食管鳞癌放射敏感性相关mirna的筛选及验证

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目录食管鳞癌放射敏感性相关miRNA的筛选及验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．4食管鳞癌放射敏感性相关miRNA的筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．4．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．4．2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯171．5miR一203与食管鳞癌TE一1细胞放射敏感性的相关研究⋯⋯⋯⋯221．5．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯221．5．2结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯341．6全文讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯381．7全文小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯431．8参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯441．9中英文对照⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l23致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯·⋯⋯⋯⋯52微小RNA与食管癌放射敏感性的相关研究(综述)⋯⋯⋯⋯⋯53 泸州医学院硕士学位论文食管鳞癌放射敏感性相关miRNA的筛选及验证摘要lIlllllqIlllUqIllllqIIllIlllIilIIlllY2602289研究背景与目的：食管癌的治疗主要是手术治疗、放疗、化疗，但由于其早期症状隐匿，就诊时绝大部分的食管癌患者已属于中晚期失去了手术时机，故放射治疗成为了食管癌主要及其有效治疗手段之一。不同食管癌个体之间其放疗敏感性存在差异，由此导致了放疗疗效的差异，因此预测食管癌放射敏感性具有重要的意义。研究显示不同放射敏感性的食管癌细胞具有差异的miRNA表达谱，那不同放射敏感性食管癌组织是否也具有差异表达的miRNA，机制又如何。有研究显示Bmi．1高表达与食管癌放射抵抗密切相关，生物信息软件分析示Bmi．1是miR-203的靶基因之一。本实验旨在研究不同放射敏感性的食管鳞癌病人miRNA的表达差异及miR-203是否能通过下调Bmi．1的表达来增加食管鳞癌TE．1细胞的放射敏感性。方法：1．根据RECIST指南(1．1版本)标准将6例通过同步放化疗的食管鳞癌病人分为敏感组和不敏感组，收集治疗前组织标本并进行配对。应用miRNA芯片检测两组标本miRNA的表达差异，预测其可能的靶基因，选取其中的miR-374c一5p进行食管癌细胞株TE．1的转染，qPCR检测其预测的靶基因CD47，CYFIP2的表达情况。2．结合文献及芯片结果选取miR-203和其靶基因Bmi．1为进一步实验对象，采用LipofectamineTM2000脂质体瞬时转染miR-203模拟物(miR．203mimic)及阴性对照转染序列(miR．203NC)进入食管鳞癌TE．1细胞中，miRNA．203mimics和miRNA．203NC浓度均为50nmol／L，实验共设31 泸州医学院硕士学位论文组，即miRNA．203mimic转染组、miR-203NC转染组、空白对照组。Westernblot检测Bmi．1蛋白的表达情况，单克隆实验检测TE．1细胞的增殖情况。结果：1．与放射不敏感组比较，放射敏感组中有2个miRNA表达上调超过1．5倍，为miR-1272，miR-5571—5p；有8个miRNA表达下调超过1．5倍，为miR·125b-1-3p，miR-5002—3p，miR-374c一5p，miR-3680-5p，miR-3908，miR-4292，miR-1915—3p，miR-4516。研究显示其中miR-125b-1-3p与多种肿瘤发生、发展及其放化疗敏感性密切相关。2．miR-374c一5p预测的靶基因为CYFIP2，DDIT4，CD47，PTTGl，TNFRSF25，cyclinE2等，这些靶基因与肿瘤凋亡、发生、发展及其预后密切相关。3．qPCR结果显示，与阴性对照组相比，转染组CD47和CYFIP2的表达未见明显降低，差异无统计学意义(P)0．1)。4．Westernblot结果显示，与阴性对照及空白对照组分别比较，转染组中Bmi．1明显降低，差异具有统计学意义(P<0．001)；阴性对照组与空白组比较，Bmi．1有所降低，但差异无统计学意义(P)O．01)。5．克隆形成实验表明过表达miR-203可增加食管癌细胞TE．1放射敏感性。转染组，阴性对照组，空白组的DO依次为1．498、1．6295、1．7，Dq依次为1．3335、1．8578、1．9715，、SF2依次为0．6065、O．73668、O．74595，O／B依次为3．8165、1．0270、1．1409。转染组中DO、Dq、SF2均有所降低，a／13有所升高，差异均具有统计学意义。结论：2 泸州医学院硕士学位论文1．本研究筛选出的10个差异表达的miRNA可能和食管鳞癌放射敏感性相关，其中miR-125b．1．3p与多种肿瘤发生、发展及其放化疗敏感性密切相关，在miR-374c．5p预测的靶基因中CD47、CYFIP2、DDIT4和PTTGl与肿瘤密切相关。2．miRNA．203可通过下调Bmi．1增强食管鳞癌TE．1细胞的放射敏感性。关键词：食管鳞癌，放射敏感性，miR-203，Bmi．1。ScreeningandverificationofrelatedmiRNAofesophagealcancerradiosensitivityAbstractBackgroundandobjective：Themaintreatmentforesophagealcancerincludethesurgicaltreatment，radiationmer印yandchemotherapy．Butbecausetheearlysymptomsofoccult，whentheyweretreated，themostofesophagealcancerpatientsalreadybelongtoadvanced，SOlosingthechanceofoperation，theradiationtherapybecameoneofthemainandeffectivetreatmentforesophagealcancer．Therearedifferencesinradiosensitivityofesophagealcancerindividuals，whichledtoadifferenceintheefficacyofradiotherapy,SOpredictingtheradiosensitivityofesophagealcancerhasimportantsignificance．StudieshaveshownthatesophagealcancercellsofthedifferentradiosensitivitywithdifferencesinmiRNAexpressionprofilesWhetherornotesophagealcarcinomaofthedifferentradiosensitivityhasalsodifferentiallyexpressingmiRNA，mechanismsandhow．Studieshaveshownthathi曲expressionofBmi一1iscloselyassociatedwiththeradioresistanceofesophageal3 泸州医学院硕士学位论文cancer．BioinformaticssoftwareanalysisshowsBmi-1isoneofthetargetgenesofmiR-203．Theaimofexperimenthavetwo：AistostudyesophagealcancerpatientsofthedifferentradiosensitivityhavedifferentmiRNAexpression，Bistowhetherornotthroughdown-regulationtheexpressionofBmi-1，miR一203canenhanceradiosensitivityofTE-1cells．Methods：1．AccordingtoRECISTguidelines(version1．1)standardwill，sixcasesofesophagealsquamouscellcarcinomapatientsbyconcurrentchemoradiotherapyweredividedintoinsensitiveandsensitivegroup，andtissuesampleswerecollectedbeforetreatment．MiRNAmicroarraywasusedtoanalyzedsixcasesofesophagealsquamouscellcarcinomapatientsbiopsyspecimensandpredicttheirtargetgenes．ThemiR-374c-5pwastransfectedtooesophagealcancercelllinesTE-1．RT-PCRwasusedtodetecttheexpressionoftargetgenesCD47，CYFIP2．2．Combiningtheresultsofthechipwiththeliterature，miR-203andBmi一1wereselectedtodofurtherexperiments．ThemiR-203mimicsandnegativecontroltransfectionsequenceweretransfectedintoTE-1cellswithLip02000liposome．Theexperimentwasdividedintothreegroups：miR一203mimics—transfectedgroup，negativecontrol-transfectedgroup，andblankcontrolgroup．WesternblotassaywasconductedtodetectBmi-1expresionalternation．Clonogenicassaywasusedtomeasurethemitoticcelldeath．Results：1．Comparedwiththenotsensitivegroup，twomiRNAs(miR-1272，miR·-5571--5p)wereup--regulmedmorethan1．5times；eightmiRNAs4 泸州医学院硕士学位论文(miR-125b一1—3p，miR-3680-5p，miR-5002—3p，miR-374c-5p，miR一3908，miR-4292，miR-1915-3p，miR-4516)weredown-regulmedmorethanI．5times，intheradiation-sensitivegroup．StudieshaveshownthatmiR-125b-1—3piscloselyrelatedtocancerdevelopmentandchemoradiationsensitivity,2．CYFIP2，DDIT4，CD47，PTTGl，TNFRSF25andcyclinE2aremiR-374c一5predictedtargetgenes．Thesetargetgenesarecloselyrelatedtotumorapoptosisoccurs，thedevelopmentandprognosis，3．Comparedwiththenegativecontrolgroup，theexpressionofCD47andCYFIP2didnotsignificantlyreducedinthetransfectiongroup，4．Westernblotresultsshowedcomparedwiththenegmivecontrolandblankcontrolgroup，Bmi一1wassignificantlylowerinthetransfectinggroup，andthedifferencewasstatisticallysignificant(，PO．05)5．ClonogenicassayshowedtheoverexpressionofmiR-203couldenhancetheradiosensitivityofTE-1cells．IntheExperimentalgroup，negativecontrolgroup，andblankcontrolgroupDOwere1．498，1．6295，1．7，andDqwere1．3335，1．8578，1．9715．InthethreegroupSF2were0．6065，O．73668，O．74595，anda／13were3．8165，1．0270，1．1409．IntheexperimentalgroupDO，Dq，SF2weredecreased，and“pwasincreased．Thedifferenceswerestatisticallysignificant．Conclusion：1．10differentiallyexpressingmiRNAmayberelatedtotheradiosensitivityofesophagealsquamouscellcarcinomainthisstudy,which5 泸州医学院硕士学位论文miR一125b-1-3piscloselyrelatedtocancerdevelopmentandchemoradiationsensitivity．CD47，CYFIP2，DDIT4andPTTG1aretargetgenesofmiR-374c一5p，andtheretargetgenesarecloselyrelatedtotumor．2．Throughdown-regulmionBmi-1，miR-203canenhanceradiosensitivityofTE．1cells．KeyWords：esophagealsquamouscellcarcinoma，radiosensitivity,miR-203．．．▲上··J‘月IJ吾食管癌是我国常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下，分别为第五位和第四位‘11。食管癌主要有三大治疗手段，分别为手术治疗、放疗、化疗，但由于其早期症状隐匿，就诊时绝大部分的病人已属于中晚期失去了手术时机，故放射治疗成为了食管癌主要及其有效的治疗手段之一。影响食管癌放疗疗效的因素很多，例如肿瘤的长度、分期、病理类型、放疗方案、照射剂量、病人的身体素质等，其中最重要的是食管癌细胞对放射线的敏感性不高，故怎样提高食管癌放射敏感性至关重要。miRNA为长约18．24个核苷酸的非编码单链RNA分子，在真核生物中广泛存在，其可在转录后水平通过与靶mRNA结合或直接降解mRNA来抑制靶基因的翻译，最终干扰编码蛋白基因的表达，miRNA这类调控作用是通过与靶mRNA的37端非翻译区的完全或不完全互补来完成的121。研究显示，与对应的正常细胞比较，癌细胞具有不同的miRNA表达谱，这些异常表达的miRNA与肿瘤的发生、发展密切相关，且在其中发挥着原癌基因或抑癌基因的作用‘34】。miRNA广泛参与了食管癌的发生、发展及预后，研究显示‘5’71下调miR．21可抑制食管癌细胞生长、侵袭和促进细胞凋亡，miR-143在食管癌6 泸州医学院硕士学位论文组织中低表达，且miRA．143的表达与肿瘤侵袭长度和淋巴结转移情况负相关，体外细胞实验显示miR．143抑制了食管癌细胞生长和促进细胞凋亡，miR．142．3p的表达与食管癌预后正相关，且miR．142．3p是食管癌患者术后独立的预后因子。另据研究【8。91，miR-150的表达与预后正相关，miR-483和miR-214的表达量和总的生存率呈负相关。除此之外，miRNA与食管癌的放射敏感性也有一定相关性。研究证实，耐放射细胞株KYSE．150R与其亲本比较，两者具有差异的miRNA表达谱，其中表达上调超过2倍的miRNA有10个，为miR．22、miR-33b、miR-92b等；表达下调超过2倍有25个，为miR．141、miR．185和miR-301a等；进一步证实，miR-301a的表达下调可引起食管癌细胞放射耐受，其主要机制是miR-301a的表达下调增加了Wnt／p．catenin信号通路的活性【101。如前所述，不同放射敏感性食管癌细胞具有差异的miRNA表达谱，那不同放射敏感性食管癌组织是否同样具有差异表达的miRNA，其机制又如何，这方面的研究比较少且不够深入，Ko[111等采用miRNA芯片比较了同步放化疗敏感和抗拒的食管癌病人治疗前组织标本的miRNA表达差异，结果显示与放化疗抗拒组相比，放化疗敏感组HS一240、hsa—miR一296分别下调2．5和3．2倍，hsa—miR-141、hsa．miR-31、HS．217均上调2倍，这些差异miRNA可能和放射敏感性相关，但具体机制有待进一步探究。本实验采用人类miRNA杂交芯片技术高通量筛选了3对不同放射敏感性食管癌组织的miRNA表达谱，预测差异表达的miRNA所对应的靶基因，分析靶基因与食管癌放射敏感性的相关性，进一步挑选了miR-374c．5p做转染、PCR验证试验。 泸州医学院硕士学位论文分析芯片结果发现与抵抗组比较，敏感组中有2例标本miR．203显著上调其倍数大于2．5倍。研究显示02-13]miR．203在食管癌组织中低表达，可抑制食管癌细胞增殖及侵袭，但与食管癌放射敏感性的研究未见报道。生物信息学软件示Bmi一1为miR-203的靶基因之一，Bmi．1在食管癌放射抵抗组中高表达，敲出Bmi一1后食管癌放射敏感性增加【14】。故结合芯片结果和相关文献，我们选取了miR．203及其靶基因Bmi．1做后期的转染、westernblot及克隆实验。希望通过我们的实验给食管癌放射治疗提供一些新的参考。 泸州医学院硕士学位论文第一部分：食管鳞癌放射敏感性相关mlRNA的筛选材料与方法1主要实验材料1．1组织标本本次研究的6例食管鳞癌的临床病理标本均来自四川省肿瘤医院，病人为2010年3月至2010年12月均给予了非手术同步放化疗，方案：放疗：IMRT：DT60～-66Gy,1．8．-一2．1Gy／F，5f／w，化疗：PF方案DDP75mg／m2，d1．3；5．Fu300mg／m2，dl-3或TP方案TXT75mg／m2，d1；DDP75mg／m2，d1．3。所选患者在同步放化疗前未接受任何治疗，且在样品收集时签署了知情同意书。根据RECIST指南(1．1版本)标准将患者分为放疗敏感组和不敏感组。收集组织样品时，样品取下后速置于液氮中，在液氮罐内保存备用，且在提取RNA之前均需冷冻保存于液氮中。表1是本研究所使用的食管鳞癌病人的配对情况。表1：食管鳞癌患者配对资料Table1：Dateofpairedesophagealsquamouscellcarcinoma1．2细胞系食管鳞癌TE．1细胞株⋯⋯一由四川省肿瘤医院研究所中心实验室提供。 泸州医学院硕士学位论文2主要实验试剂与仪器2．1miRNA芯片本次实验选用Exiqon公司第七代miRCURYTMLNAArray芯片，所需实验试剂及仪器均由上海康成生物有限公司提供主要包括：，氯仿，异丙醇，75％乙醇，无水乙醇，trizol试剂，甲醛，溴酚兰，琼脂糖，miRC切wT池NAArray(v．18．O)，miRCURYTMHy3TM／Hy5TMPowerlabelingkit(Exiqon，Vedbaek，Denmark)，Washbufferkit；离心机，低温冰箱，电泳仪，分光光度计，GenePixPro6．0software(Axon)，AxonGenePix4000Bmicroarrayscanner(Axon)，MEVsoftware(v4．6，TIGR)等，该实验操作及其数据分析均由上海康成生物有限公司完成。2．2miRNAqPCR本次实验选择miR374c．5pmimic及转染指示剂均购白广州锐博科技有限公司所需实验试剂及仪器由上述公司提供主要包括：miR374c．5pmimic，miR374c．5pNC，lipofectamine2000，氯仿，异丙醇，75％乙醇，胎牛血清，RPMI一1640培养基，胰蛋白酶，琼脂糖，PBS，；C02培养箱，离心机，洁净工作台，电泳仪，紫外分光光度计K5500等，该实验操作及其数据分析均有广州锐博科技有限公司。3．实验方法3．1miRNA杂交实验MiRNA芯片简介本实验选用了Exiqon公司的第七代miRCURYTMLNAArray(v．18．0)芯片，此芯片应用锁核酸(LockedNucleicAcid，LNA)技术，在灵敏度和特异性方面都具有较大的优势，即可检测普通DNA作为捕获探针的芯片不能检出的微量microRNA和能够区分单碱基差异的microRNA。上述芯片包含了3100个捕获探针，覆盖数据库miRBasel8．0中人、大鼠、小鼠三个物种的全部miRNA，并且第七代miRCURYTMLNAArray(v．18．O)芯片还包含了人类microRNA数据库中没有的25个人microRNA特有的捕获探针miRPlusTM捕获探针，能提供miRBasel8．0数据库以外的miRNA预测信息。1n 泸州医学院硕士学位论文3．1．1总RNA的提取(肿瘤组织总RNA的提取)1)组织匀浆按0．5—19组织样品对应10ml的T刚zOL试剂的比例将两者进行混合，后用器械充分匀浆。注意组织样品和TRIZOL试剂的体积应控制在1：10左右，样品体积不易过多。2)RNA分离为使核酸蛋白复合体充分解离，将匀浆后样品置于25。C左右环境中孵育6分钟，TRIZOL试剂匀浆的样品与的氯仿按5：1的比例混合，盖好管盖。上下摇晃管体20秒，后25。C孵育4min。将离心管置于4。C、12000rpm下，离一I二,15min，可见分层，移液枪多次少量小心吸取上层水相至新的离心管内3)RNA沉淀为充分沉淀水相中的RNA，将异丙醇与水相等体积混合，混匀后250C孵育10—15min，将离心管置于4。C、12，000xgqi，离一l二,12min。侧壁和管底可见白色的RNA沉淀。4)RNA清洗吸出弃去上清液，加入75％乙醇充分清洗RNA沉淀。轻弹管壁至沉淀脱离管壁为止，将离心管置于4。C，10，000xgT，离心5．10min。5)溶解RNA沉淀吸出弃掉乙醇溶液，在室温下使RNA沉淀半干燥，约5—10min，但时间不易过长，女HRNA沉淀完全干燥将会导致RNA的可溶性降低。向离心管内加入无RNA酶的水，使用移液枪轻轻反复吹打，置于50．600C环境中孵育10．15min。最后将RNA溶液置于．800C保存备用。 泸州医学院硕士学位论文3．1．2RNA质量检测变性琼脂糖凝胶电泳a．制胶72ml水qbJJD)klg琼脂糖充分溶解，冷却至55．60。C，37％的甲醛溶液(12．3M)18ml，10mll拘lOXMOPS电泳缓液(MOPS0．4MpH7．0，乙酸钠O．1M，EDTAO．01M)，将上述溶液灌制凝胶板，胶凝后速取下梳子，后将凝胶板放入电泳槽内，加入适量的1XMOPS电泳缓冲液。b．准备RNA样品将RNA样品与甲醛上样染液按1：3的比例混合，于甲醛上样染液加入EB至溶液终浓度为lOpg／ml。在70。C下孵育15min，使样品充分变性。c．电泳将变性的样品加至胶孔中，电压保持在5“V／cm左右，溴酚兰指示剂进胶至少2—3cm时电泳停止。d．紫外透射光下观察并拍照RNA浓度，OD260／280，OD260／230(利用紫外分光光度计进行浓度和OD值的测定)。3．1．3miRNA标记将2．5xLabellingbuffer89l，Hy3TMfluorescentlabel29lLabellingenzyme29l，RNA5gg和适量Nuclease-freewater，总体积至209l。将上述液体反复吹打混匀，短暂离心，使液体集于管底。先将微型RNA收集管置于O℃孵育-d,时，后于65℃孵育15分钟，最后停止标记。3．1．4浓缩标记样品1)将3509lBufferRLT加入上述微型RNA收集管，移液器轻轻吹打混1， 泸州医学院硕士学位论文匀。2)将3．5倍体积无水乙醇加入收集管，移液器轻轻吹打混匀。3)在微型RNA收集管内每次加入7001．tl样品，在40C、10，000rpm下，离心15秒，吸出弃掉滤出液，重复上述动作直至所有样品离心完毕，每次均去除滤出液。4)每次加入5009l缓冲液，共洗涤三次，洗涤完毕后在4。C、10，000rpm下，离心15秒，吸出弃掉滤出液。5)将上述样品移至一新的收集管，将离心机速度调至最大，在40C下，离心lmin。6)将251．tl水加入收集管内，在4"0、10，000rpm下，离心lmin，最后将已标记的RNA收集备用。3．1．5miRNA芯片杂交根据表2配制溶液A、B、C：1)将2x杂交缓冲液与标记的样品按等体积混合2、)将混合液于95℃孵育约5min。3)将离心机调整最大速度，离心2min。4、)使用70％酒精擦洗BioarrayLifterSlipcoverslip，风干。5)将lOgl水加入HybridizationChamberII两端的小孔中。6)将microarrayslide搁入HybridizationChamberII中，放置时朝上的一面为印有芯片的一面。7)将BioarrayLifterSlipcoverslip完全盖住芯片，20山杂交样品滴入玻片-N，等样品进入玻片两侧时，盖上HybridizationChamberII的 泸州医学院硕士学位论文上盖板，夹上金属夹子，后水平置于60。C水浴锅中，水浴16h。8)16h后将芯片标本和玻片取出。把前者放入洗涤溶液A中，轻轻晃动至BioarrayLifterSlipcoverslip脱落。9)在洗涤液B中放入上述芯片，涮洗一次，后放入一管未用的溶液B中，洗涤2min。最后在洗涤溶液C中晃动2分钟。10)采用1,000rpm下，离心5min的方式干燥芯片。表2：洗涤液A、B、C配制Table2：Washingsolutiona,b，cpreparationWashbuffers20xSaltbuffer10％DetergentsolutionNuclease-freewaterA20mL10mL2ITILB4mLC176mI．190mT．19RmT，3．1．6图象扫描，分析f采用Genepix4000B，GenepixPro6．0，MolecularDevices)采用GenepixPro6．0数据分析软件和Genepix4000B扫描软件分别进行数据分析和图像扫描。图像、应用数据和分析结果分别存为TIF和EXCEL文件。3．2miRNAqPCR3．2．1细胞培养与转染1)培养条件用10％血清、不含双抗1640培养基进行常规培养，2．3天换液或传代一次。2)转染条件a．转染前一天铺板，40000个／24孔板，500uL培养液每孔。b．转染时，根据说明书要求进行转染。其中mimic终浓度为50nM，转染试剂浓度按说明书。详细步骤如下：取100uLOPTI稀释luL转染试剂，lOOuLOPTI稀释mimic，5min后两者混合，混匀，静置20min，然后加到细胞里面。注在加进去之前，每孔吸走300uL培养液，即最终转染体系为400uL。ld 泸州医学院硕士学位论文c．转染48小时后，收集细胞。3．2．2总RNA质检，样品基本信息见表3。表3：样本基本信息Table3：Samplebasicinformation3．2．2．1RNA提取a、)、Tripure裂解：去掉培养基，用冰冷的1XPBS洗2遍后吸干，加入Tripure(1mLTripure／10cm2)吹打后收集到EP管中，室温孵育5min；b、)、向EP管加入O．2体积的氯仿，votex震荡15秒，室温静置lOmin；c)、将EP管置于4℃、12000rpm下，离心15min，可见分层，移液枪多次少量小心吸取上层水相至新的1．5mLEP管内，其中水相体积约占Tripure体积的60％；d)、上清液与异丙醇按1：1比例混合，上下摇匀，．20。静置1h以上；e、)、在4℃，12000rpm下，离心15min，管底和管壁可见RNA白色沉淀，去掉上清；D、加入75％的乙醇lmL，反复轻弹管壁使沉淀脱离管壁，在4"C、12000rpm下，离心15min；g)、去掉上清后短暂离心，使用lOul枪吸干，将离心管盖打开干燥，待沉淀干燥至半透明状即加入适量灭菌水溶解。3．2．2．2RNA质检a)RNA浓度，OD260／280，OD260／230(利用紫外分光光度计K5500进行浓度和OD值的测定)表4：样品RNA紫外分光光度计检测结果Table4：TestresultsofsampleRNAUVspectrophotometer 泸州医学院硕士学位论文b)100V恒压条件下电泳25min从电泳结果来看，实验样本RNA提取质量均较好，可以进行后续测试。3．2．3Q．PCR检测流程；3．2．3．1cDNA反转录a)以细胞提取的总RNA作为模板，建立如下反应体系：RTbuffer5X2止，dNTPmix(2．5mMeach)1．6laL，RNaseinhibitor0．2止，RT逆转录酶O．2uL，RTprimerlpL，RNAtemplate1此，RNase-freeH204pL，总共1O儿。b)以上体系混匀，离心收集液体至管底，42。C60min，70。C10min；产物即为cDNA模板。3．2．3．2定量PCRa)建立如下反应体系：剐Nase—freeH201．6ULForwardprimer(5rtM)0．21．tLReverseprimer(50M)0．2此SYBRGreenSurpermix5此cDNA模板3．0laL总量lOuLb)按如下程序进行PCR扩增16 泸州医学院硕士学位论文95℃3min，*95℃10s，60℃30s，70℃10s读板，返回搴共进行40个循环，制作熔解曲线：70。C至95。C之问，每0．5℃读板一次并停5s。结果1．miRNA芯片结果1．1总RNA的质量及定量检测分析紫外分光光度计检测结果如表5，显示六个样本的OD260／280值接近2，且OD260／230值大于1．8。电泳结果示样本28s、18srRNA两个条带清晰，比值约2：1(如图1)，证明RNA质量较好未被污染，检测结果合格符合miRNA芯片要求，可以进行下一步芯片杂交实验。表5：样本紫外分光光度计检测结果Table5：TestresultsofUVspectrophotometersample 泸州医学院硕士学位论文图1：样本凝胶电泳结果从左至右样本依次为1到6Figurel：Samplegel+electrophoresis2．miRNA在样品中的差异表达通过对miRNA芯片的扫描(图2)可以直接观察到6个样品通过荧光标记的miRNA表达谱。oI 泸州医学院硕士学位论文hsa-miR—-3908hsa--miR—-374c—。5phsa--miR--1272hsa-miR-—125b—。1。。3phsa--miR——3680。。5phsamiR—-5571—‘5phsa-miR——4292hsa-miR—。1915—。3phsa-miR-5002—3phsa-miR-4516图3：分层聚类图Figure3：hierarchicalclusterdiagram表6：部分差异表达的miRNATable6：SomedifferencesinmiRNAexpressionsons●t●v●-V-Intor●●—■●DI～lLlammo．v●46363hsa—m●R一12721．718082168834hsa．miR．5571．5P1．612213■●n-i稍VQ●．V--n●●n●m¨DN|m●VO145838hsa—miR一125b一1'3p0．5S127148599hsa．mjR．3680．5po．322764168656hsa—miR一5002—3P0．601534148430hsa．m●R．374C．5po一472274148398hsa—miR一39080．154335147600hsa—miR．42920．584355146068hsa—m●R一1915—3P0．612762168802hsa—m●R．4516一o．454716P—VaIU●ilionll-H■vQ’。V●lr■●k●nI—■’、憎o，01。4542o．04785P—VIlu●-●●r饵●t蜃v●Vl-n●●n■fa、，●o．009420．040288o．007074o—045207o．031822o．043023o．037828o．027087，注：表上半部分为上调miRNA，下半部分为下调miRNA2．miRNAqPCR结果转染miR-374c-5pmimic和miR．374c．5pNC48h，采用qPCR检测靶基因CYFIP2，CD47的表达情况，以GAPDH作为内参照。其中GAPDH，CYFIP2，CD47，hsa-mir-374c在各样本中扩增曲线与溶解曲线见下图4，GAPDH，19 CYFIP2，CD47，hsa—mir-374c在各样本中的表达情况对比分析见图5、6、7。结果采用SPPSAl8．0统计软件进行分析，两组之间比较用t检验，PO．01)。详见图9。3miR-203对TE-1放射敏感性的影响根据线性二次函数模型[SF=e^(．QD．BD2)]拟合剂量．生存曲线和单击多靶数学模型[SV=1．(1．e。叻o)N]，计算出三组细胞DO、N、Dq、0【、p、0【伊、SF2和放射增敏比(SEP-d)0)等放射生物学参数见表2，3。其余两组肩宽较实验组变宽，实验组中DO，Dq和SF2降低，Q／13增高，放射增敏比(SEPd)0)为1．23，表明实验组细胞的增殖能力降低，放射敏感性增加，故miR-203对TE．1细胞具有明显放射增敏作用见图3、4。 泸州医学院硕士学位论文图8：TE．1细胞转染24h后荧光分布图Figure：ThefluorescencedistributionofTE-lcellstransfectedafter24h图9：转染miR-203后Bmi．1的表达情况。A图是westernblot检测的Bmi．1表达差异，B图为转染后Bmi．1／GAPDH的比值差异。誊表示实验组与阴性组相比，差异具有统计学意义，幸幸表示实验组与空白组相比，差异具有统计学意义。Figure9：theexpressionofBmi-laftertransfectionofmiR-203 泸州医学院硕士学位论文表11：线性二次函数模型拟合后计算的相关生物学参数Table11：Biologicalparameterscalculatedbylinear-quadraticmodel注：水示空白对照组与阴性对照组比较，，．=：t=示转染组与空白对照组和阴性对照组分别比较。表12：单击多靶模型拟合后计算的相关生物学参数及增敏比结果Table12：Biologicalparametersandsensitiveenhancementratiocalculatedbyasingle-hitmulti—targetmodelsingle-hitmulti-targetmodel空白对照组3．1891．7001．97150．74595阴性对照组3．1271．62951．85780．73668转染组2．4461．49081．33350．60651．011．23>0．05*