masson染色)、免疫组化(检测q．SMA和C01．I的蛋白表达)、及RT-qPCR(检测Q．SMA和C01．I的mRNA表达)以证实大鼠PF模型的成功建立。然后，通过芯片分析造模后腹膜组织的miRNA，筛选与大鼠PF可能相关的miRNA，并通过RT-qPCR来验证有显著差异表达的miRNA，初步探讨miRNA是否参与PF。 温州医学院硕士学位论文材料与方法1．实验动物SPF级SD雄性大鼠24只，体重1504-lOg，(SCXK(沪)2007．0005)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，于温州医学院SPF级实验动物中心饲养。自由进食饮水、颗粒饲料，饲养温度23±2℃，相对湿度70％，12／12h昼夜交替照明。2．主要试剂试剂名称试剂公司4．25％含糖腹膜透析液兔抗大鼠胶原I(Col—I)抗体兔抗大鼠Q．SMA抗体超敏SP免疫组化试剂盒DAB显色剂山羊封闭血清RNA抽提试剂盒Affymetrix片段化和标记试剂盒DEPC逆转录试剂盒(Fermentas试剂盒1SYBRGreen试剂盒引物多聚甲醛Affymetrix片段化和标记试剂盒美国百特公司美国Abcam公司北京中杉公司北京索来宝公司德国QIAGEN公司美国Affymetrix公司美国Sigma公司加拿大Fermentas公司日本TOYOBO公司上海Invitrogen公司美国Sigma公司美国Aff-ymetrix公司3．仪器仪器设备仪器公司LKB．B2088型超薄切片机OLYMPUSCX31光学显微镜微量移液器彩色摄像机低温高速离心机台式低速离心机GERMAN日本奥林巴斯公司美国Eppendorf公司日本JVC公司美国Eppendorf公司上海安亭科学仪器厂10 温州I医学院硕士学位论文分光光度机梯度PCR仪7500荧光定量PCR仪制冰机高压蒸汽灭菌器微波炉全自动生化分析仪超净工作台电热恒温干燥箱超低温冰箱液氮罐1／10000电子分析天平全套琼脂糖凝胶电泳装置凝胶图像处理系统miRNA芯片分析委托上海++公司完成美国Thermo公司美国BIO—ROD公司美国ABI公司GRANTMEDNIF美的日本同立7600—110苏净集团安泰公司上海跃进医疗仪器厂美国ThermoForma公司成都金凤液氮容器有限公司梅特勒一托利多仪器有限公司北京六一仪器厂BioSenSC620公司3．主要溶液配制(1)0．01MPBS：称取Na2HP04·12H207．09，NaH2P04·2H20O．49，NaCl9．09溶于800ml蒸馏水中，搅拌至溶解，蒸馏水定容至1000ml，调整PH值到7．4～7。6。(2)4％多聚甲醛：多聚甲醛409，0．01MPBS800ml，加热至60。C搅拌加速溶解，0．01MPBS定容至1000ml，4℃保存。(3)1‰DEPC水：1000ml双蒸水中加lmlDEPC，剧烈震荡混匀，室温过夜，高压灭活DEPC。(4)80％乙醇(抽提时现配)：用无水乙醇和l‰DEPC水配制，1‰DEPC水：无水乙醇=1：4，然后放于．20℃冰箱备用。(5)10％水合氯醛：称取109水合氯醛粉末，溶于100ml蒸馏水，搅拌至溶解。(现配现用)(6)1．5％琼脂糖溶液：0．5×TBE100ml溶解1．59琼脂糖，微波炉加热约1分钟，熔化的琼脂糖冷却至60℃左右时加入EB液3ul，充分混匀，将温热的凝胶倒入己置好梳子的电泳版中，在室温下放置40min左右后进行电泳。4．动物分组和造模方法将SD雄性大鼠24只随机分为3组：正常对照组(n--8)，不予任何干预；生理盐水组(n=8)，每日腹腔注射20ml0．9％生理盐水；高糖透析液组(n=8)， 温州医学院硕士学位论文每日腹腔内注射4．25％PDS20ml。4周后处死动物，取腹膜组织待检。腹腔注射方法：用左手抓住大鼠，大鼠左下腹部用碘伏消毒后，右手持20ml注射器将注射器针头于左下腹部刺入皮下，以45。角穿过腹肌，回抽无血后，缓慢注入4．25％PDS(或0．9％生理盐水)。液体保留于腹腔内，每日注射1次。5．腹膜功能检查及标本的保存4周后行2h腹膜平衡试验(PET)，向大鼠体内腹腔注射4．25％PDS20ml，2h后，用10％水合氯醛(0，3ml／Kg)麻醉大鼠。待大鼠麻醉后，于大鼠左下腹缓慢插入带有多个侧孔的10号静脉留置针，缓慢低位引流腹膜透析液，量取引流液。沿腹白线打开腹腔，用纱布吸干腹腔内残余液体后称重，准确测量超滤量(UF)：UF=(纱布吸水后的重量．纱布的重量)×lml／mg+弓l流量．20ml。同时经下腔静脉采血，留取非抗凝血约2ml于EP管中，离心(4℃，4000rpn，10min)，收集上清液，放于一20℃冰箱保存以备用，检测血尿素氮(Bloodureanitrogen，BUN)。并采用终点法测定透出液尿素氮浓度(D)、血清尿素氮浓度(Pu蝴)、初始腹膜透析液葡萄糖浓度(Do)、透出液葡萄糖浓度(D2)，计算D／P。。。和D2／Do。取腹部切口对侧壁层腹膜及肠管腔侧组织，部分标本用4％多聚甲醛溶液固定，剩余标本迅速置于去酶冻存管，置于液氮中保存用于RNA的提取、测定。使用日本日立7600．110全自动生化分析仪检测血尿素氮及腹透液中尿素氮和葡萄糖的浓度。6．细胞学检查采用血细胞计数板高倍镜下计算腹膜透出液中白细胞数，若白细胞计数超过100／mm3，考虑大鼠并发腹膜炎，需退出实验。7．腹膜组织学检查7．1组织固定、脱水、浸蜡、包埋：组织大小约3×3×2mm，放于4％多聚甲醛溶液中，体积比大于1／10，固定48h后，75％乙醇脱水35min，85％乙醇脱水35min，95％乙醇脱水35min×2次，无水乙醇脱水35min，二甲苯透明10min，石蜡浸入60℃，90～120min，石蜡冷却包埋。7．2切片：应用切片机将石蜡标本进行切片，切片厚约3um，将切片放于50。C恒温箱烤片2h。7．3脱蜡：二甲苯脱蜡15min×2次，无水乙醇10rain×2次，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，水洗。7．4HE染色：将脱蜡后的切片浸入苏木素5rnin，水洗。1％盐酸酒精分化片刻， 温州医学院硕士学位论文水洗。流水冲洗30min，水洗。0．5％伊红浸染3min，水洗。75％乙醇lmin，85％乙醇1min，95％乙醇10min，无水乙醇20min×3次，二甲苯20min×3次，最后树胶封片。7．5Masson染色：将脱蜡后的切片，蒸馏水5min，丽春红、酸性品红染15min，1％冰醋酸I洗1次，l％冰醋酸II洗1次，l％磷钼酸水溶液5min，1％冰醋酸I洗1次，1％冰醋酸II洗1次，1％亮绿染色15min，1％冰醋酸I洗1次，1％冰醋酸II洗1次，脱水，透明，封片。8．Q—SMA和C01．I的蛋白检测——免疫组化法3l-tm石蜡切片60。C烤片1h，常规脱蜡水化，3％H202室温孵育10min，PBS液洗3minX3次，柠檬酸盐缓冲液抗原热修复16min，自然冷却后PBS液洗3min×3次，正常非免疫动物血清封闭，37℃下孵育30rain，倾去血清，勿洗，滴加适当稀释的一抗[Ct．SMA0：250)、C01．I(1：250)]，4。C过夜，室温下复温1h后PBS液洗5min×4次，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30rain，PBS液洗5rain×4次，DAB显色，在显微镜下观察，当目标部位已显色而背景不明显时，自来水冲洗中止反应，苏木素复染，分化，干燥，透明，封片。镜下观察棕褐色为阳性反应。同一个指标所有组织切片均予同一次染色。每一张切片在400倍下随机选择10个卅i同随机视野进行图像采集。使用Image．ProPlus6．0图像分析系统对结果进行分析。阳性强度量化为腹膜内所有阳性染色的累积光密度(D)值除以腹膜面积(area)而得出的平均光密度值。平均光密度值越大，即抗原的表达水平越高，反之则抗原表达水平越低。9．样品RNA的提取9．1匀浆：取约50．100mg组织于液氮中研磨成粉末状，加入lmlTrizol，再继续研磨至裂解液呈透明状，室温放置5min，使其充分裂解，然后转移入去酶EP管进行。9．2分相：在装有裂解物的去酶EP管中加入200pl的氯仿(为Trizol总体积的1／5)，振荡混匀15秒，室温下静置5min。40C，12000rpm，离心15min，分相为三层：上层为RNA(约为Trizol的60呦；中间为DNA；下层为蛋白质f酚．氯仿)。小心吸取上层水相，转移到另一去酶EP管中。9．3RNA沉淀：上清液加入约0．5ml的异丙醇，振荡混匀30秒。．20。C冰箱放置过夜。40C，12000rpm离心10min。RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液，避免吸弃RNA沉淀。9．4RNA清洗：去酶EP管中加入hnl预冷的75％乙醇，振荡混均30秒，使沉淀振荡起来，4。C8000rpm离心5min。尽可能吸弃上清液，防止RNA沉淀丢 温州医学院硕士学位论文失。9．5溶解RNA沉淀：室温晾干5．10rain。用20u1DEPC水溶解沉淀。9,6RNA的保存：提取的RNA放于．80。C冰箱保存，或立即用于逆转录。9．7RNA浓度和纯度鉴定：取1ulI斟A溶液，用1％oDEPC水稀释100倍。用分光光度计测定RNA溶液在260nnl和280nnl下的吸光度，检测RNA的浓度和纯度。按以下公式计算totalRNA的浓度：TotalRNA浓度(ug／m1)=OD260×稀释倍数×40ug／ml。以OD260／280值来检测RNA的纯度，OD260／280值在1．9．2．1之间时，可认为RNA的纯度较好，可用于后续实验。9．8RNA完整性鉴定：将5“lRNA提取液与1l-t1上样缓冲液混合，1．5％琼脂糖凝胶，150V，40mA，电泳20min，在凝胶成像仪下检测总RNA中28s和18s的完整性。10．Q．SMA和C01．I的mRNA检测10．1PCR引物序列(均由上海英骏生物技术有限公司合成)：见表1。表1：GAPDH、a．SMA和C01．I引物序列基因名称引物序列(5’to3’)GAPDHGCAAGTTCAACGGCACAGGCCAGTAGACTCCACGACATo．SMAC01．ICTTCL蛆’AACGAGCTTCGCTCCAGAGTCCAGCACAATACTCAGCCCTCTGTGCCTCCTTCGCTTCCATACTCG10．2mRNA逆转录成cDNAa．反应体系：总RNAoligo(dT)18双蒸水5×RTBufferRNaseinhibitordNTPM．MLV逆转录酶1lag1ulupto12U14lal1“l2Ul1ul14 温州医学院硕士学位论文b．反应条件：在PCR扩增仪进行逆转录反应。总RNA与水及oligo混合成12u1体系后，65℃温浴5min，立即至冰上冷却，后加其他成分至20ul体系，42℃60min，70。C5min。结束后反应产物于．20℃保存。10．3RT-qPCR检测Q．SMAmRNA和C01．ImRNA的cDNA：a．反应体系：5倍稀释后的逆转录产物112l2×SYBRGreenIMastermix10plPlussolution21．tl前向引物2p1后向引物2Ill双蒸水upto20ulb．反应条件：1)扩增程序：95℃3min预变性，95℃15s变性，60。Clmin退火延伸，40个循环。2)熔解程序：95℃15s，60℃tmin，95℃15s，60℃15s，1个循环。所有样品做2复孔。11．基因芯片分析每组8只动物仅集中送一张芯片，即空白对照组、生理盐水组和高糖组各送检一张芯片。11．1Poly(A)jJIl尾11．1．1在去酶的EP管中加入1ug总RNA并补去酶水至8ul，然后放在冰上。11．1．2加入212lRNASpikeControlOligos混匀。11．1．3用lmMTris稀释ATPMix，稀释倍数如下：TotalRNA：ATPMix稀释倍数=1：500。11．1．4加入5ulmastermix混合液到EP管中，混匀离心5s，mastermix组分如下：试剂体积(u1)10×Reaction25MmMnCl2DilutedATPMixPAPEnzyme1．5111．1．5在PCR仪37。C孵育15rnin，然后离心5s，放在冰上。11．2miRNA荧光标记11．2．1加4ul5×FlashTagBiotinHSR连接混合液，再加入2lalT4连接酶，15 温州医学院硕士学位论文轻轻混匀后离心5s，然后PCR仪上25。C孵育30min。11．2．2加入2．5ulHSRStopSolution混匀后离心5s，然后吸取2u1做ELOSAQCAssay检测，其余一20"C保存。11．3芯片杂交11．3．1把芯片从冰箱中取出后放在室温。11．3．2在去酶的EP管中加入5儿l20XEukaryoticHyBridizationcontrols。11．3．3在PCR仪上65℃孵育5min。11．3．4把21．5ul生物素标记过的样品加到已配置的杂交液中，杂交液组分如下：ComponedVolumeforoneArray(u1)生物素标记样品2×Hybridization27．5％FormamideDMSO20×EukaryoticHyBridizationcontrolsControlOligonucleotideB2TotalVolume21．5501510、1．7103．211．3．5配置好的杂交液混匀后离心5s后，在PCR仪上孵育，程序如下：99℃5min：45℃5min；4℃Hold。11．3．6将孵育好的杂交液离心5s，然后用200ul的移液器将1001-tl的杂交液注入芯片中，加样口用贴纸封住。11．3．7然后把芯片放在杂交炉架子上后放在杂交炉里，48"C60rpm杂交16h。11．4芯片洗涤和扫描11．4．1杂交结束后，用枪头吸掉杂交液，加入100ll1arrayholdingbuffer。11．4．2在AffymetrixGeneChipCommandConsole(AGCC)中扫描芯片条形码，生成样品对应芯片ARR文件。11．4．3把芯片洗涤液washA、washB和去离子水放在洗涤站的相应位置，然后运行AGCCFlutionsControl软件进行初始化。11．4．5初始化结束后，在3个无核酸1．5ml离心管中分别加入600mlstaincocktail1、600ralstaincocktail2和800mlarrayholdingbufief,然后放在洗脱站的1、2、3位置上，把芯片插入洗脱站的槽中，洗涤大约lh。11．4．6洗脱结束后，把芯片放在Affymetrix的扫描仪中，进行芯片扫描生成数据。16 温州1医学院硕士学位论文11．5数据分析比较各组大鼠腹膜组织miRNA的表达水平，以两组间信号强度比值>2或者0．05)。见表3。表3：各组大鼠腹膜功能检测结果4与空白对照组比较，P<0．05；}}与生理盐水组比较，P<0．05；△与空白对照组比较，P>0．052．细胞学检查结果所有大鼠透出液中自细胞计数均未超过100／mm3，可排除并发腹膜炎。3．腹膜组织学改变H．E染色，高糖组腹膜表面间皮细胞肿胀，核增大，间皮下基质明显增厚，并可见成纤维细胞增生、血管明显增多，伴有大量炎症细胞浸润，主要以淋巴细胞及单核细胞为主。空白对照组腹膜间皮下基质薄，间皮下基质内少见成纤维细胞、炎症细胞及血管。生理盐水组的病理改变介于前两组之间。见图1—一一——————————一———————————一●AlB1Cl图1：HE染色结果(×200)：A1：空白对照组BI：生理盐水组C1：高糖组 温州医学院硕士学位论文Masson染色，与空白对照组比较或与生理盐水组比较，高糖组染成绿色的间皮下基质均明显增厚。见图2A2B2C2图2：Masson染色结果(×200)：A2：空白对照组B2：生理盐水组C2：高糖组4．腹膜Q．SMA和C01．I的蛋白表达变化免疫组化显示，Q．SMA和C01．I在高糖组腹膜间皮细胞、间皮下基质、浸润的炎症细胞及血管内皮细胞大量表达；空白对照组腹膜中几乎无表达或仅微弱表达于血管内皮细胞、腹膜间皮细胞；生理盐水组腹膜中表达介于前两组之间，见图3和图4。使用Image．ProPlus6．0图像分析系统进行分析，结果显示，与空白对照组比较或与生理盐水组比较，高糖组中q．SMA和C01．I的蛋白表达量均显著升高(P值均<0．05)。Q．SMA和C01．I的蛋白表达量在生理盐水组与空白对照组间比较差异均无统计学意义(P值均>0．05)，见表4。r■——一。；V弋。A。’＼，’“‘’妒、、}、A4晴一’、。、．。G4图4：C01．I免疫组化结果(×400)：A4：空白对照组B4：生理盐水组C4：高糖组 温州医学院硕士学位论文表4：各组大鼠腹膜组织Q．SMA及C01．I的平均光密度值+与空白对照组比较，P<0．05；拌与生理盐水组比较，P<0．05；△与空白对照组比较，P>0．055．RNA提取的质量各个标本RNA的OD260，280比值均在1．9．2．1之间，说明所提取的RNA纯度较好，符合实验要求。电泳结果显示所有标本均有清晰的18S和28S条带，见图5，说明RNA未发生降解，可用于进一步实验。，一摹ABC图5：RNA电泳结果6．腹膜a．SMA和C01．I的mRNA表达变化以GAPDH作为内参照，分析上皮细胞间质转分化及纤维化相关指标a．SMA和C01．I的mRNA表达变化。RT-qPCR产物均为单峰的熔解曲线(见图6)，提示扩增产物单一，无非特异性扩增及引物二聚体形成，结果可靠。与生理盐水组比较或与空白对照组比较，a．SMA和C01．I的mRNA表达量在高糖组中均显著升高(P值均<0．05)；a—SMA和C01．I的mRNA表达量在生理盐水组与空白对照组间比较的差异均无统计学意义(P值均>0．05)。见图7。 温州医学院硕士学位论文-兰厂一二-J．GAPDH⋯’=：．。．。：；。一·=。⋯。臣，罩要叠要曩置，■__■■]__●I_●_⋯’，’“，㈠e⋯D⋯F一．．图6：Q．SMA、C01．I和GAPDH产物熔解曲线图图7：Q．SMA、Col—I在各组中的表达量。$与空白对照组比较，P<0．05；撑与生理盐水组比较，P<0．05 温州医学院硕士学位论文7．腹膜miRNA的芯片分析结果(1)与空白对照组比较或与生理盐水组比较，miR．31、miR．93、miR．100、miR．152和miR-497在高糖组大鼠腹膜组织中均呈显著性低表达，miR-122在高糖组大鼠腹膜组织中呈显著性高表达：(2)与空白对照组比较，miR．192、miR一194、miR一200b、miR-138和miR一146a等miRNAs也在高糖组大鼠腹膜组织中均呈显著性低表达；(3)与生理盐水组比较，miR．19％．5p、miR．200c、miR．24．2、miR一27b、miR。30b一5p等miRNAs也在高糖组大鼠腹膜组织中均呈显著性低表达；(4)与空白对照组比较，miR．192、miR-194和miR一200b在生理盐水组大鼠腹膜组织中也呈显著性低表达。表5-miRNA在各组中的表达情况注：+表示高糖组与空白对照组相比，有显著差异；8表示高糖组与生理盐水组相比，有显著差异；^表示生理盐水组与空白对照组相比，有显著差异；／表示两组之间无显著差异表达。以两组间信号强度比值>2或者<0．5表示两组问miRNA表达有显著差异。8．RT-qPCR验证结果选取芯片分析显著差异表达的9条miRNAs(miR．31、miR．93、miR一100、 温州医学院硕士学位论文miR-．152、miR．497、miR-．122、miR．192、miR-．194和rniR．200b)，进行RT-qPCR验证。RT-qPCR产物均为单峰的熔解曲线，见图8，提示扩增产物单一，无非特异性扩增及引物二聚体形成，结果可靠。与空白对照组比较或与生理盐水组比较，高糖组miR．31、miR．93、miR一100、miR．152、miiR．．497、miJR．．192、miR-194和miR．．200b等8条miRNAs均呈显著低表达(P<0．05)，miR．122呈显著高表达((P<0．05)；生理盐水组与空白对照组比较，上述9条miRNAs的表达均无显著差异(P>0．05)，见图9。蕊ImiR-一497皿iR一200b”miR一192。L⋯⋯⋯。⋯●⋯⋯．⋯=。。》p”厂⋯一_百⋯一U6雕川／{l卜⋯⋯，j≯1一．1⋯⋯⋯⋯⋯i⋯⋯r——————rl砒肛152㈦／i＼}-一⋯J／‘㈡}⋯⋯⋯⋯l⋯。『『『miR-一194：i一≮⋯夏二j誊。～。miR122图8：miR-31、miR．93、miR-．100、miR-．152、miR．．497、miR．122、miR．192、miR-194、miR-200b和U6产物熔解曲线图。 温州医学院硕士学位论文图9：miRNAs在各组中的相对表达量。4与空白对照组相比，P<0．05；4与生理盐水组相比，P<0．0526 温州医学院硕士学位论文分析与讨论本研究参考卓莉等【16】的造模方法，采用腹腔注射4．25％葡萄糖腹膜透析液4周，建立大鼠PF模型。结果显示，与空白对照组比较或与生理盐水组比较，高糖组大鼠的透出液葡萄糖浓度／初始腹透液葡萄糖浓度(D2仍o)和超滤量均明显减少，透出液尿素氮浓度／血浆尿素氮浓度(D／P。。。)明显增加(P值均<0．05)，提示高糖组大鼠腹膜呈高转运、腹膜功能下降。病理显示高糖组大鼠腹膜表面问皮细胞肿胀，间皮下基质明显增厚，并可见成纤维细胞增生、血管明显增多、大量炎症细胞浸润。与空白对照组比较或与生理盐水组比较，高糖组腹膜a．SMA和C01．I的蛋白及mRNA的表达量均显著升高(氏o。05)。上述实验结果说明造模成功。基因芯片分析结果显示，与空白对照组比较，miR．192、miR．194和miR-200b在高糖组中呈显著低表达。这3条miRNAs在高糖组腹膜中的低表达也得到实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术的验证。值得注意是，在基因芯片分析中，与空白对照组比较，这3条miRNAs在生理盐水组也呈显著低表达。而在RT-qPCR结果显示，上述3条miRNAs在生理盐水组与空白对照组问比较差异均无统计学意义，即基因芯片与RT-qPCR在这3条miRNAs的结果不一致。基因芯片分析技术具有高通量和并行处理的优点，已广泛用于研究miRNA表达【l71。但由于芯片分析信息质量的稳定性和可重复性比较差，无法实现定量检测，故存在一定的误差。本实验受经费限制，每组8只动物仅集中送一张芯片(空白对照组、生理盐水组和高糖组各送检一张芯片)，上述结果只是由一次比较分析得出，可能存在一定的误差。RT-qPCR是检测基因定量表达的金标准[18-19]，在基因信息分析中占据重要地位。本实验进行RT-qPCR时是将各组所有符合实验要求的大鼠均进行定量检测，然后进行统计学分析，更具有科学性。故RT-qPCR的结果更可靠。近年有研究显示，除miR-194(邹莎琳，硕士学位论文，中南大学，2009)以外，miR．589t”J、miR．1295p(周循，博士学位论文，中南大学，2010)和miR．302c(陈豫萨，硕士学位论文，中南大学，2010)也参与人腹膜问皮细胞(humanperitonealmesothelialcells，HPMCs)发生上皮间充质转分化(epithelial—mesenchymaltransition，EMT)。本实验的芯片研究没有筛选到后三条miR，也许与研究对象不同有关。本研究基因芯片分析与RT-qPCR结果均显示高糖组腹膜中miR一3l、miR．93、miR一100、miR．152、miR．497、miR．192、miR_194、miR．200b等8条miRNAs 温州医学院硕士学位论文呈显著性低表达，miR．122呈显著性高表达。以上miRNA尚无与腹膜纤维化相关的文献报告，仅有与其他脏器组织纤维化相关的文献报告。YangS【201等通过动物体内及细胞体外研究显示，miR．31在肺纤维化中呈低表达，miR．31可以抑制TGF．B1的活性，并通过抑制靶基因integrina(5)和RhoA的表达，以改善肺纤维化。WangG【2lJ等通过研究IgA患者尿液中miRNAs水平，显示miR一93与肾小球硬化呈负相关，且与靶基因SMAD3呈正相关，可能通过TGF．p(1)／SMAD3途径调节肾小球硬化。LiJ等【22J通过动物体内及细胞体外研究显示，miR．122在肝纤维化中呈低表达。上调miR-122可以抑制靶基因P4HAl的表达，减少胶原沉积及ECM的产生，以改善肝纤维化。KrupaA等[23】通过对人肾脏组织研究显示，miR．192在肾小管间质纤维化中呈低表达；并通过细胞体外研究显示，TGF—Bl可以抑制miR．192的表达。VenugopalSK等【241通过动物体内研究显示，miR．194在肝纤维化中呈低表达。上调miR．194会抑制靶基因rac1的表达，明显抑制增生，减少SMA和C01．I的表达。ChenY等1251通过体外研究显示，miR-200b在肠纤维化中呈低表达，上调miR一200b可以抑制肠纤维化。miR一31、miR-93、miR．122、miR一192、miR．194、miR．200b等6条miRNAs在本研究中也均呈低表达，故我们推测上述miRNA可能以相似途径参与PF，但是具体机制还需要更多的实验研究来证明。关于miR．100、miR—152和miR一497，文献报道仅涉及与肿瘤的发生进展相关[26埘1。但是，鉴于人腹膜间皮细胞的EMT在PF的发生及进展过程中起着重要作用。同时，许多体内及体外研究均显示，EMT在上皮细胞肿瘤的转移过程中起着重要的作用‘291。有认为，EMT是脏器纤维化及肿瘤发生的共同环节【30~31】。miR-100、miR．152和miR一497是否可能通过EMT参与大鼠腹膜纤维化，尚待进一步研究。。综上所述，目前仅有少量研究显示miRNAs参与体外培养的HPMCs发生EMT。本实验首次从体内实验的角度观察到miR-31、miR-93、miR．100、miR．152、miR．497、miR．122、miR．192、miR．194和miR．200b等多条miRNAs可能参与高浓度葡萄糖腹膜透析液诱导的大鼠PF。鉴于本研究体内实验设计上的局限性，尚不能回答这些miRNAs参与PF的具体环节，其发挥的作用和机制也有待进一步研究证实。 温州医学院硕士学位论文结论1．4．25％葡萄糖腹膜透析液，连续腹腔注射28天，可以建立大鼠PF模型。2．miR．31、miR_93、miR．100、miR．152、miR．497、miR-122、miR．192、miR．194和miR．200b等多条miRNAs可能参与高浓度葡萄糖腹膜透析液诱导的大鼠腹膜纤维化。 温州医学院硕士学位论文以后的研究方向在体外大鼠腹膜间皮细胞水平上筛选PF相关的miRNA：在体内动物模型原位杂交技术的应用；结合体内动物模型和体外细胞模型的筛选结果，利用miRNA生物信息学预测软件预测miRNA靶基因；验证miRNA靶mRNA。 温少1,1医学院硕士学位论文参考文献[1]VandenWallBakeAW,KoomanJP,LangeJM，eta1．Adequacyofperitonealdialysisandtheimportanceofpreservingresidualrenalfunction．NephrolDialTransplant．2006，21Suppl2：ii34．7．[21LamMF，TangC，WongAK，eta1．ASPD：aprospectivestudyofadequacyinAsianpatientsonlongterm，smallvolume，continousambulatoryperitonealdialysis．PeritDialInt．2006，26(4)：446—74．f3]MontenegroJ，Saracho砌吐MartinezIM，eta1．Long—termclinicalexperiencewithpurebicarbonateperitonealdialysissolutions．PeritDialInt．2006，26(1)：89．94．【4】HungKV,HuangJW,TsaiTJ，eta1．Peritonealfibrosingsyndrome：pathogeneticmechanismandcurrenttherapeuticslrategies．JChinMedAssoc．2005，68(9)：401．5．[5]JingS，KezhouYHongZ，eta1．Effectofrenin-angiotensinsysteminhibitorsonpreventionofperitonealfibrosisinperitonealdialysispatients。Nephrology(Carlton)．2010Feb；15(1)：27．32．[6]BartelDEMicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，andfunction．Cell．2004，115(2)：281—97．【7]VettoriS，GayS，DistlerO．RoleofmiRNAsinfibrosis．OpenRheumatolJ．2012．6：130．139．[8】Patel、‘NoureddineL．MicroRNAsandfibrosis．CurtOpinNephrolHypertens．2012．21(4)：410—6．【9】9LiJY,YongTY,MichaelMZ，eta1．Review：TheroleofmiRNAsinkidneydisease．Nephrology(Carlton)．2010，15(6)：599-608．【10】PinzaniM，RosseltiM，ZuckermannM．Livercirrhosis．BestPractResClinGastroenterol2011．25：28卜90．【11]KrenningGZeisbergEM，KalluriR．Theoriginoffibroblastsandmechanismsofcardiacfibrosis．JCellPhysiol2010，225：631-7．【12]CreemersEE，PintoYM．Molecularmechanismsthatcontrolinterstitialfibrosisinthepressure—overloadedheart．CardiovascRes．2011，89：265．82．[13】WyrmTA．Integratingmechanismsofpulmonaryfibrosis．JExpMed2011．208：1339．50．[14】WeiJ，BhattacharyyaS，TourtellotteWG,VargaJ．Fibrosisinsystemicsclerosis：emergingconceptsandimplicationsfortargetedtherapy．AutoimmunRev2011，10：267．75．[15]KeZhang，HaoZhang，XunZhou，eta1．miRNA589regulatesepithelial．mesenchymaltransitioninhumanperitonealmesothelialcells．JBiomedBiotechn01．2012，2012：1-6．[16J卓莉，刘伏友，彭佑铭，等．～种新型腹膜纤维化大鼠模型的构建．中华肾脏病杂志．2005，21(81)：495—497．[17]YanN，LuYSunH，eta1．AmieroarrayformicroRNAprofilinginmousetestiestissues．31 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温州1医学院硕士学位论文个人资料：姓名：吴旭性别：女出生年月：1986年5月籍贯：浙江湖州政治面貌：中共党员附录求学经历：2005年9月——2010年7月杭少I,It)O范大学临床医学获得学士学位2010年9月——2013年7月温州医学院肾脏病学临床型硕士研究生。已发表文章：1．第一作者．腹痛、发热、皮肤黄染和瘀斑伴尿少．中华国际医学论坛杂志(电子期刊)．2011；5(3)：28—30．2．第一作者．腹膜透析液对腹膜纤维化的影响(综述)．国际泌尿系统杂志．2012；32(3)：400—402．3．第一作者．大鼠腹膜纤维化miRNA的初步筛选(论著)．中国中西医结合。肾病杂志．2013；14(3)：203．206．学术交流：第一作者论文《大鼠腹膜纤维化miRNA的初步筛选》分别被中国医师协会肾脏内科医师分会2012年年会、中华医学会肾脏病学分会2012年会和浙江省医学会肾脏病学分会2012年会录用壁报交流。 温州医学院硕士学位论文致谢光阴似箭，硕士研究生的学习生涯即将结束，三年的学习生活使我受益匪浅。回首三年，我得到了许多的关怀和帮助，在此向他们表达我最诚挚的谢意!首先，我要深深感谢我的导师黄朝兴教授!感谢您三年多的谆谆教导、诲人不倦和爱护有加!感激您在学业上对我的严格要求，感激您在精神上赋予我的动力和支持。一日为师，终身为父，这些恩情铭刻我心，永志难忘!不仅指导临床论文的发表，本论文也是在黄老师的悉心指导之下完成的。在论文的写作阶段，您倾注了极大的关怀和鼓励，在百忙之中抽出空来对我的论文进行认真地批改，字字句句把关，提出许多中肯的指导意见。您严谨的治学之风和对事业的孜孜追求将影响和激励我的一生!其次，我要深深感谢林凡老师!本论文的完成也离不开您的悉心指导!感激您在学业及生活上对我的关心、帮助和支持!感谢您在我遇到困难时，与我一起分忧解难!您为人随和热情，治学严谨细心。在闲聊时您总是能像知心朋友一样鼓励我，在论文的写作和措辞等方面您也总会以“专业标准”严格要求我，以严谨的态度对论文进行反复修改、润色!感谢您慈母般的关爱，我将铭记一生!衷心感谢章慧娣老师对综述的选题的指导和对综述文的校正!衷心感谢薛向阳老师在科研方面对我的点拨和指导!衷心感谢尤小寒师姐及张周沧师兄在科研方面对我的关心与帮助!衷心感谢温州医学院附属第一医院’肾内科各位老师对我临床知识和技能的指导!衷心感谢温州医学院王斯璐、郑健健、张行、梁勇、赵慧玲、陈通克等老师在实验技术上的指导!衷心感谢我的母校温州医学院!衷心感谢我的家人和朋友134 温州医学院硕士学位论文综述腹膜透析液对腹膜纤维化的影响theEffectsofPeritonealDialysisSolutiononPeritonealFibrosis吴旭综述林凡黄朝兴审校[摘要]：传统的腹膜透析液(peritonealdialysissolution，PDS)生物相容性差，其高糖、高渗、低PH值的特点是引起腹膜结构、功能改变，最终导致腹膜纤维化的重要原因。新型腹透液的研究主要是从PDS的渗透剂、缓冲碱和电解质成分等方面来改善PDS的生物不相容性，如使用葡萄糖多聚体、用氨基酸充当渗透剂、用碳酸氢盐作缓冲碱及用生理钙腹透液等。目前一些研究通过在腹透液中添加抗纤维化因子来抑制腹膜纤维化，但这些物质能否运用于临床还需要大量研究证实。本文就对PDS的进展作一综述。[关键词]：腹膜透析液腹膜纤维化[中图分类号】：R459．5[文献标识码]：A传统的腹膜透析液(peritonealdialysissolution，PDS)是以葡萄糖为渗透剂和以乳酸盐为缓冲碱的透析液，与腹膜组织生物相容性差。其高糖、高渗、低PH值的特点以及产生葡萄糖降解产物(glucosedegradationproducts，GDP)、糖基化终末产物(advancedglycosylationendproduct，AGE)是引起腹膜结构和功能改变，最终导致腹膜纤维化(peritonealfibrosis，PF)和超滤失败的重要原因。所以改善PDS的生物不相容性，一直是腹膜透析研究的热点之一。目前很多研究都致力于改善PDS的渗透剂、缓冲碱和电解质成分，以提高透析效果及减少PF。还有一些研究通过在腹透液中添加抗纤维化因子来抑制PF，但这些物质能否运用于临床还尚需大量研究证实。本文就对PDS对PF的影响及最新进展作一综述。1．传统的PDS导致PF的机制渗透剂葡萄糖、缓冲碱乳酸盐、低PH值及电解质(高钙)是引起腹膜结构和功能改变，最终导致PF的重要原因。1．1葡萄糖1．1．1对促纤维化细胞因子的作用Min．A掣1]通过研究显示人腹膜间皮细胞(humanperitonealmesothelialcells。HPMCs)暴露于高糖下，会导致抗纤维化细胞因子f肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)和骨形态蛋白-7(bonemorphogenicprotein7，BMP一7)1表达减少。HGF或BMP．7可阻断高糖诱导的上皮间充质转分化(epithelial．to。mesenchymaltransition，EMT)，其中BMP一7还可以改善PF。 温州医学院硕士学位论文葡萄糖还可以显著刺激腹膜细胞产生转化生长因子B1(transforminggrowthfactor．Bl，TGF．B1)【lJ。已知，TGF．131是纤维化发展的关键因子。TGF．131可以显著促进结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)的合成，CTGF位于TGF．131下游，可刺激成纤维细胞增殖和分泌胶原，与组织器官的纤维化关系密切。HPMCs对于CTGF、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfacto，VEGF)和TGF—S1的不同反应，提示这些细胞因子对HPMCs有着既重叠又特殊的效应【2J。1．1．2对人腹膜间皮细胞(HPMCs)的损伤高浓度葡萄糖可减少E．钙粘蛋白的表达，增加Ⅱ．平滑肌肌动蛋白(Q-smoothmuscleactin，f1．SMA)、纤连蛋白(fibronectin，FN)和胶原．I的表达，增加细胞迁移，从而诱导HPMCs的EMT【3】．高糖会损伤HPMCs的线粒体功能，导致活性氧产生过多及广泛的DNA损伤，从而会加速HMPCs的衰老[41．1．1．3对腹膜溶质转运功能的影响葡萄糖在腹腔中很容易被吸收，不能长期维持超滤。SimonJ[Sl等通过对303个长期腹膜透析病人的回顾性队列研究(测试腹膜平衡试验、暴露的葡萄糖量、Kt／V、腹膜炎发生率)，显示早期应用高渗葡萄糖PDS，会导致腹膜溶质高转运，最终可导致腹膜超滤失败。1．1．4GDP及AGE对腹膜的影响在腹膜透析液的热消毒及储存中，传统PDS所处的PH值条件(5。5—6。5)可显著增加GDP的产生。GDP可显著增加胶原在腹膜的沉积，且会显著增加羟脯氨酸的含量。CnossenTT等[6】通过对23个长期持续非卧床腹膜透析(continuousambulatoryperitonealdialysis，CAPD)患者进行12周的前瞻性观察研究显示，GDP可以显著增加AGE的形成。AGE能使HPMCs下基质和血管壁发生糖尿病样微血管病改变，从而影响腹膜转运功能，最终导致腹膜超滤失败。AGE可刺激VEGF的大量产生。VEGF是一种具有促进腹膜血管新生及血管病变的重要细胞因子，在PF中起了重要作用。1．2乳酸盐LibettaC等【7】通过对23个CAPD患者的观察研究，显示以乳酸盐为缓冲碱的PDS，会损害Thl细胞亚群功能，从而影响细胞因子的分泌，降低腹膜的防御功能，最终损害腹膜。1．3低PH值由于葡萄糖需要经过加温处理才能与其他成分混合后形成透析液，此处理过程中，为了减少GDP的形成，但又要尽量符合人体生理状态，大多数PDS所处的PH值条件为5．5．6．5。但是腹腔的酸性环境会对HPMCs产生细胞毒性作用， 温州医学院硕士学位论文可损伤HPMCs并抑制其增殖。1．4高钙常用PDS的钙浓度为1．75mmol／L，明显高于血浆中的钙离子浓度(1．12～1．33mmol／L)，所以是一种非生理性的高钙溶液。彭翔等181通过体外试验和临床试验观察到高钙(1．75mmol／L)可促进HPMCs增殖，同时加重细胞损伤，促进FN合成，而生理浓度钙(1．25mmol／L)对HPMCs有一定保护作用并可能预防PF。2．新型腹膜透析液的研究为了减少PF，主要是从PDS的渗透剂、缓冲碱和电解质成分(钙离子浓度)等方面来改善PDS的生物不相容性。2．1渗透剂2．1．1葡萄糖多聚体葡萄糖多聚体可替代葡萄糖在PDS中充当渗透剂。它能通过胶体渗透作用产生超滤，在长期透析非常有效，而且能在腹腔高渗的情况下防止透析液重吸收至体循环中。HualinQi等通过比较艾考糊精(葡萄糖多聚体)和葡萄糖对长期腹膜透析病人的影响的随机对照试验研究(RCTs)得出Meta分析【9】结论：艾考糊精可以增加液体及小溶质的清除，但不会影响患者的残肾功能。艾考糊精特别适用于腹膜高转运患者。He0等通过9个RCTs(553个PD病人)得出Meta分析【loj结论：艾考糊精与葡萄糖相比，在维持小溶质转运及血浆总胆固醇水平上有明显优势，但两者在影响空腹血糖、血浆甘油三酯及体重水平上无明显差异。但是Ha等【ll】研究显示不论高糖或葡萄糖多聚体透析液均可促使HPMCs分泌VEGF及原骨胶原IIIN末端缩氨酸(PIIINP)，这些对长期透析患者的腹膜高渗透和纤维化的发展进程产生重大影响。2．1．2氨基酸氨基酸可替代葡萄糖在PDS中充当渗透剂，其平均分子量约为100，在溶液中解离后带负电荷，与腹膜的负电荷相互排斥，因此，与葡萄糖相比，吸收率低，超滤作用维持时间较长。其酸碱度较高(PH6．2)更接近生理，可以减少对腹膜的刺激，同时可以改善腹膜透析患者的营养状况，并能更好地维持HPMCs在细胞存活能力、细胞粘附功能及蛋白合成等方面的功能。在PDS中添加氨基酸可以减少一系列因普通PDS引起的改变，包括由GDP和／或AEG导致的腹膜损伤【121。Hideki等㈣通过动物体内试验观察到，与以葡萄糖为渗透剂的PDS相比，以牛磺酸为渗透剂的PDS有相同的净超滤量，但对于腹膜而言具有更好的生物相容性。其主要不足在于可以引起高氮质血症和轻微酸中毒，故需要监测血浆总 温州医学院硕士学位论文C02水平及提倡每天使用一次氨基酸PDS。2．2缓冲碱2．2．1碳酸氢盐碳酸氢盐是机体本身生理性的缓冲物质，刺激性较小，是目前临床上最理想的PDS缓冲碱。但是由于碳酸氢根在加热过程中可与钙、镁等反应产生沉淀，因此，传统PDS使用乳酸盐作为缓冲碱。近年来，基于传统PDS进行改良的双室双袋PDS逐渐在临床应用。一腔装缓冲碱溶液，另一腔装葡萄糖和钙、镁离子等酸性溶液，在进行腹膜透析前迅速混合灌入腹腔。主要优势：①将缓冲碱和葡萄糖分隔包装，使高浓度葡萄糖处于低PH环境(2．8．3．2)，从而最大限度降低了透析液中GDP的产生。②使透析液混合后的PH值在7．0～7．4之问，较传统PDS更符合人体生理状态。③双室双袋PDS的分隔包装则使碳酸氢盐作为缓冲碱成为可能。与传统PDS相比，以碳酸氢盐为缓冲碱的PDS可显著降低腹膜间皮细胞TGF．131的分泌，还可以显著减少腹膜AGE沉积，从而延缓PF的发生【HJ。BajoMAt”1通过体外及体内实验研究表明，与传统PDS相比，低GDP的PDS可以更好地保护腹膜的完整性。Marios【16】对12个稳定的持续非卧床腹膜透析(CAPD)病人进行1年的前瞻性观察研究显示，以碳酸氢盐作为缓冲碱的PDS可以明显改善患者左心室的结构和功能，还可以改善净超滤量。以上作用对于腹膜透析病人心血管疾病的发生率和死亡率起了很好的保护作用。2．2．2丙酮酸盐与乳酸盐对细胞的作用不同，乳酸盐是一种强还原剂，而丙酮酸盐是强氧化剂。高浓度的丙酮酸盐可竞争性抑制高糖引起的多元醇代谢通路的激活。但其确切的应用前景尚需进行大量的临床研究。Roos等的体内动物实验研科17】显示，以丙酮酸替代乳酸盐作为缓冲碱的PDS，可以明显减轻腹膜的血管再生及纤维化。2．2．3柠檬酸盐Nicola等[18】通过动物体内实验研究显示用柠檬酸盐替代乳酸盐作为PDS的缓冲碱，可以增加超滤作用并呈剂量依赖性。2．3电解质2．3．1钙在体内外试验中，高钙(1．75mmol／L)可促进HPMCs增殖，同时加重细胞损伤，促进FN合成，而生理浓度钙(1．25mmol／L)对HPMCs有一定保护作用并可能预防pFI引。根据该结果，临床上不推荐长期使用高钙PDS，建议仍以使用低钙PDS为主，同时予以1，25．二羟维生素D3及钙剂纠正低钙；对存在严重 温州医学院硕士学位论文低钙血症、骨质疏松等病变的患者必要时可短期和间断地使用高钙PDS。美国NKF．K／DOQI2003年关于慢性肾脏病骨代谢及其疾病的临床实践指南建议，PDS的钙离子浓度为1．25mmol／L，以减少高钙血症及继发的血管和软组织钙化【19】。YamamotoH等通过对333个腹膜透析机构的2384例CAPD患者(CAPD维持时问为44．1月+一39．2月)的问卷调查【201显示，低钙PDS不会引起高钙血症的发生，但是甲状旁腺激素(parathyroidhormone，PTH)水平通常不能维持在一个可接受的范围。这项调查研究提示为减少CAPD患者矿物质和PTH紊乱的发生率，尚需要进一步研究PDS的钙浓度。3．展望近来有不少研究，试图在PDS中添加相关物质以减少PF等不良反应。例如：WashidN等【2l】通过动物体内实验研究，表明腹膜的损伤在多个阶段均与Rho．激酶的活化有关，包括组织的纤维化和血管发生。Rho．激酶抑制剂将成为PF治疗的新策略。LoureiroJ等【221通过动物体内试验，显示TGF．§1阻滞肽可以减少间皮．问充质转分化，改善PF及血管再生。KihmLP掣冽通过动物体内实验研究显示，在尿毒症大鼠PD模型中，苯磷硫胺可以减少AGE、炎症因子的产生及新生血管形成，最终可以预防PF。但是，这些物质是否能运用于临床还尚需大量实验研究来考证。未来的新型PDS，除了须改善其生物不相容性，以预防PF等不良反应外，还须在改善患者的营养状况，保护残肾功能，提高患者生存质量及延长生存时间等方面不断努力。 温州医学院硕士学位论文参考文献f1】YuMA，ShinKY,KimJH，eta1．HGFandBMP-7amelioratehighglucose-inducedepithelial·to-mesenchymaltransitionofperitonealmesothelium．JAmSocNephrol2009．20：567．581．[2】LeungJC，ChanLY,TamKYeta1．RegulationofCCN2／CTGFandrelatedcytokinesinculturedperitonealcellsunderconditionsstimulatingperitonealdialysis．NephrolDialTransplant．2009，24(2)：458-69．【3]KangDH，HongYS，LimHJ，eta1．Highglucosedolutionandspentdialysatethesynthesisoftransforminggrowthfactor一13lofhumanperitonealmesothelialcells：effectofcytokinecostimulation．PeritDialInt．1999，19：221—30．【4】KsiazekK，PassosJF,OlijslagersS，eta1．Mitochondrialdysfunctionisapossiblecauseofacceleratedsenescenceofmesothelialcellsexposedtohighglucose，BiochemBiophysResCommun．2008，366(3)：793—9．[5]DaviesSJ，PhillipsL，NaishPEeta1．Peritonealglucoseexposureandchangesinmembranesolutetransportwithtimeonperitonealdialysis．JAmSocNephrol，2001，12(5)：1046—1051．[6】CnossenTT,GladziwaU，SchalkwijkCG,eta1．Theinfluenceofbicarbonate／lactate．bufferedPDfluidsONN{varepsilon}-(carboxyethyl)lysineandN{varepsilon}一(carboxymethyl)lysineinperitonealeffluent．PetitDialInt．2011，31(2)：189—193．[7]LibettaC，EspositoP，Sepe、‘eta1．EffectsofdifferentperitonealdialysisfluidsontheThl／Th2balance．EurCytokineNetw．2011，22(1)：24．31．【8]彭翔，刘伏友，李军等．钙对人腹膜间皮细胞损伤，增殖及纤维连接蛋白合成的影响．中国血液净化．201l。10(3)：154．159．【9】QiH，XuC，YahH，eta1．Compasrisonoficodextrinandglucosesolutionsforlongdwellexchangeinperitonealdialysis：Ameta—analysisofrandomizedcontrolledtrials．PeritonealDialysisInternational．2011，31(2)：179—188．[101HeQ，ZhangWjChenJ，etal，AMata-analysisoflcodextrinversusglucosecontainingperitonealdialysisinmetabolicmanagementofperitonealdialysispatients．RenFail．201Sep19．【Epubaheadofprint】．【11]HaH，ChaM，ChoiH，eta1．Effectsofperitonealdialysissolutionsonthesecretionofgrowthfactorsandextracellularmatrixproteinsbyhumanperitonealmesothelialcells．PeritDialInt．2002，22：171-177．[12]ZareieM，TangelderGJ，SchalkwijkCG，eta1．BeneficialeffectsofaminoguanidineonperitonealmicrocirculationandtissueremolellinginaratmodelofPD．NephrolDial 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温州医学院硕士学位论文腹痛、发热、皮肤黄染和瘀斑伴尿少吴旭1缪初升2黄朝兴3温州市医学会肾脏病学分会于2010年10月在浙江省瑞安市举行了每季度一次的疑难病例讨论会。现将病例和讨论情况整理报告如下。病史摘要患者，女，44岁。因腹痛伴发热4天于2009年7月24日收入瑞安市人民医院。患者于入院前4天无明显诱因出现持续性右中上腹胀痛，放射到右侧腰背部，伴发热(体温未测)皮肤瘀点、瘀斑和呕吐，呕吐物为胆汁样物，无畏寒或寒战。曾在当地诊所静脉滴注林可霉素治疗，无好转。伴有乏力、纳差、尿少、便秘。7～8年前曾有“肾结石”史。无药物过敏史，否认传染性肝炎史。入院查体T：37．2℃，P：79次／分，R：24次／分，BP：160／100mmHg，神清，皮肤黄染，无肝掌或蜘蛛痣。全身浅表淋巴结无肿大。结膜稍苍白，巩膜黄染。心肺听诊无特殊，腹部平软，右中上腹压痛和反跳痛阳性，肝脾未及，Murphy征阳性，移动性浊音阴性，肠鸣音正常。实验室检查血WBC：9．5×109／L，N：80％，RBC：3．21X10”／L，Hb：96g／L，PLT：26X109／L，网织红细胞7．9％。肾穿刺术后尿常规：比重1．010，PH6．0，尿亚硝酸盐阴性，尿蛋白3+，红细胞3+／HP，白细胞2～3／HP，尿糖、尿酮体、尿胆原、尿胆红素和管型均(一)。大便潜血：阴性。血谷丙转氨酶：75U／L，谷草转氨酶：158U／L，自蛋白：40．0g／L，球蛋白：24．4g／L，总胆红素：70．6umol／L，直接胆红素：15．2IJ-mol／L，间接胆红素：55．4IXmol／L，葡萄糖8．75mmol／L，尿素氮31．06mmol／L，肌酐701umol／L，钠137．2mmol／L，钾3．86mmol／L，氯102．0mmol／L，钙2．07mmol／L，磷1．i1mmo]／L，镁0．83nunol／L，甘油三酯1．55mmol／L，总胆固醇3．48mmol／L：CRPIi．3mg／L：凝血功能：PT13．5秒，PT活动度73％，国际标准化比率1．13，纤维蛋白原1．07g／L，APTT25．7秒，凝血酶时问19．8秒，D一二聚体0．6mg／L；肌酸激酶299U／L，肌酸激酶MB同工酶22U／L，乳酸脱氢酶3220U／L。血清补体C3：0．57g／L，补体C4：0．09g／L。乙型肝炎病毒表面标志物定性：乙型肝炎病毒表面抗体阳性，其余阴性。血涂片：红细胞大小轻度不一，红细胞碎片、盔形红细胞较易见约占2％--3％，多色性红细胞较易见。血触珠蛋白<0．0583g／L。血培养：5天无细菌生长，未检到厌氧菌。内毒素小1温州医学院附属第一医院肾内科硕士研究生，2温州医学院附属第三医院肾内科，主任医师，3温州医学院附属第一医院肾内科教授Emai1：lcyxwx@sina．corn通信作者．grmil：miaochusheng@126．com42 温州医学院硕士学位论文于lpg／ml，G试验小于5pg／ml。血IgG、IgA、IgM、ANA系列、ENA系列、ACA、P-ANCA、C-ANCA、B-HCG和抗人球蛋白试验等均正常或阴性。辅助检查B超：胆囊增大，胆汁淤积，双肾弥漫性损害，腹腔少量积液。住院经过入院后患者即呈无尿状态，体温波动于37．5。C左右。7月25日血小板下降至17×109／L，7月28日Hb下降至52g／L，肌酐895umol／L，AST261U／L，总胆红素158U／L。8月1日肝酶恢复正常；8月4日血胆红素和血小板均恢复正常；8月5日行肾活检术。骨髓检查：增生明显活跃，红系明显增生，多色性红细胞较正常易见，可见红细胞碎片，巨系增生伴成熟障碍。一肾活检病理所见LM：肾穿刺组织1条，为肾皮质和髓质组织，共见9个肾小球，其中1个’肾小球废弃。其余肾小球体积偏大，部分肾小球毛细血管丛略萎缩伴毛细血管壁略增厚及球囊腔扩张。个别肾小球节段性球囊粘连。较多肾小管上皮细胞刷状缘脱落、扁平化、管腔扩张，部分肾小管上皮细胞浊肿、空泡变性，部分肾小管扩张腔内见蛋白管型，小灶状肾小管萎缩；灶状肾间质轻度水肿；灶状入球小动脉内皮细胞增生肿胀、内皮细胞耸立、内膜增厚伴管腔狭窄。IF：2个肾小球。IgM和补体Clq：弥漫性肾小球毛细血管壁颗粒状(±)；IgG、IgA、补体C3和纤维蛋白原：均阴性。见图1和图2。住院期间先后给予头孢哌酮、头孢哌酮／舒巴坦、替硝唑和泰能等抗生素静脉输注，甘利欣护肝，输血，血液透析，支持和对症治疗等。图1．PASM染色(×20) 温州医学院硕士学位论文图2．HE染色(×10)讨论乐清市人民医院医师：该病例特点为：①急性起病；②上腹痛、发热、Murphy征阳性，血中性粒细胞升高，腹部B超：胆囊增大，胆汁淤积；③皮肤瘀点瘀斑，血小板明显减少；④胆红素明显升高，以间接胆红素升高为主；⑤血Hb明显下降，乳酸脱氢酶明显升高，血涂片可见破碎红细胞，触珠蛋白<0．0583g／L；⑥无慢性肾脏病史，短时间内血肌酐急剧升高。因此，急性胆囊炎、急性肾衰竭(ARF)和微血管病性溶血性贫血的诊断基本明确。鉴于血小板明显下降，结合急性肾衰竭及微血管病性溶血性贫血的表现，要考虑存在血栓性微血管病(TMA)。温州医学院附属育英儿童医院医师：同意该例存在TMA。按病因和发病机制，TMA主要分为TTP(血栓性血小板减少性紫癜)和溶血性尿毒症综合征(HUS)，二者临床表现难以鉴别。该例肾损害突出，无神经系统症状，较符合HUS；Coombs试验阴性，可排除Evan’S综合征；无腹泻，可考虑为非典型HUS(D-HUS)。为明确TMA的病因诊断，可做超大VWF多聚体、ADAMTSl3活性及其抗体、补体因子H、补体因子I、膜辅助因子蛋白和大肠杆菌0157：H7多糖抗体等血清学检测，大便培养，大便检测大肠埃希菌0157：H7及其类志贺毒素(Stx)等。．缪初升医师：该例有微血管溶血性贫血、血小板减少和ARF，HUS诊断明确。患者入院前有林可霉素用药史，是否由林可霉素导致HUS'?查阅国内外文献，未见由林可霉素类抗生素致HUS的报道，但可见林可霉素类抗生素分别导致溶血性贫血、血小板减少或ARF的个案报道。林可霉素引起的ARF多属急性过敏性间质性肾炎，该例肾活检病理不支持；该例在使用林可霉素前已经出现皮肤瘀点瘀斑，可排除林可霉素参与HUS。温州医学院附属第一医院医师：感染为BUS最常见的病因，该例以急性胆囊炎首发，HUS是否为感染所致?急性胆囊炎最常见的致病菌是大肠埃希菌。国外曾有个案报道⋯HUS合并由产Stx的大肠埃希菌感染的急性胆囊炎。本例是否属于同类情况，可查血清大肠埃希菌0157：H7多糖的抗体以协助诊断。 温州医学院硕士学位论文温州市第三人民医院医师：该例急性肾衰竭诊断明确。患者无脱水的诱因，泌尿系B超显示无输尿管或集合系统扩张，可排除肾前性和‘肾后性因素，考虑肾实质性ARF。导致肾实质性ARF的主要原因有：肾小球疾病、肾小管间质疾病及肾血管疾病等。患者在无尿情况下呈低比重尿，结合肾活检病理所见，需要考虑ARF由急性肾小管问质损伤引起。但是，该例临床和病理均不支持由感染直接导致ARF。此外，该例没有呈现‘肾小血管血栓等TMA的典型病理改变，如何用HUS的“一元论’解释ARF?黄朝兴医师：TMA的肾脏病理检查主要有以下三种表现：①肾小球病变：系膜增宽．毛细血管壁增厚、内皮细胞肿胀、管腔狭窄、内皮下间隙扩大可出现双轨征，可伴有广泛毛细血管微血栓形成：②肾小动脉病变：小叶间动脉血栓形成、动脉内膜水肿、肌内膜细胞增生，伴肾小球缺血性改变；③肾小球及。肾小动脉病变同时存在。无论以何种表现为主，均不伴有明显的细胞增生或炎细胞浸润。免疫荧光及电镜检查可见血栓以纤维蛋白成分为主，基底膜内疏松层增宽，内皮下可见绒毛状透明疏松物质心，。当缺乏特征性病理改变支持临床诊断时，肾活检病理诊断更需要充分结合临床。该例临床和病理都明显提示存在急性肾小管坏死，临床上最常见导致急性肾小管坏死的病因机制是中毒和缺血，后者除了有效血容量降低的最常见原因以外，也可以来自肾小血管病变。该例肾活检虽然未呈现TMA的典型病理改变，但还是存在与TMA相关的肾小动脉轻微病变，即入球小动脉内皮细胞增生肿胀，伴肾小球缺血性改变。因此，该例ARF乃应考虑由TMA所致。除肾小动脉的TMA病变以外，溶血所致的胆红素升高也可能参与该例急性肾小管损伤。温州市第二人民医院医师：对于产Stx大肠埃希菌感染所致的I-IUS是否应用抗生素治疗尚有争议。有研究认为，抗生素治疗不能改善大肠埃希菌感染相关的HUS，相反还可能加重出血性腹泻，增加St)【毒素释放。但是近年的荟萃分析口1并未发现使用抗生素会增力HHUS的发生风险。该例急性胆囊炎若不及时给予抗感染治疗，可能会出现危及生命的败血症。考虑到患者已出现急性肾衰表现，应选择肾毒性较小的抗生素。温州医学院附属第一医院许菲菲教授：HUS在国外为常见病，尤其在d、JLARF中占首位；与过去呈暴发性不同，现多呈散发性发作。经典型HUS(D+HUS)常有前驱的血性腹泻，是由于感染了产Stx的肠出血性大肠埃希菌所致。D-HUS在所有年龄都可见，但在成年患者中更常见。D-HUS预后较差，50％患者进展到终末期肾病或遗留不可逆的神经系统症状，25％患者在急性期死亡。在D—HUS的患者治疗上，公认应采用血浆置换或血浆输注以减少死亡和长期后遗症的危险。TMA发病机制迄今未明确，可能是多种机制联合作用，包括血管内皮细胞损45 温州医学院硕士学位论文伤、凝血纤溶障碍、血小板活化、自身免疫反应以及遗传因素等。现认为，很可能是自身免疫条件和补体调节蛋白(包括补体因子H、补体因子I、膜辅助因子蛋白)的遗传缺陷所致H3。目前的HUS研究热点是寻找针对HUS原发病因的特异性治疗方法，如抑制补体已成为治疗HUS的一个新靶点。现已开发研制成功的补体抑制剂在临床和临床前研究中均显示出良好的疗效及应用前景。转归：明确诊断后继续抗感染治疗，先后改头孢曲松、头孢他啶和拜复乐静脉给药；同时给予甲基强的松龙和CRRT等治疗，但是患者因经济原因拒绝接受血浆置换疗法。8月9日出现多尿，8月14同后尿量达1000ml以上。8月20日患者因经济原因自动出院。出院时病情已明显好转，Hb87g／L，血肌酐422umol／L，糖皮质激素和抗生素均已停用。出院诊断：(DHtJS，急性肾衰竭；②急性胆囊炎。 温州医学院硕士学位论文参考文献1．KazunoriYoshida,MasahiroArakawa．Acaseofhemolyticuremicsyndromeassociatedwithemphysematouscholecystitisandaliverabscess．TohokuJExpMed，1998，185(2)：147—1552。BellamyCO．Microangiopathiesandmalignantvascularinjuryinthekidney．CurrentDiagnosticPathology,2004，10(1)：36—513．SafdarN，SaidA．RiskofhemolyticuremicsyndromeafterantibiotictreatmentofEscherichiacoli0157：H7enterRis：ameta—analysis．JAMA，2002，288(8)：996-100l4．NadiaLeban，SabraAloui．AtypicalhemolyticuremicsyndromeintheTunisianpopulation．InternationalUrologyandNephrology,2010，5．2547 温州医学院硕士学位论文学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。作者签名：昊心日期：作者签名：走n■日期：关于学位论文使用授权声明山7多．F．如本人完全了解温州医学院有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于菲赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。戮纂黧：炎枷学位论文作者签名：灵曲9．)^妒功，～，一恐／∽鸦∥髟∥J轹瓤雌