蛋白和核酸电化学检测中的信号放大策略研究

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南京大学博士学位论文蛋白和核酸电化学检测中的信号放大策略研究Studiesonthestrategyofsignalamplificationforelectrochemicaldetectionofproteinsandnucleicacids作导者：董晓娅师：陈洪渊院士徐静娟教授南京犬赛2011年8月南京 独创性声明本人声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特另tlDH以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南京大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作过的同志对本研究所作出‘的任何贡献，均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签名：2011年月日 南京丈掌博士掌位论文目录目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4本论文主要创新点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8第一章绪论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9§1．1DNA电化学生物传感器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．91．1．1DNA电化学传感器的基本原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯91．1．2DNA电化学传感器探针的固定方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．101．1．3DNA生物传感器的检测技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．12§1．2适配体传感器的分析与检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．181．2．1适配体传感器的基本原理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．181。2。2适配体生物传感器的分类及应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．19§1．3本论文的主要研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．22参考文献：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23第二章基于纳米金膜与磁性复合功能材料双信号放大的D从传感器的研究⋯29§2．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．29§2．2实验部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一302．2．1材料和试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．302．2．2AuNPs和Fe304纳米粒子的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322．2．3DAHF复合材料的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯322．2．4GNF的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332．2．5电极表面的组装⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．332．2．6电化学检测过程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．34§2．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯342．3．1DAHF复合物的表征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯342．3．2GNF电极的表征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．372．3．3实验条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一392．3．4电极性能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40§2．4结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．42 南京大学博士掌位论文目景参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43第三章基于cds纳米粒子及目标物循环利用的信号放大型D№电化学传惑器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．zI!；§3．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一45§3．2实验部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．463．2．1材料和试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．463．2．2水溶性CdSNPs的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．473．2．3DNA连接CdSNPs和MNP的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．483．2．4目标物的循环及检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一483-2．5电泳实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一493．2．6复杂样品中目标的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一49§3．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一493．3．1纳米粒子的表征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一493．3．2优化实验条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．503．3．3酶切产物的电泳表征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．523．3．4分析性能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯533．3．5实际样品分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．54§3．4结j沦⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．55参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯56第四章基于稳定Y型结构的DM电化学传感器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯57§4．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。57§4．2实验部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．584．2．1试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一584．2．2GNF修饰电极的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．594．2．3DNA在电极表面的自组装和杂交⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．594．2．4实际样品的处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．60§4．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．604．3．1DNA传感器的电化学性能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．604．3．2传感器界面构建的表征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62 目景4．3．3实验条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯634．3．4生物传感器的性能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯644．3．5样品分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一664．3．6对目标物特异性得考察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．674．3．7再生性能和稳定性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一67§4．4结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．68参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69第五章基于适配体及cdS纳米粒子功能化碳球对凝血酶蛋白质的电化学检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7：!§5．1引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．72§5．2实验部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．735．2．1材料和试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．735．2．2CPs、CdS／CPs和CdSNPs的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯745．2。3AptamerII／CdSNPs和AptamerII／CdS／CPs的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯755．2．4凝血酶的识别界面的组装⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．765．2．5溶出伏安检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一765．2．6血浆的处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一77§5．3结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯775．3．1Cds／CPs的表征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯775．3．2识别界面的组装⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一795．3．3实验条件的优化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8l5．3．4检测性能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．825．3．5特异性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一835．3．6血浆中凝血酶的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．84§5．4结]．沦⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．84参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯85附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．88致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．89111 南京大掌博士掌位论文毕业论文题目：鲎鱼垒趑酸塾垡堂捡型主鲍焦量蕉盘塞喳监2008指导教师(姓名、职称)：睦送趟堕±盆整塑夔握摘要开发DNA和蛋白质的高灵敏检测技术一直是生命分析化学领域的一个热门研究课题，它在生物工程、临床医学、环境检测、食品和农业分析等方面具有重要意义。由于生物样品中某些DNA和蛋白质的含量较低，因此开发新的高灵敏检测技术将推动DNA和重要蛋白质研究的发展。电化学分析方法具有仪器设备简单、灵敏、易于微型化等优点，无疑将成为DNA和蛋白质检测的重要方法。本论文将纳米技术、分析技术、生物技术有机结合起来，在发展高灵敏度的电化学信号放大方法方面做了以下工作：1．基于纳米金膜与磁性复合功能材料双信号放大的D№传感器基于纳米金膜和负载大量辣根过氧化物酶的磁性纳米复合材料，构建了电化学生物传感器，用于特定序列DNA的检测。在该体系中，纳米金膜和磁性纳米复合材料实现了DNA传感器检测信号的双重放大。纳米金膜的三维结构使得纳米金膜电极具有高的比表面积，有利于提高捕获探针的固定量。磁性纳米粒子不仅有利于样品分离，而且还可以负载大量的辣根过氧化物酶，使得每次杂交都因引入多个辣根过氧化物酶而增强检测信号。在最佳实验条件下，本传感器对特定序列DNA的检测线性范围为50pM--500nM，最低检出浓度为7pM。该传感器 南京大掌博士掌位论文中文摘要对目标DNA具有良好的选择性，实现了特定序列DNA的高灵敏检测，在生物分析检测中具有潜在的应用前景。2．基于CdS纳米粒子及目标物循环利用的信号放大型DNA电化学传感器利用CdS纳米粒子为标记物，提出了一种基于目标物循环而利用进行信号放大的电化学方法，实现了对特定序列DNA的超灵敏检测。将连接DNA链的一端与磁珠相连，另一端与CdS纳米粒子相连。当连接DNA与目标DNA杂交后，利用切刻内切酶仅对双链DNA中的连接DNA进行切割的特点，在体系中加入切刻内切酶，使释放出的目标DNA循环利用，从而使大量的CdS纳米粒子从磁珠表面释放到溶液中。结合磁珠的高分离性能和方波溶出伏安法对Cd2+的高灵敏性，实现了目标DNA的快速、高灵敏检测，其检出浓度低至0．4tM一100fM，检出浓度为0．08fM。此外，本检测方法具有高的选择性，稳定性和重现性。由于反应是在均相中进行，因此不仅缩短了分析时间，还大大提高了杂交反应的效率。通过设计不同内切酶和特定DNA序列，有望用于其它DNA的高灵敏检测。3．基于稳定Y型结构的DNA电化学传感器利用Y型结构DNA成功地构建了一种具有良好选择性和较低检测限的DNA传感器。首先通过Au—S键将捕获探针DNA(p-DNA)有效地固定在纳米金膜(GNF)电极表面，在目标DNA存在的情况下，通过与标记有亚甲蓝(MB)的指示探针(r—DNA)杂交形成Y型结构。由于形成的Y型结构，使得MB接近GNF，从而提高电子传递速率。利用示差脉冲伏安法(DPV)成功实现了特定序列DNA的检测信号(从无到有)。与传统的signal．oil传感器相比，本传感器由于Y型结构DNA的引入，提高了选择性，消除了背景电流，显著降低了检测限。结果表明，还原峰电流与目标DNA(t-DNA)浓度呈线性关系，检测线性范围为1．OpM一1．0nM，最低检测限为0．24pM。此外，本传感器表现出良好的重现性、稳定性、选择性，可以用于复杂样品中目标DNA的检测，为灵敏检测DNA的方法的发展开辟了新的途径。2 南京大掌博士掌位论文中文摘要4．基于适配体及OdS纳米粒子功能化碳球对凝血酶蛋白质的电化学检测通过简单的原位合成方法，成功地在单分散碳球(CPs)表面生长一层硫化镉纳米粒子(CdSNPs)，形成CdS／CPs功能复合物，利用该复合微球作为信号放大标记物，实现了对凝血酶蛋白质的检测。利用凝血酶与适配体特异性结合的性能，将凝血酶与固定在玻璃表面的适配体I和固定在CdS／CPs复合材料表面上的适配体II(Aptamer1UCdS／CPs)进行夹心结合。采用方波溶出伏安技术(SWV)检测溶解CdS／CPs中的cd2+的量，实现对凝血酶的定量检测。由于CPs表面包裹大量的CdSNPs，使得分析检测限低至60aM，与用单个CdSNPs标记适配体II(AptamerII／CdSNPs)相比，检测限降低1000倍。此方法对凝血酶具有很高的特异性，即使在牛血清蛋白、溶菌酶、牛血红蛋白共存的情况下，也能很好的对其进行检测。本方法可以用于实际样品中凝血酶的快速、高效、超灵敏检测，在临床应用方面具有一定的前景。关键词：DNA电化学传感器；蛋白质检测；适配体；凝血酶：辣根过氧化物酶；亚甲基蓝；切刻内切酶；纳米金膜；碳球；硫化镉纳米粒子；信号放大：特异性识别 南京大学博士掌位论文英Jr．tll要SPECIALIZATION：AnalyticalChemistry_POSTGRADUATE：Xiao-YaDongThehighlysensitivedetectionofnucleicacidsandproteinshasattractedconsiderableinterestinawiderangeofareasincludingbioengineering，clinicalmedicine，environmentalmonitoring,foodandagriculturalfield．Amongvariousanalyticaltechniques，electrochemicalmethodsisoneofpromisingmethodsduetoitssuperioritiesofsimplerandcheaperinstrtmaentsthatareeasytominiaturize．Becausetheamountofsomeproteinsandnucleicacidsisusuallylowinthebodyfluidortissues，thedevelopmentofultrasensitiveprotocolsfortheseDNAandproteinissurelyofdesirable。Themajorresearchworksfocusesonsignalamplificationbasedonnanotechnology,analyticalchemistry,biotechnology,andmaterialscience，nanomateriaisasfollows：1．SignalamplificationforDNAdetectionbasedontheHRP．functionaiizedFeu04nanoparticlesAnelectrochemicalapproachforthesensitivedetectionofsequence—specificDNAhasbeendeveloped．Horseradishperoxidase(HRP)assembledontheFe304nanoparticles(NPs)wasutilizedassignalamplificationsoHrces．High．contentHRPwasadsorbedOntheFe304NPsvialayer-by-layer(LbL)assembletechniqueto4 南京大掌博士掌位论文英文摘要prepareHRP—functionalizedFe304NPs．SignalprobeanddilutingprobewerethenimmobilizedontheHRP—functionalizedFe304NPsthroughthebridgeofAuNPs．Thereafter,theresultingDNA—Au—HRP—Fe304(DAHF)bioconjugatesweresuccessfullyanchoredtothegoldnanofilm(GNF)modifiedelectrodesurfacefortheconstructionofsandwich—typeelectrochemicalDNAbiosensor．Theelectrochemicalbehaviorsofthepreparedbiosensorhadbeeninvestigatedbythecyclicvoltammetry(CV)，chronoamperometry(i-0，andelectrochemicalimpedancespectroscopy(EIS)．Underoptimalconditions，theproposedstrategycoulddetectthetargetDNAdowntothelevelof7pM淅tllalinearcalibrationrangefrom50pM--500nM，itexhibitesexcellentdiscriminationtotwo--basemismatchedDNAandnon--complementaryDNAsequencesandopensnewopportunitiesforultrasensitivedetectionofotherbiorecognitionevent．2．Magneticparticlesandcadmiumsulfidenanopartielestaggingforsignal-amplifyingdetectionofnucleicaddsAversatileDNArecognitionsystemusingcadmiumsulfidenanoparticles(CdSNPs)aslabelswasproposedforuttrasensitivedetectionofspecificsequenceDNAbasedontargetrecycling．Thisstrategyutilizedthemagneticparticles(MNPs)fortheimmobilizationoflinkerDNAandCdSNPsandthesubsequenttargetDNAhybridization．UsingtheuniquecharacteristicofnickingendonucleaseforcuttingonespecificstrandofdoublestrandDNA(dsDNA)，thelinkerDNAcouldbetransectedandthetargetDNAbeliberatedforre—hybridizationandhenceenhancedtheamountofreleasedCdSNPs．DuetotheadvantageoftheMNPsandsignalamplificationfromthetargetrecycling，theanalyteDNAcouldbedetectedbythesquare—wavestrippingvoltammetry(swv)inawidelinearrangefrom0．4fMto100fMwitllthedetectionconcentrationofthetargetDNAdownto0．08fM．TheproposedDNAdetectionstrategypossesseshighsensitivity,satisfactoryreproducibilityandexcellentstability，whichmighthavepotentialinotherDNAbiologicalassays．3．ElectrochemicalDNAbioanalysisbasedonthestableYjunctionprobe 霹兰塑塑兰兰竺苎—————————————』型生Asimpleandfacilesingle—stepDNAsensingplatformwithimprovedselectivityandlowerdetectionlimitbasedontheYjunctionstructurewassuccessfullydeveloped．FirstlythecaptureprobeDNAwasefficientlyimmobilizedontogoldnanofilm(GNF)electrodesviaAu—Sbonding，forthesubsequentformingofYjunctionstructurewithtargetDNAandreporterprobeDNAlabeledwithmethyleneblue(MB)．ThecontactofMB诫也theGNFelectrodesurfacewouldenhancetheinterracialelectroncommunication，basedonwhichatypical“nascent-signaling’’electrochemicalsignalcouldbeobservedbydifferentialpulsevoltammetry(DPV)．Owingtotheeliminatingofthebackgroundsignalcomparedwithtraditionalsignal-onelectrochemicalsensorsbytheintroductionoftheYjunctionstructure，thepresentplatformcouldsignificantlylowthedetectionlimitsandenhancetheselectivity．Theresultsindicatedthat，inpH7．4Tris—HCIbuffersolution,thepeakcurrentwaslinearwiththeconcentrationoftargetDNAintherangeof1．0pM一1．0nM、)l，itlladetectionlimitdownto0．24pM．Inaddition．thisnovelDNAsensorexhibitesfairlygoodreproducibility，stability，reusabilityandexcellentselectivityagainstevenasinglebasemismatchandopensnewopportunitiesforultrasensitivedetectionofspecificsequenceDNA．4-CdSnanoparticlesfunctionalizedcolloidalcarbonparticles：preparation，characterizationandapplicationforelectrochemicaldetectionofthrombinAnovelandsimplemethodforpreparingcadmiumsulfidenanoparticles(CdSNPs)functionalizedcolloidalcarbonparticles(CPs)hasbeensuccessfullydevelopedbyinsitugrowingabundantCdSNPsonthesurfacesofmonodispersecarbonparticles(CdS／CPs)．TheobtainedCdS／CPsconjugatesassignalamplificationlabelswerefurtherusedfortheultrasensitivedeterminationofthrombin．TheCdS／CPsconjugateswerecharacterizedbytransmissionelectronmicroscopy(TEM)，X-rayphotoelectronspectroscopy(XPS)andUV-visibleabsorptionspectrumfuv)．Theproteinelectricaldetectioninvolvesadualbindingevent，basedonthrombinlinkedtotheCdS／CPstagsandglasssurfacebythespecificaptamer—proteinaffinityinteractionsandasuccedem6 南京大掌博士掌位论文英文摘要electrochemicalstrippingtransduction．Owingtothehigh—contentCdSNPsoncarbonparticles，thisassayallowedadesirabledetectionlimitdownto60aM，whichwas1000timeslowerthanthatofonlyusingCdSNPsaslabelsinthecontrolexperiments．Thisprotocolexhibitedexcellentselectivityagainstthesecommonproteinssuchasbovineplasmaalbumin，lysozymeandhemoglobin．Thesignalamplificationapproachproposedhereprovidesafacile，cost—effectivemethodfortheultrasensitivedeterminationofthrombininthepracticalsamples，whichprovidesapotentialalternativetoolforthedetectionofproteininclinicallaboratory．KeyWords：DNAelectrochemicalsensors；Proteindetection；Aptamer；Thrombin；Horseradishperoxidase；Methyleneblue；Nickingendonuclease；Goldnanofilm；CdSnanoparticles；Carbonparticles；Signalamplification；Specificrecognition．7 ④翌塑竺燮本论文主要创新点1．制备了大载量辣根过氧化物酶的磁性纳米复合材料，通过纳米金膜修饰电极，构建了对特定序列DNA进行双重信号放大的检测方法。以大载量辣根过氧化物酶的磁性纳米材料和纳米金膜为基础的双重信号放大策略，使所构建的传感器具有高灵敏度和宽检测范围，从而降低了检测限。2．以CdS纳米粒子为标记物，利用切刻内切酶的特异性，提出了一种基于目标物循环利用进行信号放大的电化学方法，实现了对特定序列DNA的超灵敏检测。另外，通过磁珠的高分离性能和溶出伏安法的高灵敏性，以及反应都在均相溶液，大大提高了杂交反应的效率，因此检测快，既灵敏又快速。3．利用Y型结构的DNA成功构建了一种具有良好的选择性和较低检测限的DNA传感器。与传统的signal·on传感器相比，此传感器由于Y型结构DNA的引入，提高了检测的选择性，消除了背景电流。4．以原位合成方法成功制备了具有单分散性的硫化镉包裹碳球的CdS／CPs功能复合物，并将其用作信号放大标记物，研制成适配体传感器，实现了凝血酶蛋白质的超灵敏检测。实验中材料的制备方法简单且费用低廉，由于适配体对目标蛋白质具有高的特异性，大量共存的牛血清蛋白、溶菌酶、牛血红蛋白等不干扰对目标物的选择性检测。 @!奎查兰兰主兰竺竺奎第一章绪论生命组织、细菌、病毒和病菌均具有独特的核酸序列，这些特定序列的检测在基因分析、疾病诊断、食品污染、法医鉴定和环境监测等领域起着重要作用【1—3】。另外，某些蛋白质浓度异常也是某种疾病的征兆，然而常规的检测方法只能检测出超出正常浓度范围时DNA或蛋白质的量，此时疾病症状已经明显表现。因此需要开发一些灵敏方法对潜在疾病标记物进行检测，以增强病人的存活率【4】。在DNA和蛋白质检测这一领域，化学家、生物学家、物理学家等跨学科的工作者均对该方面进行积极研究。目前，光学、等压、电化学转换技术在该领域得到快速的发展【5．11】，为低含量的DNA和蛋白质的检测注入活力。其中电化学方法以其灵敏度高、轻巧便宜、携带方便、耗能少、能与现代微电子技术联用，易于实现微型化等优点，受到研究者的青睐，成为当今生物学、医学领域的前沿性研究课题[12—15】。§1．1DNA电化学生物传感器1．1．1DNA电化学传感器的基本原理DNA电化学传感器是通过检测靶核酸在互补杂交反应过程中的信号变化，来确定靶DNA序列的含量，因此也可以称作核酸杂交电化学传感器(nucleicacidhybridizationbiosensoO。DNA生物传感器的结构一般包括两个主要组成部分：第一部分是DNA分子识别元件或叫感受器，这一识别元件通常由固定在换能器上的探针DNA以及一些其它的辅助物质组成，它可以特异性地识别靶序列并与其杂交。第二个组成部分是信号转换器，转换器可以将杂交过程所产生有关参数的变化转变为可识别的信号，根据杂交前后信号的变化对靶DNA进行准确定量。DNA电化学传感器的灵敏度主要取决于目标DNA与分子识别元件之间相互作用情况。因此识别层上探针与目标序列杂交的特异性和敏感性是特定序列DNA检测中的重要环节。为获得快速、高灵敏的的检测效果，探针的固定化技术在传感器的制备过程中是一个非常重要的环节。1．1．2DNA电化学传感器探针的固定方法DNA生物传感器的性能主要取决于待测物与分子识别元件之间的相互作 彰坠查兰兰圭兰竺查第一j■用，DNA探针在电极表面的状态与DNA传感器的性能有很大的关系，因此固定化技术的发展是提高传感器性能的关键因素之一。为提高DNA生物传感器的灵敏性和选择性，使固定的探针呈现良好的工作性能，固定化后的探针应具有良好的活性、选择性、灵敏度、稳定性、耐用性；而应避免识别层存在非特异性吸附。目前，已经建立的固定化方法包括吸附法、共价键合法、自组装法和生物素．亲和素连接法等。1．1．2．1吸附法吸附法主要是通过静电作用，将带负电荷的DNA固定在固体基质表面，这种方法通常不需要对探针进行修饰。Pang等[161在预处理好的金电极或玻碳电极表面滴涂少量单链DNA或双链DNA，晾干后蒸馏水冲洗，即得到DNA修饰的电极。Wang等[17，18】将电极于+1．7V的电位下活化1min，增加电极表面的粗糙度和憎水性，接着将活化过的电极浸入含有DNA的电解质溶液中，在O．5V恒电位下电极带正电荷，吸附富集DNA2min，将DNA固定在碳糊电极表面。用该方法也可以将肽核酸(PNA)固定到碳糊电极表面，对肿瘤抑制基I习p53进行检测。另外，Fang等[19】通过在玻碳电极表面修饰带正电荷的壳聚糖，将带负电荷的DNA吸附到电极表面。实验证明，这种依靠吸附作用固定在电极表面的DNA，它在电极表面的状态是松散的平躺在电极表面的，使得杂交效率受到一定的影响，并且，容易从电极表面脱落，使得稳定性受到一定的限制。1．1．2．2共价键合法共价键合法是将探针DNA的一端通过共价键固定在电极表面。首先对固体基质表面进预处理，按意图引入所需的活性键合基团，如羧基、羟基、氨基等。同时对探针DNA进行修饰，使其带上相应的功能团。通过固体基质表面的活性基团与探针DNA相应的基团的作用形成共价键(如酰胺键、酯键、醚键等)，把DNA分子固定在基质表面。Chen等【20】将玻碳电极浸入对氨基苯磺酸溶液中，在0．5V—1．4V的电压下扫描4圈将对氨基苯磺酸修饰到其上，通过与酰氯之间的交联反应将修饰有氨基的锁核酸固定到玻碳电极表面。我们课题组[21]在玻璃表面修饰Y-(甲基丙烯酰氧) 固!查查塑圭兰竺兰查丙基三甲氧基硅烷，使玻璃表面带环氧基，然后将带氨基的探针DNA固定在玻璃基底上。Smith等[22]将玻片上的氨基和DNA上的氨基或巯基在偶联剂二异硫氰酸脂的作用下，使氨基DNA或巯基DNA固定在玻片上。另外，我们课题组[23]还将巯基丙酸保护的硫化镉修饰在玻碳电极上，在电极表面引入大量的羧基，在碳二亚胺盐酸盐(EDC)的存在下，将氨基DNA固定到玻碳电极表面，发展了DNA光电化学检测的方法。共价键合法固定的DNA比较牢固，DNA的一端被固定到基底上，使得DNA活动自由度大，有利于杂交反应的进行。1．1．2．3自组装法DNA在基底上的白组装是DNA在固体表面自发形成高度有序的DNA单分子层。一般是在探针DNA的一端修饰上巯基，利用金一硫键将探针DNA修饰到金电极或纳米金电极表面。目前最常用的方法是通过探针末端修饰巯基将DNA固定在金电极上[24—26]。由于DNA链具有一定的柔性，碱基在金表面容易非特异性吸附，使单链DNA平躺在金电极表面。为避免DNA的非特异性吸附，对固定有探针DNA的表面进行巯基封闭，使吸附在金电极上的碱基从金电极表面脱离，在金电极表面形成具有一定自由度的单分子层，促进目标DNA与之杂交。Fan等【27】将巯基己烷修饰寡聚核苷酸片段通过巯基自组装固定到金电极表面，形成有序、抗污染的DNA单分子层。我们课题组[28]在纳米金膜电极表面通过金硫键固定探针DNA，然后用巯基己醇封闭活性位点，实现特定序列的高灵敏检测。修饰有巯基的DNA在金电极表面结合牢固，稳定性好，操作简单，固定上的DNA活动自由度较大，且DNA层高度有序，有利于提高目标杂交效率。自组装法是目前比较理想的DNA固定方法。不足之处是修饰有巯基的高纯度DNA价格比较昂贵，实验耗费高。1．1．2．4生物素一亲合素法亲合素是含有四个结合位点的较大的蛋白质，生物素是生物体内分布广泛的一种羧化酶的辅酶，一端的羧基通过温和的生化反应能与酶、蛋白质、抗体、DNA等通过化学键连接，而不影响其活性及其与亲和素的结合。亲和素和生物素之间存在着很强的亲和力，强度几乎等同于共价键(Ka=1015)，这种很强的作 南京大掌博士掌位论文第一alt-用力广泛应用于DNA固定领域。Fan等[29】通过偶联试剂将生物素修饰到金电极表面，通过生物素与链霉亲合素的作用将发卡式DNA结合到电极表面，构建了基于酶标记的DNA电化学传感器，实现对特定序列目标DNA的高灵敏检测。Pingarron等[30】在DNA上标记生物素，通过生物素与链霉亲和素作用将DNA固定于链霉亲和素包被的磁珠表面，通过磁性富集作用，制备了测定肠杆菌的高特异性传感器，实现目标阿摩尔数量级的检测。1．1．3D№生物传感器的检测技术DNA生物传感基于DNA杂交互补进行分析。基于DNA碱基互补的特异性，DNA检测的应用范围遍及疾病诊断和治疗、药物筛选、环境检测等领域。根据生物传感器中换能器的种类不同，DNA生物传感器大致可分为DNA电化学传感器、DNA光学传感器和质量型DNA传感器。其中DNA电化学传感器由于具有独特的性质，如检测技术灵敏、快速、成本低廉、检测装置轻便、且易于微型化受到广大科研人员的关注。目前DNA杂交电化学检测主要分为两大类，一类是DNA直接电化学[31,32]。直接电化学方法主要是通过检测DNA碱基中鸟嘌呤和腺嘌呤在一定电势范围内的氧化电流实现DNA的检测。氧化所需过正的电位产生较大的背景电流，对信号产生严重的干扰，因此其应用受到一定限制。另一类是间接检坝U[19，33—35】。间接检测方法是在DNA链上嵌插一些氧化还原指示剂(过渡金属络合物)，或者在DNA链上标记电活性物质，通过检测嵌插指示剂或电活性标记物的氧化还原信号，实现DNA的间接检测。嵌插指示剂不仅可以嵌插到双链中，也对单链有一定的作用，当电极表面只修饰探针DNA时也会产生一定的电流信号，因此不能很好的区分单链与双链DNA。标记电活性物质的检测方法通常是在探针一端标记电活性物质，如亚甲基蓝、二茂铁或者纳米粒子，通过检测电活性物质信号，实现DNA的检测。对于极低含量的目标物质进行检测时，由于发生杂交反应的目标量很少，结合上标记有电活性物质的指示探针的量也很少，产生的杂交信号很难与背景信号 霉!查查竺兰圭竺竺竺查完全区分。为提高检测灵敏度，人们利用纳米粒子标记、酶标记、电活性复合物标记、目标循环利用等方法对检测信号进行放大。另外，也可以通过一些巧妙的设计，构建能够消除背景的传感器，以提高检测的灵敏度。1．1．3．1纳米粒子标记信号放大检测方法纳米粒子是尺寸在lnm--100nm之间的粒子，纳米粒子具有独特的物理化学性质，如小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应等特点。这些独特的性能使纳米粒子在DNA生物传感器中应用广泛。目前纳米金、纳米银、纳米金属硫化物作为标记物在这方面的应用最为常见[36—42]。自Mirkin等[43]将纳米金作为标记物采用光度分析方法对DNA检测后，纳米金由于制备方法简单，粒径可控，生物兼容性好，可以通过简单的金硫键标记到DNA指示探针上等优点，被广泛的应用在电化学DNA生物传感器方面。Mirkin等【44]将纳米金作为标记物，将银沉积在纳米金表面进行检测信号放大。其操作步骤是首先将捕获探针固定在间隙为20lun的阵列电极之间的基底上，利用夹心式的杂交方法将标记有纳米金的指示探针杂交到基底上，通过银增强技术使银沉积到纳米金表面，由于银在金表面的的沉积，使得纳米粒子体积增大，两电极被银增强纳米粒子连通，连通后的两电极间阻抗大大减小，通过阻抗值的变化，实现杂交信号检测限为500fM。同样用两电极连通的方法，Fang等[451以Zr4+为连接剂，将大量巯基丙酸修饰的金纳米粒子聚集，用聚集态的纳米金连通高为50nlTl，问距为300nm--350rtlTl的沟槽。该方法中先将22个碱基的肽核酸(PNA)固定于二氧化硅基底上，与目标杂交后，目标上的磷酸骨架与纳米金聚集体中带正电荷的Zr4+结合，从而使大量的纳米金填充在沟槽中，通过检测两电极间的电导性能实现特定序列的检测。该方法的检测限可低至50fM，并且能够很好的区分单碱基错配。溶出伏安法对于测定金属离子具有很高的灵敏度[46]，将纳米金标记在指示探针上，结合电化学检测金属粒子的方法，可以间接检测DNA及蛋白质，提高检测的灵敏度。Brossier等【47]将目标修饰到丝网印刷电极上，通过与标记有纳米金的指示探针杂交，将纳米金连接到电极上，将纳米金用HBrmr2溶解后采用阳 囤竺查竺兰查兰竺笙查第一章极溶出伏安法检测金离子的量，从而检测人类巨细胞病毒DNA。由于每个20nln的金球包含2．3x105个金原子，因此可以大大提高检测的灵敏度。waIlg等【48】在磁珠上标记链霉亲和素，通过链霉亲和素和生物素作用将探针固定在磁珠上，与标记有纳米金的目标杂化后，结合银增强采用微分电位溶出法对目标DNA进行信号放大检测。为了进一步提高检测的灵敏度，功能复合材料被广泛用于DNA的检测中，Somasundrum等【49】制备了聚苯乙烯微球，通过层层组装后将纳米金吸附到微球表面，利用夹心式结合将复合微球组装到电极表面，组装上的金包裹的复合微球用HBr／Br2溶解后结合差示脉冲溶出伏安法检测金离子的量，对特定序列DNA进行间接检测。该方法检测限可低至0。5fM，实现DNA的超灵敏检测。我们课题组[50]在磁性纳米粒子表面通过聚电解质层层组装的方法将纳米金包裹其上，制得Fe30dAu复合纳米材料，通过夹心式反应，将复合功能材料连接到金片表面，银增强后用酸溶解，利用电化学溶出法检测银离子，对DNA间接检测。由于复合纳米材料提高了被检测纳米粒子的负载量，显著提高检测的灵敏度，大大降低了检测限。除了纳米金和纳米银外，金属硫化物纳米粒子也被广泛应用于DNA的检测，早期Wang等【51]将无机纳米粒子ZnS、CdS、PbS和CuS作为标记物，对多组分进行同时检测。其方法是在磁珠上固定不同的捕获探针DNA，分别与相应目标结合后，加入标记有不同纳米粒子ZnS、CdS、PbS和CuS的指示探针DNA，通过夹心式结合，与目标杂交，将结合上的纳米粒子在酸性条件下溶解，在不同电位同时检测Zn2+、Cd”、Pb2+和Cu2+，实现多种目标DNA的同时检测。为了进一步提高检测的灵敏度，各种无机纳米粒子复合功能材料被应用于DNA的检测。Ju等[521制备了CdTe包被的聚丙烯球复合材料，酸性溶解CdTe，通过检测释放的Cd2+的量，对特定序列DNA进行检测，检测限为0．52IM。为了简化实验步骤及降低实验成本，我们在碳球表面原位合成了CdS，利用适配体对目标蛋白质的高特异性，实现对凝血酶的高灵敏检测[21】。 固坚查兰兰主兰竺竺兰酶催化信号放大检测方法在电化学DNA生物传感器中，一个指示探针对应的电活性指示剂只能产生一个信号电子，因此检测的灵敏度较低。酶分子具有循环催化的特点，酶的催化功能可以将底物大量转化为具有电活性的产物，放大电化学信号，因此酶作为信号标记物在电化学DNA生物传感器中应用也比较广泛。早期，Willner课题组[53】利用碱性磷酸酶催化底物生成不溶性产物，实现DNA杂交信号的测定。该方法中捕获探针DNA固定在金电极表面，目标DNA被捕获到电极表面后，DNA氧化还原嵌入剂5．溴．4．氯．3．吲哚磷酸被HRP催化氧化产生不溶性物质靛蓝在电极表面析出，阻碍铁氰化钾在电极表面电子传递，采用交流阻抗方法对目标DNA检测，检测限低至5×1004M。此外，利用酶催化产物沉积法，结合交流阻抗，根据不同的底物实现DNA的信号放大检澳1J[54—57】除了利用交流阻抗法检测析出不溶产物实现目标DNA的检测外，近年来，利用酶催化产物在电极表面的氧化还原电流，也可实现目标DNA的高灵敏检测。Fan等【29】将两端分别标记有生物素和地高辛的发卡DNA通过生物素和抗生素作用固定在金电极表面，由于发卡环界面位阻效应，标记有辣根过氧化物酶的抗地高辛无法与发卡DNA一端的地高辛结合，因此辣根过氧化物酶不能结合到电极表面。当发卡DNA与目标DNA杂交后，发卡环打开转化为线性结构，界面位阻效应消失，标记有辣根过氧化物酶的抗地高辛与发卡DNA一端的地高辛结合，使辣根过氧化物酶连接到电极表面，通过检测辣根过氧化物酶催化产物，实现对特定DNA高灵敏、高选择检测。同样用辣根过氧化物酶作为标记，Tunon—Blanco等[58]将标记有巯基的发卡DNA[司定到金电极表面，通过夹心式杂交，将标记有生物素的指示探针DNA杂交到电极表面，标记有碱性磷酸酶的链霉亲和素通过与生物素结合固定到电极表面，通过检测碱性磷酸酶对磷酸萘的催化作用实现嗜肺军团菌DAN的检测。Jiang等【59]基于发卡探针DNA和酶放大技术也提出了一种酶信号放大传感器，该传感器中发卡式探针DNA的5’端巯基化，3’端结合生物素，通过巯基自组装将探针DNA固定在金电极表面，探针与目标DNA杂交后，电极表面上探针DNA构象发生改变，标记有辣根过氧化物酶的链霉亲和素与探针DNA上生物素特异性结合，通过对辣根过氧化物酶催化产物在电极上的响应 露竺查竺兰查兰竺竺查电流的检测，实现目标DNA的定量检测。利用酶标记法也可以同时对多种目标DNA进行检测。Wang等[60lDA碱性磷酸酶和D一半乳糖苷酶为标记物，通过计时电位法检测电活性产物在碳电极表面产生的氧化信号，实现双目标信号放大电化学检测。Zhang等[61】用纳米金负载碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，提高酶的固载量，实现不同目标DNA的同时检测。碳纳米管作为良好的生物载体被广泛用来固载大量酶。Wangf6215|J备了包裹大量的碱性磷酸酶的碳纳米管复合材料对DNA进行检测。他首先在磁珠表面固定捕获探针DNA，与目标杂交之后，目标再与标记有碱性磷酸酶．碳纳米管复合物的指示探针杂交，经过磁性分离后，用修饰有碳纳米管的玻碳电极对目标DNA间接检测。由于碳管上负载了大量酶分子，增加酶的引入量。另外，玻碳电极上修饰的碳纳米管促进电子传递，有效的增大了检测信号。为提高酶的固定量，我们课题组[28】在磁性纳米材料表面复合大量辣根过氧化物酶，通过夹心式反应，根据酶催化产物在电极上的还原电流实现目标DNA的高灵敏检测。1．1．3．3电活性复合材料信号放大检测方法除了利用纳米粒子和酶为标记物放大检测信号外，标记复合电活性物质进行信号放大的方法也得到广泛的应用。该方法一般是在纳米粒子上固定电活性物质，由于一个纳米粒子可以固定多个电活性物质，从而实现电化学信号的放大。Fang等[631将Co(bpy)33+包裹在Si02纳米粒子表面制备成电活性物质Co(bpy)s”功能化的Si02纳米粒子复合物，利用硅烷化试剂三氨丙基二乙烯基三甲氧基硅烷和戊二醛将该功能化复合物标记在DNA上，通过杂交反应将该复合材料固定到电极表面，通过微分脉冲伏安法检测Co(bpy)33+的电化学信号，实现对DNA的检测。由于纳米粒子增加了电活性物质的负载量，使检测信号得以放大，该方法的检测限为2．0×10～omol／L。Wang[64]等用冠以大量二茂铁的纳米金粒子／抗生蛋白链菌素复合物作为标记物，制成了信号放大DNA电化学生物传感器。借助纳米粒子的负载作用和抗生蛋白链菌素与生物素之间的强的亲和作用，将大量 固!查查竺!查兰竺竺二茂铁引入传感器，采用伏安法对纳米金上二茂铁的氧化还原电流进行检测，识别溶液中靶DNA。另外，还可以将电活性物质封装在微囊中作为DNA标记，增加电活性物质的固定量，提高检测的灵敏度。Ho等[651在脂质体内填充大量的RuHex制成复合电化学活性材料，用修饰有纳米金的丝网印刷电极检测大肠杆菌0157，检测线性范围为16nol一106fmol，检测限为0．75amol。1．1．3．4目标循环放大检测方法目标循环是近几年来发展起来的一种信号放大检测方法，被越来越多的用于基础研究和实际检测中。它是利用内切酶或者外切酶将与目标DNA互补的探针链切断，释放出目标DNA，释放出的目标DNA进行下一个杂交．剪切循环，经过不断的重复利用，达到信号放大的效果。自Danielsen等[66]利用内切酶结合激光诱导荧光联合毛细管电泳进行目标循环信号放大检测后，该信号放大技术在光、电化学学方法上得到快速发展[67．70】。在电化学方面，Xiao等[71]将3’端标记有巯基的发卡DNA固定到金电极表面，用巯基己醇封闭活性位点。发卡DNA的5’端修饰磷酸根基团，中部修饰亚甲基蓝，当与目标DNA杂交后发卡环打开，DNA外切酶从5’端切割探针链，当切割到亚甲基蓝标记位置时终止，此时目标DNA从电极表面释放，切割后探针剩余部分成线性结构短链，仍然留在电极表面，由于剩余短链探针标记有亚甲基蓝，标记的亚甲基蓝与电极之间电子转移，产生电信号。释放出的目标DNA进入下一个循环，使电极表面形成大量的标记有亚甲基蓝的线性短链DNA，大量的亚甲基蓝增加电化学信号，起到信号放大的效果。Yang等[72]将两端分别标记有二茂铁和巯基的发卡探针DNA修饰到金电极上，二茂铁与电极距离近，产生的电流信号比较强。当与目标DNA杂交后，DNA内切酶从特定位点将探针DNA切断，二茂铁从电极表面游离，同时释放目标DNA，释放的目标DNA进行下一个循环，按照这样的方式大量的二茂铁从电极表面游离，使得电流信号大大减小，根据目标DNA杂交前后电流的显著变化来检测目标DNA。该方法的检测线性范围为0．1fM一1．0fM，检测限为0．068fM。由于DNA酶具有很好的特异 固坠查兰兰主竺竺竺圭第一章性，因此，该方法具有良好的选择性。1．1．3．5消除背景电流背景电流是限制DNA电化学传感器分析方法检测下限降低的一个主要因素，特别是当目标DNA浓度很低时，要区分杂交所产生的电化学信号与背景信号非常困难。如果背景电流太大，就很难对较低浓度的DNA进行准确的检测。Wang等【73】利用校正曲线法对方波溶出伏安法测定的结果进行基线校正，对DNA进行灵敏检测，检测限显著降低。Fan等【27】设计了减小背景电流的界面对低浓度目标DNA进行准确检测，该界面能够有效抵御蛋白质的吸附和非特异性吸附，可以用于实际样品的检测。Yu等【74】在金电极表面修饰一层捕获探针DNA，当存在目标DNA时，捕获探针和指示探针均与目标杂交。此时杂交后的螺旋体在DNA连接酶的作用下，将捕获探针和指示探针连接成标记有二茂铁的长链，经过解螺旋作用，这条长链DNA构型转化形成发卡结构DNA，此时二茂铁接近电极表面，与电极之间进行电子转移产生电流。这一设计与其它标记有二茂铁或亚甲基蓝的生物传感器相比[8，75—77]，消除了背景电流，检测限大大降低。§1．2适配体传感器的分析与检测适配体是指经过一种体外筛选技术BI]SELEX(指数富集配体系统进化)，从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合金属离子、蛋白质、有机小分子、多肽、多糖、以及细胞的单链寡聚核苷酸[78】。适配体可以是RNA，也可以是DNA，长度一般为25～60个核苷酸[79—81]。适配体生物传感器是以适配体为分子识别物质对蛋白质、药物、核酸等进行检测的传感器。I刍Heiftje等[82】将适配体作为分子识别元件固定在传感器表面，实现纳摩尔数量级蛋白质的检测之后，许多适配体传感器不断涌现出来。因以单抗或多抗为生物识别元件构建的传感器中，单抗或多抗制备繁琐、固定时容易失活、使用时对环境和样品要求条件苛刻。相比之下，适配体与目标分子的结合力强、特异性高，且适配体结构简单、容易合成，长时间暴露不容易变性等特点，很快成为传感器领域炙手可热的分析工具和研究对象[83．931。 固竖查竺燮第一章1．2．1适配体传感器的基本原理适配体传感器同DNA传感器相似，是将生物识别元件固定到基体，通过信号转换元件输出信号。适配体传感器的识别元件即是适配体；信号转换元件包括热敏元件、电化学电极、光学元件(如光纤、表面等离子体)、压电装置(如石英晶体微天平、表面声波1等。其基本原理是固定在固相载体上的适配体与目标物特异结合，通过转换元件将杂交信息转换为可测的电、光等信号，通过建立信号变化与目标物浓度的对应定量关系，实现目标物的分析与检测。1．2．2适配体生物传感器的分类及应用根据检测信号的不同，适配体传感器可分为光学型、电化学型和质量型三种。1．2．2．1电化学适配体生物传藤器及其应用电化学适配体传感器因具有灵敏高、特异性好、检测快速、成本低廉、检测装置轻便且易于微型化等特性受到广大科研人员的关注。Plaxeo等[941将末端修饰巯基的适配体通过金硫键自组装在金电极表面，然后与巯基己醇形成混合自组装膜，根据凝血酶加入前后适配体构象变化所引起的电流改变对凝血酶进行检测，检测线性范围为6．4nM一768nM。该传感器仅需两步即可制备，整个检测过程只需几分钟，能够满足快速疾病诊断和药物分析需求。Hansen等[95]将两步法进一步推广到多种目标物同时检测中。他将凝血酶适配体和溶解酵素适配体同时固定在金电极上，采用适配体竞争性结合量子点标记的目标物和未标记的待检测目标物，实现凝血酶和溶解酵素的同时检测。该传感器在同时检测时没有明显交叉，具有良好的选择性，能满足两种物质同时检测的要求，大大提高了蛋白质检测和疾病诊断分析的速度和准确性。Revzin等1961将两端分别修饰有巯基和亚甲基蓝的发卡式干扰素适配体通过金硫键组装到金电极表面，由于发卡结构使亚甲基蓝与电极表面接近，有利于电子传递，得到较高电化学信号。当发卡结构适配体与干扰素作用后，发卡环被打开，适配体寡聚核苷酸结构转化成线性，线性适配体使亚甲基蓝远离金电极表面，检测电化学信号急剧降低。根据电化学信号的降低量实现干扰素的signal—of啦 霭坠查竺竺竺竺竺测。与Revzin的signal．o肪法相反，Lai等【97】将两端分别修饰有巯基和亚甲基蓝的线性结构血管内皮生长因子适配体也通过金硫键组装到电极表面，当适配体与血管内皮生长因子结合后，适配体的结构发生改变，由原来的线性转换为卷曲结构使亚甲基蓝与电极界面接触，亚甲基蓝与电极间的电子传递加快，检测的电化学信号增强，根据不同浓度血管内皮生长因子引起的电化学信号的改变量成功实现血管内皮生长因子的signal．on检测。该方法可以用于人体全血中血管内皮生长因子的检测，检测限低达5pM。以上传感器的关键是适配体与目标结合前后构象发生变化产生可检测信号，而对于与目标物反应前后构像没有明显变化的适配体则不适用。对于某些适配体和目标分子结合前后其自身构象没有明显变化的，可以根据适配体与目标分子结合力比适配体与其互补链结合力强这一特点，设计竞争结合适配体传感器。Yu等[981将纳米金修饰到金电极表面，然后将与腺苷适配体互补的探针DNA链固定到修饰的纳米金电极上，根据互补原则将标记有二茂铁的腺苷适配体杂交到电极上，当加入腺苷后，腺苷竞争结合适配体，从而使标记有二茂铁的适配体从电极上脱落，导致体系氧化还原电流减小。该传感器的电流信号与腺苷浓度在0．1pM一10pM呈良好的线性关系，检出限为20nM。为放大检测信号，我们课题组[211将15个碱基的凝血酶适配体固定在玻璃表面，利用夹心式结构，将标记有硫化镉／碳球复合物的具有29个碱基的凝血酶适配体连接到玻璃片上，通过酸溶解含有大量硫化镉的复合物，采用方波溶出伏安法检测镉离子的量对凝血酶进行高灵敏检测。本信号放大方法克,眼Tsignal—on和signal-Of嗽可获得假阳性结果，提高了检测的准确度。1．2．2．2光化学方法光学检测既可以在界面进行，也可以在均相体系中进行，检测方法较多，也便于与其它信号放大技术结合。因此，光学生物传感在生物分析中得到广泛的应用。光度法是一种常见的检测方法，Chang等【99】将末端标记巯基的适配体及巯基己醇(MCH)依次固定在纳米金胶表面，根据加入PDGF前后体系颜色的变化对血小板衍生生长因子(PDGF)进行检测。该方法比较简单，不需要复杂、昂贵的化学分析仪器，检测结果肉眼可见，但其灵敏度一般为纳摩尔数量级。检测信号 固!查查兰兰主兰竺塑的产生依赖于PDGF双结合位点的交联作用，不能满足复杂基质中各种痕量物质的检测。为了提高灵敏度，Zhou等Boo]首先将纳米金胶固定在金电极表面，接着依次将适配体和巯基己醇固定于纳米金上，根据反应体系中目标物加入前后电化学发光信号的变化检测溶解酵素，检出限可达0．1pM。这比直接将适配体固定在金电极表面时检出限降低了6倍，表面金电极表面固定纳米金胶有效的放大检测信号。该传感器可以用于实时监测鸡蛋中微量溶解酵素。荧光检测方法是核酸适配体两端分别修饰荧光基团和猝灭基团形成分子信标，当与目标结合后，发生构型上的变化，引起荧光猝灭或增强，根据荧光强度的变化对目标进行检测。Stanton等[10ll将凝血酶适体5’端延长，使延长的序列能与靠3’端的碱基互补，将适配体两端分别修饰荧光素和4’．(4’．二甲基氨基叠氮苯)苯甲酸，首次构建适配体分子信标探针。当没有目标分子时，延长片段与靠3’端序列因互补杂交形成双链，适配体形成发夹结构；当引入目标物凝血酶，适配体分子信标探针与凝血酶结合，发卡环打开，适配体结构的改变导致荧光素与淬灭基团之间距离增大，影响荧光共振能量转移效率，改变荧光强度，从而检测目标物。Tan等[102]将该方法进行改进，将芘直接修饰于核酸适体两端，提出了光转换激基缔合物分子探针，用于体液环境中PDGF的检测，并采用时间分辨测量技术消除了背景荧光的干扰。Song等[103]将互补短链固定适配体的方法推广到多种目标物同时检测实验中。他将3种不同荧光标记适配体通过互补短链同时固定在金纳米颗粒表面。当反应体系中加入目标分子时，目标分子与适配体竞争结合，适配体与目标结合后从纳米颗粒上解离下来，体系发出荧光。该传感器选择性好，交叉反应少，能同时检测出微摩尔级目标物。虽灵敏度上比不上检测一种目标物的传感器，但它为高通量实时检测多种目标分子，快速分析环境污染物和食品中复杂成分提供了可能。1．2．2．3质量型传感器石英晶体微天平传感器是一种典型的质量型传感器，它根据生物分子在石英晶体表面吸附量的改变引起质量变化，然后将这种质量变化转化为石英晶体振荡 固竖查竺鳖竺竺竺查电路输出电信号的频率变化进行分析检测。Wolf等[104】以金作为基底来构建适配体传感器。他首先将金膜包被的石英晶体浸入DSP(3，3’二巯基二丙酸二附．琥珀酰亚胺酯))中活化，接着直接与亲和素偶联，最后末端修饰生物素的适配体与亲和素相互作固定到石英微电子天平传感器表面，该传感器可以检测10nMIgE。Tombelli等[105]在金包被的石英晶片上用巯基十一醇和羧化右旋糖苷活化，在交联剂EDC／NHS的作用下，将亲和素固定于石英晶片上，然后将修饰生物素的适配体连接到其上，检测ⅢV—l反式激活因子转录蛋白，检测线性范围为Omg／L一2．5mg／L，检出限为0．65mg／L。通过静电吸附，Hianik等[106]将亲和素固定在聚吩噻唑修饰的石英微电子天平表面，与标记有生物素的适配体结合后制成适配体生物传感器，该传感器对凝血酶的线性检测范围为10nM一100nM。Liu等[107]在石英晶片上固定金后，将15个碱基的凝血酶适配体固定到金表面与凝血酶作用，然后将标记有纳米金的29个碱基的凝血酶适配体与凝血酶作用。本实验方法与直接检测方法相比，由于纳米金的引入显著提高了检测的灵敏度，与不用纳米金标记的方法相比，将信号放大了2个数量级，检测下限相应降低了两个数量级。近年来，微悬臂传感器由于无需标记、高精密度、可靠性高等优点，也成为当前生物分析化学中具有应用前景的生物传感器。Seshia等[1081在氮化硅微悬臂一侧上覆盖一层20nnl的金层，然后通过巯基作用将其表面修饰一层PEG。同样在微悬臂的另一侧也修饰20nm的金，然后修饰适配，用PEG封闭活性位点制成传感器。该传感器由于使用内部校准微悬臂，有效的减小了热漂移和非特异性结合，可以检测细胞溶出物中蛋白激酶，实验结果与石英晶体微天平结果一致。§1．3本论文的主要研究内容本论文根据不同目标和要求，制备了Au-HRP—Fe304、CdS／CPs和CdSNPs材料，以及通过引入Y型结构DNA，构建了一系列DNA和蛋白质生物传感器。在DNA电化学生物传感器方面，其一，本论文将Au．HRP．Fe304纳米复合物作为DNA检测的标记物，利用GNF的多孑L结构，固定捕获探针，通过夹心 固翌盥竺坐第--all：式杂交，将Au．HRP—Fe304固定到GNF修饰电极上。基于GNF的纳米结构和Au．HRP—Fe304纳米复合物中大量的HRP，构建了双重信号放大的DNA传感器。该传感器具有较宽的检测范围，和较低的检测限。同时，该传感器还具有良好的区分碱基错配的能力。其二，以CdSNPs为DNA检测标记物，利用切刻内切酶特异性切割双链DNA中的特定单链，将目标DNA循环利用。由于目标的循环利用，实现了目标物检测信号的放大。由于用磁珠固定连接DNA，使杂交反应在溶液中进行，提高杂交的效率。其三，通过引入Y型结构DNA，在GNF修饰电极界面构建消除背景电流的DNA传感器，该传感器不需要材料的制备，实验操作简单，只需两步即可实现传感器的构建。在蛋白质电化学生物传感器方面，本论文制备了CdS／CPs复合材料，以CdS／CPs复合材料为标记物，根据适配体与目标分子之间的特异性结合性能，构建了夹心式蛋白检测信号放大方法。由于CdS／CPs负载了大量的CdSNPs，使得该方法的检测线性范围为0．1fM一100fM，检测限为O．06tM。另外，由于适配体可以特异性识别目标分子，可以很好的应用于实际样品检测。参考文献：【1】1Debouck,C．；Goodfellow,P．N．Nat．Genet．1999，21，48-50．【2】Heller,M．J．Annu．Rev．ofBiomed．Eng．2002，4，129-153．【3】Huang，Y．；Duan，X．F．；Cui，Y；Lauhon，L．J．；Kim，K．H．；Lieber，C．M．Science2001，294．1313-1317．[4】4Wilson，M．S．；Nie，W．Y．Anal．Chem，2006，78，6476—6483．[5】5Taton，T．A．；Mirkin，C．A．；Letsinger,R．L．Science2000，289，1757-1760．[6】Boon，E．M．；Ceres，D．M．；Drummond，下G；Hill，M．G；Barton，J．K．Nat．BiotechnoL2000，18，1096-1100．【7]Willner,I．；Patolsky，F．；Weizmann，Y．；Willner,B．Talanta：2002，56，847—856．【8】8Fan，C。H．；Plaxco，K．W．；Heeger,A．J．Proc．NailAcadSci．USA2003，ioo,9134—9137．【9】Minunni，M．；Tombelli，S．；Fonti，J．；Spiriti，M．M．；Mascini，M．；Bogani，P．；Buiatti，M．』Am．Chem．Soc．20115，127,7966．7967． 南京大掌博士掌位论文第一’t【181[191【20】【2l】【22】【23】【24】【25】【26】f27]【28】【29】【30】【3I】Park，S．J．；Taton，T．A．：Mirkin，C．A．Science2002，295，1503-1506．Weizmann，Y-；l'atoisky，F．；Willner，I．Analyst2001，126,1502—1504．McGlennen，R．C．Clin．Chem．Y2001，47,393-402．Broude，N．E．TrendsBiotechnoL2002，20，249-256．Drummond，T．G；Hill，M．CL；Barton,J．K．Nat．BiotechnoL2003，21，1192-1199．Rosi，N．L．；Mirkin,C．A．Chem．Rev．2005,105,1547—1562．Pang，D．；Abruna,H．D．；Anal．Chem．1998，70，3162-3169．Wang，J．；Palecek,E．；Nielsen，EE．；Rivas，G；Cai，X．H．；Shiraishi，H．；Dontha,N．；Luo，D．B．；Farias，P．A．M．JAm．Chem．Soc．1996，118，7667—7670．Xu，C．；He，P．G；Fang，Y．Z．Anal．Chim．Acta2000，411，31-36．Xu,C．；Cai，H．；Xu，Q．；He，P．G；Fang,YZ．FreseniusJ：ofAnalChem．2001，369,428—432．Chen，J．H．；Zhang，J．；Wang，K．；Lin，X．H．；Huang，L．Y；Chen，GN．AnalChem．2008，80,8028-8034．Dong，X．Y-；Mi，X．N．；Zhao，W．W．；Xu，J．J．；Chert，H．Y．Biosens．Bioelectron．2011，2633654．3659．Guo，Z．；Guilfoyle，R．A．；Thiel，A．J．；Wang，R．F．；Smith，L．M．NucleicAcidsRes．1994，22，5456—5465．Shah，Y；Xu,J．J．；Chen，H．YChem．Commun．2009,905—907．Heme，T．M．；Tarlov,M．J．zAm．Chem．Soc．1997，119,8916·8920．Huang，E．；Satjapipat，M．；Han，S，B．；Zhou，F．M．Langmuir2001，17,1215·1224．Levieky,R．：Heine，T．M．；Tarlov,M．J．；Satija,S．K．一Am．Chem．Soc．1998，120,9787—9792．Zhang，J，；Lao，R．J．；Song，S．P．；Yan，Z．Y．；Fan，C．H．AnaZ．Chem．2008,80,9029—9033．Dong，X．Y．；Mi，X．N．；Wang，B．；Xu，J．J．；Chert，H．Y．Talanta2011，84，531—537．Liu，G；Wan，Y．；Gau，v．；Zhang,J．；Wang，L．H．；Song，S．P．；Fan，C．H．，Am．Chem．Soc．2008，130，6820-6825．Loaiza，O．A．；Campuzano，S．；Pedrero，M．；Pividori，M．I．；Garcia，P．；Pingarron，J．M．AnalChem．2008，80，8239-8245．Wang，J．；Rivas，G；Femandes，J．R．；Paz，J．L．L．；Jiang，M．；Waymire，R．Anal．Chim．24∞q甜”q毋q刀口nHn¨nU 南京大学博士掌位论文第一章Acta1998，375,t97—203．【32]Palecek，E．；Billova,S．；Havran,L．；Kizek，R．；Miculkova,A．；Jelen，F．Talanta2002，56，919—930．【33]deLumleyWoodyear,T．；Campbell，C．N．；Heller,A．J=Am．Chem．Soc．1996，118，5504．5505．[34】Zhang，J．；Song，S．P．；Zhang，L．Y；Wang，L．H．；Wu，H．P；Pan，D．；Fan，C．H．ZAm．Chem．Soc．2006，128，8575—8580[35】Wang，J．；Liu,GD．；Jan，M．R．；Zhu，Q．Y．Electrochem．Commun．2003，5，1000—1004[36】Zhang，D．；Huarng，M．C．；Alociija,E．C．Biosens．Bioeleetron．2010，26,1736．1742．[37】Kaul，G；Amiji，M．zPharm．Sci．2005，94，184．198[38】Hu’K，C．；Liu,P．；Ye，S．J．；Zhang，S．S．Biosens．Bioelectron．2009，24，3113—3119[39】Castaneda,M．T．；Merkoci，A．；Pumera，M．；Alegret，S．Biosens．Bioelectron．211117，22，1961．1967．[40】Cai，H．；Wang，Y．Q．；He，PG；Fang，YH。AnalChim．Acta2002，469,165．172．[41】Zheng，J．；Feng，W-；Lin，L．；Zhang，F；Cheng，G；He，P-；Fang，Y．Biosens．Bioelectron．2007，23，341—347．【42】Zhang，Z．L．；Pang，D．W．；Yuan，H．；Cai，R．X．；Abruna,H．Anal．BioanaLChem．2005。381，833—838．[43】Elghanian,R．；Storhoff,J．J．；Mucic，R．C．；Letsinger,R．L．；Mirkin，C．A．Science1997，277,1078—1081．[44】Steel，A．B．；Heme，T．M．；Tarlov,M．J．AnalChem．1998，70，4670—4677【45]Fang，C．；Fan，Y；Kong，J．M．；Gao，Z．Q．；Balasubramanian，N．AnaLChem．2008，80，9387—9394．【46】Garcia,T．；Revenga-Parra，M．；Abruna，H．D．；Pariente，F．；Lorenzo，E．Anat．Chem．2008，8D．77·84．【47]Authier,L．；Grossiord，C．；Brossier,P．；Limoges，B．AnalChem．2001，73，4450—4456．【48]Wang，J．；Xu，D，K．；Polsky,R．JAm．ChemSoc．2002，124，4208．4209．【49]Pinijsuwan，s．；Rijiravanich，P．；Somasundrum，M．；Surareungchai，W．AnaLChem．2008．占伉6779—6784．[50]Bai，Y．H．；Li，J．Y．；Xu，J．J．；Chen，H．Y．Analys，2010，135，1672—167925 露竺堕塑塑竺塑L—一一竺二![51】Wang，J．；Liu,GD．；Merkoci，A．一Am．Chem．Soc．2003，125，3214．3215．[52】Dong，H．F．；Yan，Ft；Ji，H．X．；Wong，D．K．Y；Ju,H．X．Adv．Funct．Mater．2010，20，l173-1179．[53】Patoisky,F．；Lichtenstein,A．；Willner,I．Chem．EurZ2003，9。1137．1145．【54】Patolsky,F．；Lichtenstein，A．；Willner,I．Nat．Biotechn01．2001．19,253．257[55】Patolsky,F．；Katz，E．；Willner,I．AngeⅥ．Chem．Int．Ed．2002，41，3398-+[56】Lucarelli，F．；Marrazza,Q；Mascini，M．Biosens．Bioelectron．2005，20，2001．2009．[57]S仃emtll，M．；Marx，A．Angew．Chem．Int．Ed．2005，44，7842—7849．【58】Miranda-Castro，R．；De·Los-Santos-Alvarez，P．；Lobo—Castanon，M．J．；Miranda-Ordieres，A．J．；Tunon-Blanco，P．Anal．Chem．2007，79，4050-4055【59]Mao，X．；Jiang，J．H．；Xu,X．M．；Chu，X．；Luo，Y；Shen，GL．；Yu，R．Q．BiosensBioelectron．2008，23，1555-1561．【60】Wang，J．；Kawde，A．N．；Musameh，M．；Rivas，GAnalyst2002，127,1279．1282[61】Li，X．M．；Fu，P．Y；Liu，J．M．；Zhang，S．S。Anal．Chim．Acta2010,673,133-138，[62】Wang，J．；Liu，GD．；Jan，M．R．，Am．Chem．Soc．2004，126，3010．3011．[63】Zhu，N．N．；Cai，H．；He，EG；Fang，YZ．AnalChim．Acta2003，481，181—189【641Wang，J．；Polsky,R．；Merkoci，A．；Turner,K．L．Langmuir2003，19，989-991[65]Liao，W．C．；Ho，J．A．A．AnalChem．2009，81，2470-2476[66】Kiesling，T．；Cox，K．；Davidson，E．A．；Dretchen，K．；Grater,Ct；Hibbard，S．；Lasken,R．S．；Leshin，J．；Skowronski，E．；Danielsen，M．NucleicAcidsRes．2007，35．【67】Xu，w．；Xue，X．J．；Li，T．H．；Zeng，H．Q．；Liu，X．CtAngew．Chem，Int．Ed．2009，48，6849．6852．【68]Zuo,x．L．；Xia,F．；Xiao，Y；Plaxco，K．w．一Am．Chem．Soe．2010，132，1816一+[69】Bi，S．；Zhang，J．L．；Zhang，S．S．Chem．Commun．2010，46,5509．5511[70】Li，J．w．J．；Chu,Y．Z．；Lee，B．YH．；Xie，X．L．S．NucleicAcidsRes．2008,36．[71】Hsieh，K．；Xiao，Y．；Soh，H．T．Langmuir2010，26，10392—10396[72】Chen，J．H．：Zhang，J．；Li，J．A．；Fu，F．F．；Yang，H．H．；Chen，G-N．Chem．Commun．2010．46，5939—5941．[73】Wang，J．；Bollo，S．；Paz，J．L．L．；Sahlin，E．；Mukherjee，B．Anal．Chem．1999，71，1910．1913． 南京大掌博士掌位论文第一章【74】Wu，Z．S．：Jiang，J．H．；Shell，GL．；Yu,R．Q．Hum．Mutat．2007,28，630-637【75】Xiao，Y．；Qu，X．G；Plaxco，K．W．；Heeger,A．J．J=Am．Chem．Soc．2007，129,11896·+【76】Immoos，C．E．；Lee，S．J．IGrinstaff,M．W．』Am．Chem．Soc．21104，126,10814．10815．[77】FaJjami，E．；Clima，L．；Gothelf,K．；Ferapontova,E．E．AnalChem．2011，83，1594-1602．【78】Ellington，A．D．；Szostak，J．W．Nature1990，346，818—822[79]Jiang，Yx．；Zhu,C．F．；Ling，L．S．；Wan，L．J．；Fang，X．H．；Bai，C．AnalChem．2003，75，2112—2116．[80】Hermann，T．；Patel，D．J．Science2000，287,820—825[8l】Li，T．；Li，B．L．；Dong,S．J．Chem．EurlJ=2007，13，6718-6723【82】Potyrailo,R．A．；Conrad，R．C．；Ellington，A．D．；Hieftje，GM．AnalChem．1998,70，3419．3425．【83】Lei，L．H．；Fu，Y．C．；Xu，X．H．；Xie，Q．J．；Yao，S．Z．Prog．Chem．2009，21，724·731【84]Du，Y．；Li，B．L．；Wei，H．；Wang，Y．L．；Wang，E．K．AnalChem．2008，80，5110-5117．185]sbouzhuo,y．；Chen，J。H。；Nie，L。H。；Nie，Z。；Yao，S．z。AnalChem．2009，81，9972．9978．【86]Elbaz,J．；Moshe，M．；Shlyahovsky,B．；Willner,I．Chem．EurJ2009，15，3411-3418．【87】Ogawa,A．；Maeda，M．Chem．Commun．2009，4666-4668．【88】Kim，Y．s．；Kim，J．H．；Kim，I．A．；Lee，S．J．；Jumg，J．；Gu，M．B．Biosens．Bioelectron．26，1644．1649．[89】Ruslinda,A．R．；Xajima，S．；Ishii，Y．；Ishiyama,Y．；Edgington，R．；Kawarada,H．BiosensBioelectron．26，1599-1604．[90】Xiao，S．J．；Hu，P．P．；Wu，X．D．；Zou，YL．；Chen，L．Q．；Peng，L．；Ling，J．A．；Zhen，S．J．；Zhan，L．；Li，Y．F．；Huang，C．Z．AnalChem．82，9736-9742．[91】Zhang，X．R．；Zhao，Y‘Q．；Li，S．G；Zhang，S．S．Chem．Commun．46,9173．9175[92】Zhou，L．；Ou，L．J．；Chu，X．；Shen，GL．；Yu，R．Q．AnaLChem．20117，79,7492．7500．[93】Huang，J．；Zhu，Z．；Bamrungsap，S．；Zhu，GZ．；You，M．X．；He，X．X．；Wang，K．M．；Tan，W．H．Anal．Chem．2007，82，10158-10163[94】Xiao，Y．；Lubin，A．A．；Heeger,A．J．；Plaxco，K．W．Angew．Chem．IntEd2005，44，5456—5459．【95】Hansen，J．A．；Wang，J．；Kawde，A．N．；Xiang，Y．；Gothelf,K．V；Collins，G．一Am．Chem．27 !奎查竺竺查竺竺望奎第一聿————————————————————————————————一——：：：=Soc．2006,j28．2228-2229．[961Liu,Y；Tuleouva,N．；Ramanculov,E．；Revzin，A．AnaLChem．20lo,82，8131．8136．【97]Zhao，S．；Yang，W．W．；Lai，R．Y．Biosens．Bioelectron．2011，26，2“2．2447．f98]Wu,Z·S·；Guo，M．M，；Zhang，S．B．；Chen，C．R．；Jiang，J．H．；Shen，GLI；Yu,R．Q．Anal．Chem．211117,79，2933．2939．【99】Huang，C．C．；Huang，YF．；Cao，Z．H．；Tan，W：H．；Chang，H．t么墩珐锄绷．2005,77,5735—5741．[1001Bai，J·Q；Wei，H．；Li，B．L．；Song，L’H．；Fang，L．Y；Lv,Z．Z．；Zhou，W．H．；Wang，E．K．Chem。AsianJ21)t)8，3，1935．1941．[1013Hamaguchi，N．；Ellington，A．；Stanton，M．Anal．Biochem．2001，294，126—131．[102]Yang，C．J．；Jockusch，S．；Vicens，M．；Turro，N．J．；Tan，W．H．Proc．硒盯彳c磁＆iUSA2005，102，17278．17283．[103]Zhang，J．；Wang,L．H，；Zhang，H．；Boey,F．；Song，S．P．；Fan,C．H．Small2010,6．201．204．(104)Liss，M．；Petersen,B．；Wolf,H．；Prohaska,E．AnalChem．2002，74，4488．4495．[1053Mintmni，M．；Tombeili，S．；Gullotto，A．；Luzi，E．；Mascini，M．Biosens．BioP拓c肌坍．2004．20，1149—1156．[1063Porfirieva,A．；Evtugyn，G；Hianik，T．Electroanalysis2007，19。1915．1920．f1073Chen，Q．；Tang，w．；Wang，D．z．；Wu，X．J．；Li，N．；Liu，F．Biosens．Bioelectron．20lo,26,575．579．D08]Shu，W．M．；Laurenson，S．；Knowles,T．P‘J．；Ferrigno，P．K．；Seshia,A．A．胁P埘，B{oelectron。2008、24．233．237．28 南京大掌博士掌位论文第二1t第二章基于纳米金膜与磁性复合功能材料双信号放大的DNA传感器的研究摘要：基于纳米金膜和磁性纳米复合材料具有大容量荷载辣根过氧化物酶的性能，构建了DNA电化学生物传感器，用于特定序列DNA的检测。在该体系中，纳米金膜和磁性纳米复合材料实现了DNA传感器检测信号的双重放大。纳米金膜的三维结构使得纳米金膜电极具有高的比表面积，有利于提高捕获探针的固定量。磁性纳米粒子不仅有利于样品分离，而且可以荷载大量的辣根过氧化物酶，使得每次杂交都能引入更多的辣根过氧化物酶，增强检测信号。在最佳实验条件下，此传感器对特定序列DNA的检测线性范围为50pM--500nM，最低检出浓度为7pM。该传感器对目标DNA具有良好的选择性，可以实现特定序列DNA的高灵敏检测。关键词：纳米金膜，磁性复合纳米材料，辣根过氧化物酶，DNA生物传感器，信号放大。§2．1引言DNA是生物体的基本遗传物质，具有储备和传递信息的功能。DNA的研究在生命科学中具有重大意义。发展高灵敏DNA分析检测技术一直是DNA分析领域研究的一个重要方面，它对实现临床检测、环境监控、生物学研究包括对疾病的发生、发展程度和治疗情况都起到非常重要的指导作用【1—3】。由于传统DNA检测方法产生的信号比较弱，检测不够灵敏，不能满足DNA痕量分析的需要。因此设计并开发信号放大的方法是科学家们努力追寻的目标。聚合酶链反应(PCR)是一种高效样品放大技术，并得到广泛应用【4—6】。但是，PCR方法需要热循环过程和苛刻的实验条件来避免假阳性或假阴性结果，实验成本高、操作复杂。近年来，利用杂交反应结合电化学信号放大的方法实现生物样品中小分子或DNA超低含量检测具有很大的发展潜力。这些电化学信号放大技术包括标记电活性复合材料、引入纳米粒子增加标记物，利用酶进行信号29 南京大掌博士掌位论文第二，}放大技术[7一19]等。在这些方法中，酶信号放大具有很大的应用潜能。因为酶具有高的催化能力和良好兼容性。例如，Yu等【20]通过金硫键将发卡式DNA组装到金电极表面，与目标物结合后，通过生物素和链霉亲和素蛋白嵌合体的结合作用，将HRP连接在电极表面，通过HRP对底物的催化，实现了对特定序列DNA的检测。另外，Miranda-Castro等【20】通过标记碱性磷酸酶，实现对Legionellapneumophila的检测。Fan课题组[14】通过抗地高辛与地高辛之间的亲和作用将HRP连接到指示探针上，通过电极表面指示探针上连接的HRP，实现对特定序列DNA检测信号放大。以上这些信号放大方法均是基于生物素和亲和素的结合来标记酶，这种基于受体配体相互作用来标记酶的方法，酶标记的量比较少，在一定程度上限制了检测限的降低。为有效的改善酶催化作用对信号放大的效果，我们提出了在检测体系中引入更多HRP，以提高检测信号强度，从而实现提高灵敏度和降低检测限的目的。基于我们原始的设想，我们利用DNA—Au—HRP—Fe304(DAHF)复合物作为信号放大标记物，构建夹心式DNA生物传感器。利用层层组装方法在Fe304基质表面固定大量的HRP，并将该材料作为标记物。通过金硫键将捕获探针固定在具有独特纳米性能的纳米金膜表面[21．29]，当捕获探针与目标杂交后，指示探针与目标杂化，标记有指示探针的DAHF被固定到电极表面。DAHF上的HRP催化H202氧化溶液中还原态的TMB，然后氧化态的TMB在电极表面还原，通过测定其在电极上的还原电流，实现目标DNA检测信号放大。2．2．1材料和试剂§2．2实验部分D-D-葡萄糖购自上海化学试剂厂，氯金酸(HAuCl4)、柠檬酸三钠、辣根过氧化物酶(HPR，MW44000，～250units／mgprotein)、六水合氯化铁(FeCl3·6H20>99％)、四水合氯化亚铁(FeCl2·4H20>99％)、6一巯基己醇(MCH)、三(2一羧乙基)磷盐酸盐(TCEP)、六氨合钌(RuHex)、聚苯乙烯磺酸钠(PSS，30％ 南京大掌博士掌位论文第=0t水溶液，MW=70，000gtoolJ)、聚二烯丙基二甲基胺(PDDA)(20％水溶液，MW=200，000-300，000gmol‘1)均购NSigma．Aldrich公司。TMB溶液(3，3’，5，5’·四甲基联苯胺，K-blue低活性底物(含有双氧水)购Lexington，KY。寡核苷酸购自上海生工有限公司，序列如下。捕获探针序列：5’一TGGAAAATCTCTAGCAGTCGT-(CH2)6-SH-3’．目标DNA序列：5’．ACTGCTAGAGATmCCACACTGACTAAAAGGGTCTGAGGGA．3’．指示探针序列：5'-SH一(CI-12)6一ATGTCCCTCAGACCCTTl二3’．稀释探针序列：5’-SH一(CH2)6一GTCGCGCGAACCG1'A1’AG一3’．2个碱基错配序列：5’一ACTGCTAGAGATTTTCCACACTGACTAAAAGCGTCTGTGGGA·3’．完全错配序列：5'-ACTGCTAGAGATTTTCCACACTGACTACTTCAACAGTGCCCC．3’．生物素标记指示探针：5'-biotin-(CH2)6·ATGTCCCTCAGACCCTTT．3’．所用试剂均为分析纯。实验用水来自Milli．Q纯化系统。实验所需溶液：DNA固定液为含有10mMTris-HCl，1．0mMEDTA，0．3MNaCl，1．0mMTCEP(pU8．O)的混合液；DNA杂交液为含有10mMTris-HCl，1．0mMEDTA，0．25MNaCl(pn8．O)的混合液；淋洗液为含10mMPBS，0．1％SDS，O．1MNaCl(pH8．O)的混合液。仪器设各：循环伏安曲线(CV)和计时电量法(CC)、计时电流法(i—t)在电化学工作站660C(上海辰华仪器设备公司)上完成。电化学交流阻抗(EIS)31 南京大掌博士掌位论文实验在Autolab电化学分析仪(瑞士)上进行。紫外可见光谱(Uv)在岛津UV一3600仪器设备上测定。透射电镜(TEM)照片用JoelJEM2010型电镜拍摄。原子力显微镜(AFM)用PicSPM分子成像系统(安捷伦，美国)在室温下用轻敲模式完成。2．2．2AuNPs和Fe304NIPs的制备AuNPs根据文献制备所得[261。主要步骤如下：冰浴搅拌情况下，将0．6mL浓度为0．10MNaBH4加入到20mL浓度为2．5×i0-4MHAuCl4中，溶液立即由淡黄色转变为橘红色。将溶液在250C的条件下反应3h后放入40c的冰箱中备用。Fe304NPs按照文献报道的共沉淀法所得[27]。具体步骤如下：将浓度为1．0M的FeCl3·6I-120和浓度为0．50M的FeCl2·4H20溶于25mL浓度为0．4M的HCI溶液中，通N220min充分除02。同时将250mL浓度为0．50M的NaOH溶液中通N220min后加热到800C。在N2保护和快速搅拌条件下，将上述FeCl3和FeCl2的混合溶液加入到NaOH溶液中反应30min。利用外加磁铁将生成的黑色沉淀分离，洗涤多次，得到稳定的磁流体放入冰箱备用。2．2．3D棚。复合材料的制备DAHF的制备过程如图2．1。将制备好的带正电荷的0．50mL的Fe304纳米粒子(0．5mg的水溶液)加入lmL带负电荷的PSS(浓度为2me／mr含0．5M的NaCl)溶液中，机械搅拌20min得到均一棕色溶液，磁性分离并洗涤3次形成Fe304／PSS[15，27]。将lmL的PDDA溶液(浓度为2ms／mL含0．5M的NaCl)加到Fe304／PSS溶液中搅拌20min形成Fe304／PSS／PDDA，磁性洗涤3次去除未结合的PDDA。将Fe304／PSS／PDDA分散于pH8．0的10mMTris-HCl溶液中，加入200肛L浓度为10ms／mr的HRP，混合溶液在25。C的条件下反应30min。磁性分离后，将得到的Fe304／PSS／PDDA／HRP分散于4．0mL的AuNPs搅拌过夜，洗涤后得到紫色的Au-HRP-Fe304。取15灿浓度为100rtM的指示探针和60皿浓度为100laM的稀释探针加入到1．0mL的A卜HRP_Fe304中，反应16h后以逐步加入的方法加入2．0M的NaCl，使NaCl最终浓度为0．15M，形成的DAHF在40C的条件下老化24h后，将未结合的指示探针和稀释探针磁性分离。所得复合材料保存于冰箱中，用之前将其稀释一倍。 Figu他2-1．SchematicdiagramforpreparationofDAHFbioconjugates2．2．4GNIF的制备GNF电极的制备方法根据文献制得[28】。具体操作步骤如下：金盘电极首先用3500目的SiC砂纸打磨，然后将打磨后的金电极浸于0．10MpH7．4PBS中，于5．0V下氧化5min。电极表面呈橙红色。随后，将电极浸入1．0M温度为4。C的D．D．葡萄糖中还原10min，电极表面由橙红色变黑，生成一层均一多孔的纳米金薄膜。2．2．5电极表面的组装DNA传感器的制备如图2．2。将处理好的GNF电极或裸金电极浸入100此固定液所配制的捕获探针中16h后，用超纯水轻轻冲洗电极。接着，在2mL离心管中加入100v,L浓度为1mMMCH的溶液，将已组装有捕获探针DNA的电极浸入其中，并以Parafilm膜密封，室温组装1h，用淋洗液和超纯水交替清洗，以除去表面非特异性吸附的MCH。然后，将电极浸入100此一定浓度的目标DNA(2碱基错配DNA，完全错配DNA)中，370C条件下反应一定时间。电极冲洗后浸入DAHF中杂化3h。清洗后用N2吹干进行电化学测定并对其进行表征。 南京大学博士掌位论文Figure2-2．PreparationprocedureofDNAsensorandthesandwichtypedetectionstrategy．2．2．6电化学检测过程三电极系统中，工作电极为GNF修饰电极或裸金电极(直径2mln，上海辰华)，对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)。电极表征所用交流阻抗检测(EIS)是在含0．10M的KN03和50mMI拘Fe(CN)6引4‘溶液中进行；计时电量法(CC)是在含有浓度为50p,M的Ru(NH3)63+I拘lOmMTris．HCI溶液中检测，脉冲宽度为1．5S，电位阶跃宽度为500mV；循环伏安检测是在浓度为0．5M的H2S04溶液中，扫描速度为100mV／s，计时电流(i-t)检测是在2mL的TMB溶液中，检测电位为．0．10V。所有检测均在室温下进行。§2．3结果与讨论2．3．1I)AIIF复合物的表征我们通过静电吸附进行层层组装，使Fe304表面功能化，功能化的Fe304有利于生物分子的结合。将带正电荷的Fe304通过静电作用分步吸附带负电荷的34 PSS和带正电荷的PDDA形成Fe304／PSS／PDDA[31]，组装步骤如图2．1。由于HRP的等电点在7．2，当溶液pH高于7．2，HRP带负电。带负电荷的HRP可以与表面带正电的Fe304／PSS／PDDA表面结合形成Fe304／PSS／PDD刖HRP。由于HPR表面的_NH2与纳米金的作用，Fe30VPSS／PDDA／HRP表面可以包裹金纳米粒子形成Au-HRP．Fe304复合材料，最后，通过Au—S键作用，将修饰有巯基的指示探针和修饰有巯基的稀释探针同时连接到Au．HRP．Fe304复合材料上形成DNA．Au．HRP．Fe304。A50邑40吕30暑20§10乱0一一_-■一薰‰60504030201003456Diameterfnml2830诜熬0知辩4042Figure2-3．TEMimagesofFe304NPs(A)；AuNPs(B)；Au-HRP-Fe304conjugates(C)；thesizedistributionofFe304NPs(D)；AuNPs(E)；Au-HRP—Fe304conjugates(F)采用TEM对Fe304、AuNPs、Au—HRP-Fe304的表面形态和尺度分布进行表征，结果如图2—3所示。图中A—C分别是Fe304、AuNPs、Au．HRP—Fe304的形貌图，图中D-F分别是Fe304NPs、AuNPs、Au．HRP．Fe304的尺度统计分析图，它们的尺度分别为10nln、5lllil、35am，直径标准偏差分别为1．0nn'l、1．1nln、1．9nln。复合材料大的粒径表明在Fe304表面成功组装了HPR和AuNPs形成均ma丑cooLm正一器一oa啊_coo．Io 南京大掌博士掌位论文第二|I一分散的Au-HRP．Fe304。Figun2-4．UV-visspectraofFe304NPs(a)，AuNPs(b)，Au-HRP—Fe304conjugates(c)，andHRP(d)；为进一步考察Au．HRP．Fe304复合材料，我们采用uV对HRP、Fe304NPs、AuNPs、Au—HRP．Fe304进行了表征。图2—4中，曲线a是Fe304NPs的紫外吸收曲线，曲线b在525nrfl处有一吸收，这一吸收位置对应AuNPs的等离子共振吸收。曲线d在398nnl处有一吸收峰，对应HRP的紫外特征吸收。曲线c是Au—HRP-Fe304复合材料的紫外吸收，在400nm和550nlTI处有两个吸收峰，分别对应HRP和AuNPs的吸收位置。与单独HRP和AuNPs的吸收相比，两者紫外吸收红移的原因可能是由于HRP和AuNPs的相互作用【32】。由此推断，HRP和AuNPs被成功的组装到了Au．HRP．Fe304复合材料上。2．3．2GNF电极的表征电极表面状态对电化学传感器的影响非常大。有序纳米多孔电极由于其独特的性能常常被用于生物传感器中。传统多孔电极的制备是基于胶晶模板方法，尽管用该方法制备的多孔金纳米电极的响应信号比裸金电极的响应信号要好。但是，必须利用具有腐蚀性的酸消除模板，这样既复杂又费时。我们实验室已经报道了一种通过还原氧化态的电极表面来制备GNF，采用无毒、价廉、环境友好的葡萄糖作为电极还原试齐mJ[261，这种方法简单、快速。36 南京大掌博士掌位论文第二章Figure2-5．CyclicvoltammogramsofthebareflatAuelectrode(a)andtheGNFelectrode(b)in0．50MH2S04．Scanrateemployedwas100mV／S．在0．50M的H2S04溶液中利用CV对裸金电极和GNF修饰电极进行表征。如图2—5，GNF修饰电极的氧化还原峰电流远远大于裸金电极，这是由于GNF表面形成了一层纳米金膜，使得GNF修饰电极的有效面积比平面裸金电极的有效面积大。根据文献[33】，金氧化还原的电量为386i,tC／cm2，计算得到GNF修饰电极的有效面积为331ITUTl2，而裸金电极的有效面积为21．7rain2。GNF修饰电极的有效面积是裸金电极有效面积的15．3倍。这一结果表明，GNF由于其多孑L性，使得电极具有三维结构，有利于提高捕获探针的固定量。Figure2-6．AFMimagesofbaregoldsubstrate(A)；GNF(B)；DAHFbioconjugatesmodifiedGNF(C)． 南京大掌博士掌位论文第二章我们用AFM对电极的形态作了进一步研究，如图2-6。图2-6A是用金片代替金电极的AFM图，表明金片的粗糙度不足5am，图2．6B是经过电化学氧化后金片表面的情况，其粗糙度为100nlil，粗糙度的大幅度增加和形态的改变表明纳米金膜具有三维结构，增加了电极的有效面积，该结果与CV图结果一致。图2-6C是GNF修饰电极与目标和DNA．Au．HRP．Fe304复合材料杂交后的情况，表明电极表面粗糙度进一步增加。Figure2-7．NyquistplotscorrespondingtofiatAuelectrode(A)andGNFelectrode(B)．(a)Thebareelectrode，(b)afterimmobilizationofprobe1，(C)afterimmobilizationprobe1andMCH，(d)hybridizationwithtargetDNA，and(e)hybridizationwiththeDAHFbioconjugates．Thedamwererecordedinthepresenceof50mM[Fe(CN)6】3_／4containingO．1MKN03asredoxprobe，anduponapplicationofthebiasingpotentialof0．21、‘applying5mValternativevoltageinthefrequencyrangeof50mHz-10kHz．TheinsetshowstheequivalentcircuitappliedtOfittheimpedancespectroscopy．电极界面的组装过程和形成的双链DNA可以用EIS进行监测。图2．7是裸电极和GNF修饰电极表面的组装过程的EIS。插图是等效电路图，其中电荷转移电阻(Rct)和物质传递电阻(Zw)与双电层电容(Cdl)平行。EIS中半圆的直径对应电荷转移电阻【34】，半圆的直径增加说明电荷转移电阻增加。裸金电极的半圆直径很小，对应电荷转移电阻为7．5Q，当固定捕获探针之后，Rct值从7．5Q增加到788Q，Rct值增加的原因是由于DNA骨架上带负电荷的磷酸根排斥带负电荷的氧化还原探针[Fe(CN)6】H4-，阻碍【Fe(CN)6]3_肛在界面上的电子传递。当目标与捕获探针杂化后，Rct值继续增加。当与DAHF杂化后，Rct值增加到1540Q，这一增加是由于DAHF上负电荷密度高，阻碍氧化还原探针向电 固竖些坐极界面靠近。相比之下，GNF修饰电极表面每一组装步骤对应的Rct值均比相应裸金电极的要小的多，这是由于GNF修饰电极表面纳米结构有利于电荷的转移。2．3．4实验条件的优化在含有50“MRu(NH3)6"的10mMTris-HCl(pH7．4)溶液中采用CC对实验条件中探针固定量进行了优化，如图2-8。实验脉冲时间为1．5S，电位阶跃宽度为500mV【35]。我们通过检测与DNA磷酸骨架结合的RufNH3)63+的电量来计算DNA在电极表面的密度。电极表面电量与DNA修饰浓度的关系如图2-8A，探针密度与探针DNA修饰浓度的关系如表2．1。当电极表面分别修饰0．1、O．5、1．0、10uM的捕获探针时，随着修饰探针浓度的增加，响应信号增加，当探针浓度达到并超过1．0州时，对应电量最大。因此，实验中选用1．0州作为捕获探针的固定浓度。另外，考察了当捕获探针修饰浓度为1．0州时，裸金电极表面和GNF修饰电极表面的探针密度(表2—1)。结果发现，GNF修饰电极表面的探针密度是裸金电极表面的15．7倍，这一结果与CV所得有效面积增加15．3倍基本吻合。因此，GNF修饰电极有利于捕获探针的固定。Table2-1．CalculationofthesurfacedensityontheGNFelectrodesurface在37。C的条件下，考察了杂交时间的影响。如图2．8B，i-t响应随着杂交时间的增加而增加，并在60min时趋于稳定。这是由于随着杂交时间的增加，目标与探针的杂交达到饱和状态，因此60rain作为夹心式分析模式的最佳杂交时 南京大掌博士掌位论文间。另外，我们考察了施加电位对i-t响应的影响。如图2．8C，当施加电位为．0．1V时，电流响应最大。在此电位下，背景电流最小，并且底物不被氧化。因此，为了得到稳定的电流信号，选择施加电位为．0．10V作为测定电位。165．O4．8CB一一＼、＼14／／-＼-／。1245-／44'O仨tO4．0毛8i=So∞6，o3．5=3．6拿、●-里4●●／．U3．03．2202．52．8‘ooo．2o：4o6o：81o’：2“3D40∞70∞_02-01000102r，一t／mnEfVFigare2-8．(A)Chronocoulometricresponsecurvesfor1．0p．MofcaptureprobemodifiedelectrodeintheabsenceofRu(NH3)63+(a)，andO．IpM(b)，0．5pM(c)，1．0¨M(d)，2．0p．M(e)ofcaptureprobe．modifiedelectrodeinthepresenceof50laMRu(NH3)63+．(B)Effectsofhybridizationtimeonchronoamperometricresponsesto1nMtargetDNA；(C)EffectsoftheappliedpotentialonthechronoamperometricresponsetolnMtargetDNA．Errorbarsshowthestandarddeviations(S．D．)ofmeasurementstakenfromindependentexperimentswiththreedi髓rentsensors．2．3．4电极性能在最佳实验条件下，对目标DNA进行检测。如图2-9，峰电流与目标DNA浓度的对数在一定范围内呈线性。线性范围为50pM--500nM，检出浓度为7pM，相关系数为O．997(n=5)。7pM相当于100I．tL溶液中可以检测到0．7fmol目标DNA。相同条件下，我们比较了裸金电极表面构建的传感器与GNF修饰电极表面构建的传感器。对照实验中捕获探针修饰到裸金电极表面后，与目标DNA杂交，然后与生物素标记的指示探针杂交，最后通过生物素和链霉亲和素结合，将HRP固定到电极表面，制备成对照传感器。该对照传感器在1．0nM目标DNA中的响 南京大学博士学位论文应电流为7．0×10～A，该响应电流不足相应目标DNA在GNF修饰电极上响应4．8x10-7A的14．5％。因此，利用GNF修饰电极和DAHF作为标记物对DNA检测起到信号放大的效果。与文献值相比[13，20】，该方法的检测限降低了近2个数量级。Figure2-9．(A)ChronoamperometricmeasurementsforarangeoftargetsDNA．Fromtoptobottom：background，50pM，100pM，500pM，1nM，5nM，10nM，50nM，100nM，and500nMtargetDNA；(B)PlotforlogarithmoftheconcentrationoftargetDNAVS．chronoamperometriccurrentwithGNFelectrode．ErrorbarsrepresentS．D．，n=3．为评价传感器的选择性，对100nM的2个碱基错配DNA、100nM的完全错配和1．00nM的目标进行检测，检测信号如图2．10。图2．10A中目标DNA产生的信号非常显著，而比目标浓度高100倍的2个碱基错配DNA(2．10B)和完全错配DNA(2一IOC)产生的信号不足目标信号的12％。由此可见，该传感器对目标DNA具有良好的选择性。为考察传感器的重现性，我们制备7根相同的传感器并对其检测，检测结果的相对标准偏差为±8．4％。另外，将传感器放入冰箱中保存，并在保存期间对传感器进行定期检测，发现传感器保存一周后，信号仍能达到原来信号的92％。 南京大学博士掌位论文Figure2-10．ComparisonofchronoamperometricsignalforGNFelectrodeshybridizedwithtargetDNA(1．00nM)(A)；two-basemismatchedDNA(100nM)(B)；Non—complementaryDNA(100riM)(C)；blank(D)．ErrorbarsrepresentS．D。，n=3。§2．4结论本文通过层层组装的方式，在磁性材料表面组装HRP和指示探针DNA，制备成一种新颖的磁性纳米复合材料DAHF，并将其作为DNA检测示踪物。利用GNF修饰电极固定捕获探针，采用夹心式分析系统，制备成DNA传感器。此GNF修饰电极提高捕获探针的固定量。另外，DAHF有效提高了HRP在检测系统中的固定量，实现对特定序列DNA在较宽浓度范围内的高灵敏检测。本方法具有良好的选择性，稳定性和准确性，为电化学传感器在DNA分析诊断领域提供了新检测方法。参考文献[1]Debouck，C．；Goodfellow,P．N．Nat．Genet．1999，21，48-50．【2】Heller,M．J．Annu．Rev．Biomed．Eng．2002，4，12％153．[3】Cui，Y．；Wei，Q．Q．；Park，H．K．；Lieber,C．M．Science．2001，293，1289—1292．【4】Ye，Y．K．；Zhao，J．H．，Yan，F．；Zhu，Y．L．；Ju，HX．Biosens．Bioelectron加们，18，1501．1508． 南京大掌博士掌位论文第二jt[5】Cheglakov,Z．；Weizmarm，Y；Beissenhirtz，M．K．；Willner,I．Chem．Commun．2006,3205-3207．[6】Wu，P．S．C．；Ozawa,K．；Lim，S．P．；Vasudevan，S．G；Dixon，N．E．；Otfing，GAngew．[7】【8】Chem．Int．Ed．2007,46，3356-3358．Cai，H．：Wang，YQ．；He，P．G；FangYH．，AnalChim．Actor2002，469，165-172Chen，Z．P-；Peng，Z．F．；Luo，Y．；Qu，B．；Jiang，J．H．；Zhang，X．B．；Shen，GL．；Y屿R．Q．Biosens．Bioelectron．2007，23，485-491．[9】Wang，J．；LiuGD．；Jan，M．R．；Zhu，Q．Y．Electrochem．Commun．211113，5，1000·1004．[10】Ding，C．F．；Ge，Y．；Lin,J．M．Biosens．Bioelectron．2010，25，1290—1294[11】Wang，J．；Liu，GD．；Jan，M．R．JAm．Chem．Soc．2004，126，3010—3011．[12】Hwang，S．；Kim，E．；Kwak，J．AnaLChem．2005,77，579—584[13】Man，X．；Jiang，J．H．；Xu，X．M．；Chu，X．；Luo，Y．；Shen，GL．；Yu，R．Q．BiosensBioelectron．2008，23，1555—1561．f14】Cui，R。J。；Liu，C．；Shen，J．M．；Gao，D。；Zhu，J．J．；Chen，H。YAdv．Funct．Mater2∞8，18，2197-2204．【15】Bi，S．；Zhou，H．；Zhang，S．S．Chem．Commun．2009，5567—5569【16】Munge，B．；Liu，GD．；Collins，G；Wang，J．Ahal．Chem．2005，77，4662—4666．【17]Cui，R．J．；Huang，H．P．；Yin，Z．Z．；Gao，D．；Zhu，J．J．Biosens．Bioelectron．2008,23，1666一1673．【18]Wu，Y．F．；Chen，C．L．；Liu，S．Q．Ahal．Chem．211119，81，1600-1607【19】Mani，V．；Chikkaveeraiah，B．V；Patel，V；Gutkind，J．S．；Rusling，J．F．AcsNano．2009，3，585—594．【20]Miranda-Castro，R．；De—Los-Santos-Alvarez，P．；Lobo-Castanon,M．J．；Miranda-Ordieres，A．J．；Tunon-Blanco，P．AnalChem．2007，79，4050—4055[21】Wang，C．H．；Yang，C．；Song，Y．YI；Gao，1Ⅳ；Xia,X．H．Adv．Funct．Mater．2005，15，1267．1275．[22】P．N．Bartlett，J．J．Baumberg，RR．Birkin，M．A．Ghanem，M．C．Netti，Chem，Mater2002，14，2199·2208．[23】Szamocki，R．；Reculusa，S．；Ravaine，s．；Bartlett，P．N．；Kuhn，A．；Hempelmann，R．Angew．Chem．Int．Ed．21106，45，1317—132143 南京大掌博士掌位论文第二’■【24]Rho，S．；Jahng，D．；Lira，J．H．；Choi，J．；Chang，J．H．；Lee，S．C．；Kim，K．J．Biosens．Bioelectron．2008，23，852-856[25】Hu’K．C．；La玛D．X．；Li，X．M．；Zhang，S．S．Anal．Chem．2008，80，9124-9130【26]Gole，A．；Murphy,C．J．Chem．Mater．2004，16，3633-3640[27】Wang，S．H．；Shi，X．Y；VanAntwerp，M．；Cao，Z．Y．；Swanson，S．D．；Bi，X．D．；Baker,JR．爿如Funet．Mater．2007，17，3043—3050．[28】Zhao，W．；Xu,J．J．；Shi，C．G；Chen,H．Y．Electrochem．Commun．2006，8，773—778．[29】Wang，D．Y．；Rogach,A．L．；Caruso，F．NanoLetters．2002，2，857—861[30】Kato，N．；Caruso，F．JPhys．Chem．B．2005，109，19604-19612．[31】Bai，Y．H．；Li，J．Y．；Xu,J．J．；Chen，H．Y．Analyst．2010，135，1672-1679【32】Tang，D．P．；Ren，J．J．Anal．Chem．2008，80，8064-8070．[33】Bard’A．J．；Faulkner,I．R．ElectrochemicalMethodsFundamentalsandApplications，chineseedtion，2ndEdition．Chineseversion，Beijing．2001，PP．117—117．[34】Liu,Y．；Qu，X。H．；Guo，H．t2；Chert,H．J．，Liu，；B．F．；Dong，S，J．Biosens，Bioelectron．2006，21，2195—2201【35】Steel，A．B．；Heme，T．M．；Tarlov,M．J．Anal．Chem．1998，70，4670—4677 南京大掌博士掌位论文第三章基于CdS纳米粒子及目标物循环利用的信号放大型DNA电化学传感器摘要：利用硫化镉纳米粒子(CdSNPs)为标记物，提出了一种基于目标物循环利用进行信号放大的电化学方法，实现了对特定序列DNA的超灵敏检测。连接DNA一端与磁珠(MNP)连接，另一端与CdSNPs连接。当连接DNA与目标DNA杂交后，由于切刻内切酶对双链DNA中连接DNA进行切割，并使目标DNA释放后循环利用，从而大量的CdSNPs从磁珠表面释放。结合磁珠的高分离性能和溶出伏安法的高灵敏性，实现目标DNA的快速、高灵敏检测，其检测的线性范围为O．4fM一100fM，检出浓度为O．08fM。此外，此检测方法具有高的选择性，稳定性和重现性。通过设计不同内切酶和特定DNA序列，有望用于其它DNA的高灵敏检测。关键词；硫化镉纳米粒子，磁珠，切刻内切酶，DNA，目标物循环利用，信号放大§3．1引言目标物的循环利用是近年发展起来的高灵敏检测特定序列DNA的新的信号放大方法。它是通过一个目标分子依次与多个互补探针DNA杂交进行信号放大的策略。在这一方法中，目标物与探针杂交后，DNA酶特异性的剪切探针DNA，释放出完整的目标DNA与下一个探针DNA杂交，经过“杂交一剪切一释放目标DNA”这一过程的不断循环，达到目标物循环利用信号放大的目的。已有的目标物循环利用检测方法包括使用外切酶[1—6】，内切酶[7，8】，和DNAzymes[9，10】等信号放大方法。切刻内切酶是一种限制性核酸内切酶，它可以特异性地识别双链DNA中的一段核苷酸序列，并对其中的一条链进行切割。自Kiesling于2007年报道用光学方法结合切刻内切酶识别特定序列DNA之后，切刻内切酶陆续被用于DNA检测，进行DNA检测信号的放大[11．13]。切刻内切酶特异性很强，当没有目标45 DNA时，切刻内切酶不切割连接DNA。当连接DNA与目标DNA杂交，形成切刻内切酶的识别位点，切刻内切酶切割连接DNA而释放出目标DNA，释放的目标DNA可以不断循环利用[14—19]。本文提出了一种利用切刻内切酶实现信号放大检测特定序列DNA的方法。利用连接DNA连接MNP和CdSNPs，与目标DNA进行杂交后，切刻内切酶切割连接DNA并将其切割成两段。与CdSNPs连接的一段DNA从MNP上释放出来，同时目标DNA也被释放，释放出的目标DNA与下一个完整的连接DNA结合并不断循环利用。由于一个目标DNA可以多次循环利用，经过循环后可以释放多个CdSNPs，从而达到检测信号放大的目的。实验中利用MNP作为固定基质，不但可以提高分离效果，而且可以使杂交在溶液中进行，更有效的提高杂交反应效率。由于体系中释放的CdSNPs的量与目标DNA的量有关，所以可以通过测定酸溶后镉离子的量定量检测目标DNA，检测原理示意图如图3．1。采用该方法可以使检测范围达到3个数量级，检出限低至0．08fM。此外，由于切刻内切酶具有高的特异性，因此该方法具有高的选择性，可以区分单碱基错配DNA和完全错配DNA。为评价该方法在复杂样品中的检测情况，我们对HL60细胞内溶物进行了检测。3．2．1材料和试剂§3．2实验部分水合氯化镉(CdCl2·2．5H20)、水合硫化钠(Na：S·9H20)、巯基丙酸(MPA)、氯／F匕镉(CaCl2)、牛血清蛋l刍(BSA)、TritonX一100购自Sigma-AldrichInc．(美国)．链霉亲和素修饰的磁珠(MNP,d=lpm，1姒．呦购自Fishers(美国)。切刻内切酶(Nt．AlwI，10units)购[刍NewEnglandBiolabs(美国)。HL60细胞由南京鼓楼医院提供。寡核苷酸购自上海生工有限公司，序列如下，连接DNA序列：5’一SH一(CH2)6一GAAGAG丸蚣GGATCGGATAAGAGGTCCATCTGCAAC．(CH2)6．biotin一3’．目标DNA序列： 南京大掌博士掌位论文第=---'I"5’-CAG。I’AI’GAI’GGACC’rC’I”IAllCCGAI。CC’I”I”16AAI’CA-3’．单碱基错配序列：5'-CAG’IArGAAGGACCTCTTATTCGAGCCTTTGAATCA一3’．完全碱基错配序列：5'-ACTGCTAGAGA耵TTCCACACTGACTACTTCAACAGTGCCCC．3’．所用试剂均为分析纯。实验用水来自Milli．Q纯化系统。溶液：DNA储备液(10mMTris-HCI，pH7．4，100mMNaCI，1mMEDTA)；淋洗液(10mMTris．HCl，pH7．4，10mMNaCi，1．0mMEDTA，5×1矿％TritonX-100)；封闭液(10mMTris-HCl，pH7．4，100mMNaCI，1％BSA)；酶切液(NEBuffertype一2其中含10mMTris-HCl(pn7．4)，3mMMgCl2，50mMNaCI)；电化学检测液(0．20MHAc-NaAc，pH5．0)。紫外光谱由UV-vis分光仪(Perkin-Elmerinstruments，usA)上测得。透射电镜图(TEM)用JEOLJEM．2100透射电子显微镜拍摄。方波溶出伏安(SWV)检测在CHI750A电化学工作站上测定(上海辰华，中国)。电化学装置为传统的三电极系统，其中铂片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，修饰玻碳电极(GCE)为工作电极。3．2．2水溶性CdSNIPs的制备CdSNPs的制备方法根据文献稍作修改[201。将250皿的MPA加入到50mL浓度为2．0×10～M的CdCl2中，向该混合溶液中通N230min，用O．1M的NaOH将混合液调成pH8．0，然后向溶液中加X5．0mL浓度为O．10M的Na2S，80。C条件下反应4h后自然冷却至室温，CdSNPs整个制备过程是在N2保护下进行。得到的MPA保护的CdSNPs用超滤管离心。洗涤3次后放入冰箱中备用。3．2．3DNA连接CdSNIPs和MNP的制备链酶亲合素包被的磁珠(MNP)先用淋洗液洗2次，然后将生物素标记的20nM连接DNA加入到0．1mg的MNP中，室温下摇动的情况下孵育30min，然后用淋洗液洗涤。为了封闭活性位点，37。C情况下，将以上粒子加入到100止封闭47 j1分=__alt-溶液中作用30min后用淋洗液洗涤磁珠。向其qb}Jl／N．10止的CdSNPs，避光搅拌过夜[21，22】。混合物在外加磁场的条件下分离未结合的CdSNPs，将得到的用连接DNA连接的MNP和CdSNPs复合物分散于10mMTris-HCl溶液放入冰箱备用，得到的材料命名为MNP／linkerDNA／CdS。Figure3-1．SchematicrepresentationofthedetectedstrategywithMNPs／linkerDNA／CdSassignalamplificationdevice．2．2A目标物的循环及检测一定量的目标DNA分散于酶切液中，然后加入1乩切刻内切酶和含MNP为0．1mg的MNP／linkerDNA／CdS中，370条件下温育2h，然后磁性分离并将上清液转入200p．L的0．1MHN03中，超声20min后加入0．2M的HAc—NaAc电化学检测液，采用SwV检测溶解的Cd2+。为了有效的检测Cd2+，在玻碳电极上制备一层汞膜[23】。汞膜的制备方法是在N2氛条件下将玻碳电极浸入含有40ktg／mLH92+的HAc—NaAc缓冲溶液中(0．2MpH5．0)，在-1．0V下扫描40S后于一0．9V一一0．2V电位之间循环扫描四次制成。在N2保护下，以汞膜修饰的玻碳电极为工作电极，在一1．1V电位下电化学富集6min，然后在一0．9V一．0．2V电位间 用SWV进行检测。电位跃迁为4mV，频率为25Hz，振幅为25mV。2．2．5电泳实验用50mMpH9．2含2．0mMEDTA的硼酸．EDTA缓冲溶液制备3％琼脂糖凝胶，向其中加入微量荧光染料溴化乙锭，在100V电压下恒压电泳1h，用凝胶成像仪照相。实验中切刻内切酶加入到连接DNA或目标DNA或者连接DNA与目标DNA的混合溶液中，在37。C的条件下孵育2h电泳。2．2．6复杂样品中目标的检测人白血病HL60细胞株由南京鼓楼医院提供。该细胞置入含10％的胎牛血清、60pg／mL青霉素和100“g／mL链霉素的RPMll640培养基的培养瓶内培养，培养箱的温度为37。C，C02的含量为5％。48h后移出细胞并在1000转／分的速度下离心5min后收集，然后用无菌PBS(pH=7．4)溶液清洗两次。沉积物最后用PBS悬浮并稀释至实验所需的浓度。细胞数目通过PetroffHausser计数测定。所得的细胞经过反复冻融后在3000转／分的速度下离一tM0min，收集上清液并在其中加入不同浓度的目标DNA。3．3．1纳米粒子的表征§3．3结果与讨论Figure3-2．UV-Visabsorptionspectra(A)andTEMimages(B)ofCdSNPs 南京大学博士掌矗晴e文利用UV可以方便、准确的计算半导体纳米粒子的粒径。图3-2A是CdSNPs的UV图，CdSNPs在367nm出有一特征吸收，从特征吸收峰峰位置根据半经验公式可以计算出CdSNPs的粒径为3．3nln[241。图3—2B是CdSNPs的TEM图，从图中可以看出，其粒径大约为3．2m，这一结果与用紫外方法计算结果基本一致。3．3．2实验条件的优化DNA杂交效率与连接DNA在磁珠上的固定量有很大的关系。因此，我们考察了连接DNA的量对检测的影响。图3—3A中考察了连接DNA的浓度从0．10riM--4．0／aM时的情况，在低浓度的条件下，随着连接DNA浓度的增加，电流信号增加，这是由于连接DNA的量增加时，与目标DNA杂化机会更高，酶切后释放出的CdSNPs多，从而检测电流信号强。当连接DNA的量达到2．0taM时，检测电流信号达到平台，连接DNA在MNP表面达到饱和，从而电流信号不再增加。因此，我们选择连接DNA浓度为2．0pM作为最佳固定量。Fibre3-3．InfluenceoflinkerDNAconcentrationonSWVresponseto1．0×10—15MtargetDNAinTris-HCl(t0mM，pH7．4)． 南京大掌博士掌位论文第三章lFigure3-4．InfluencesofnickingendonucleaseconcentrationonSWVresponseto1．0xl0一15MthrombininTris-HCl(10mM，pH7．4)．图3-4是切刻内切酶的量对检测信号的影响，随着切刻内切酶量的增加，响应信号增加，当切刻内切酶量高于0．50U／此时，信号到达平台。另外，相同条件下不加切刻内切酶时，发现几乎没有响应。Fiore3-5·InfluenceofnickingreactiononSWVresponseto1．OxlO一15MtargetDNAinNEBuffer2．检测信号可能随着反应时问的改变而改变。因此，我们考察了反应时问对检测信号的影响，以便更准确的获得最佳反应时间。其结果如图3-5，从图上可以 看出，随着反应时间的增加，电化学信号不断增强。但超过120min后电流增加缓慢，这是因为经过不断的酶切循环后，MNP上连接DNA的量不断减小，当反应时间达到足够长，可能将MNP上连接DNA全部切断，将不利于定量检测。为准确定量检测，我们选择选择120min作为反应时间。3．3．3酶切产物的电泳表征Figure3-6．Gelelectrophoresisofthestrategy．Lane1：linkerDNAonly；lane2：linkerDNAwithnickingendonucleasefor1h；lane3：targetDNAonly；lane4：targetDNAwithnickingendonucleasefor1h：lane5：linkerDNAandtargetDNAhybridizatedforlh；lane6：linkerDNAandtargetDNAcomplextreatedwithnickingendonucleasefor2h．我们利用电泳对酶切情况作了考察，结果如图3-6。图3-6中条带1和3是纯连接DNA和纯目标DNA，条带2是连接DNA和切刻内切酶的混合物，条带4是目标DNA和切刻内切酶的混合物。从图中可以看出，条带l和2位置一样，并且都有一个条带，条带3和4位置一致，也只有一个条带，说明切刻内切酶对单链DNA没有切割能力。条带5是连接DNA和目标DNA的混合物的电泳图，图中只有一个条带，并且条带距离起点距离较近，这是由于连接DNA和目标DNA进行了杂化，杂化后双链DNA的电泳速度比较慢。图中条带6是连接DNA、目标DNA和切刻内切酶的混合物的电泳图，从图中可以看到2个条带，其中一个位置对应目标DNA的位置，另一位置距离起点较远，对应切割后的连接DNA 南京大学博士掌位论文第三章片段。实验结果表明，切刻内切酶不能切割单链DNA，只能切割双链DNA中的一条特定单链。3．3．4分析性能Figure3-7．(A)SWVresponsesforthetargetDNAof1．0×10—16M，4．0×10-”M，7．0×10一”M，1．0x10—15M，4．0×10—14M，7．0×10—14M，1．0×10—14，4．0×10-13M，7．0×10—13M，1．0xlO一13M．(B)LinearrelationshipbetweenthepeakcurrentandthelogarithmofthetargetDNA．Theerrorbarsrepresentthestandarddeviation(S．D．)ofthreemeasurementsconducted．最优的条件下，我们对不同浓度目标DNA进行了检测如图3．7。实验结果表明，镉离子的溶出峰与目标物浓度的对数呈线性关系，线性范围从0．4fM到100fM，相关系数为0．994，检出限为O．08fM。与其它用纳米金或纳米金标记硫化镉的方法比较[25—27]，该方法由于用目标循环利用进行信号放大，使检测具有高的灵敏度，同时避免了复杂的材料制备过程。另外与快速高灵敏的金纳米粒子放大方法相比，该方法利用MNP负载了大量的连接DNA和CdSNPs，有效的改善了杂化效率，降低检测限【28，29】。为考察实验的特异性，对三种不同DNA片段即目标DNA，单碱基错配DNA和完全错配DNA进行检测。如图3—8所示，在空白溶液中，几乎没有电化学信号。高于目标DNA浓度100倍的单碱基错配DNA和完全错配DNA的响应信号非常小。相比之下，目标DNA响应电流特别大。这些结果表明该方法在检测目标DNA时具有很好的选择性，能够用于单碱基多样性的检测。 南京大学博士掌位论文Figure3-8．Specificityofthesensorhasbeenpreparedwithout(a)andwith100tMone—basemismatchedDNAsequences(b)，100fMflon-complementarysequence(c)'1fMtarget(d)．ErrorbarsrepresentS．D．，n23．用相同制备方法，分别对不同时问，不同批间、相同浓度的DNA进行检测，结果发现相对标准偏差为±6．1％，表明该方法具有良好的重现性。3．3．5实际样品分析为考察该实验方案的可靠性和潜在的应用价值，我们向HL60的内溶物加入20．0fM，50．0fM，80．0fM目标DNA配成不同浓度的样品进行检测。检测结果如表3—1，其回收率分别为105％，104％，97．6％，表明该方法可以很好的对复杂样品中目标物进行检测。Table3-1．AssayresultsoftargetDNAincelllysates 南京大掌博士掌位论文第三|}§3．4结论本文提出了一种在MNP的辅助下，基于目标物循环利用对特定DNA检测的方法。该方法利用生物素和链酶亲合素的作用结合高灵敏的SWV实现特定序列DNA的检测。由于目标物循环利用，切刻内切酶不断切割连接DNA，释放大量CdSNPs，可以大大改善检测的灵敏度。另外，该方法不需要复杂的制备过程和热循环过程，且检测的线性范围比较宽，具有很好的重现性。通过设计不同的内切酶和特定的DNA序列，可以将此方法应用于检测其它DNA序列中。参考文献[1]Duck，P．；Alvarado—Urbina，t2；Burdick，B．；Collier,B．Biotechniques1990，9，142—148【2]Bekkaoui，F．；Poisson，1．；Cmsby,W．；Cloncy,L．；Duck，EBiotechniques．1996,20，240．248．【3]Goodrich，T．T．；Lee，H．J．；Corn，R．M．J．Am．Chem．Soc．2004，126，4086-4087．【4]Goodrich，T．T．；Lee，H．J．；Corn，R．M．Ahal．Chem．2004，76，6173-6178．【5]Lee，H．J．；Li，Y；Wark，A．W．；Corn，R．M．Anal．Chem．2005，77，5096·5100[6]Hsieh，K．；Xiao，Y．；Soh，H．T．Langmuir2010，26,10392—10396．【7]Kiesling，T．；Cox，K．；Davidson，E．A．；Dretchen，K．；Grater,G；Hibbard，S．；Lasken，R．S．；Leshin，J．；Skowronski，E．；Danielsen，M．NucleicAcidsRes．2007，35，el17【8]Li，J．J．；Chu，Y．；Lee,B．Y．-H．；Xie，X．S．NucleicAcidsRes．2008，36，e36．【9]Sando，S．；Sasaki，T．；Kanatani，K．；Aoyama，Y．J．Am．Chem．Soc．21103，125，15720．15721．【10】Sando，S．；Narita，A．；Sasaki，T‘：Aoyama，Y．Org．Biom01．Chem．2005，3，1002．1007．【11】Kiesling，T．；Cox，K．；Davidson，E．A．；Dretchen，K．；Grater，G．；Hibbard，S．eta1．NucleicAcidsRes．2007，35(18)，el17．[12】Hosoda，K．；Matsuura，T．；Kita，H．；Ichihashi，N．；Tsukada，K．；Urabe，1．eta1．Rna．aPublicationoftheRnaSociety．2008，14(3)，584-592[13】Xu，W．；Xue，X．J．；Li，T．H．；Zeng，H．Q．；Liu，X．G．Angew,Chem．Int．Ed．2009．48(37)，6849—6852．55 南京大学博士掌位论文第三章[14】Xu,Y．；Lunnen，K，D．；Kong,H．M．Proc．Natl．Acad．ScLUSA．2001，98(23)，12990．12995．[15】Li，J．J．；Chu，Y．；Lee，BY-H；Xie，X．S．NucleicAcidsRes．2008，36(6)，e36．[16】Sanders，K．L．；Catto，L．E．；Bellamy，S．R．W．；Halford，S．E．NucleicAcidsRes．2009，37(7)，2105—2115．[17】Kong，R．M．；Zhang，X．B．；Zhang，L．L．；Huang,Y．；Lu,D．Q．；Tart,W．H．eta1．Anal,Chem．2011，83(1)，14—17．[18】Chan，S．H．；Stoddard,B．L．；Xu，S．Y．NucleicAcidsRes．2011，39(1)，1-18．【19】Zhou，H．；Liu，J．；Xu，J。J。；Chen，H．Y．Chem．Comm．2011，47，8358—8360．[20】Wang，G．L．；Yu，P．P．；Xu，J．J．；Chen，H．Y．z1,hys．Chem．(I2009，113(25)，11142．11148．【21】Gill，R．；Willner,I．；Shweky，I．；Banin，U．一P咖．Chem．B．20115,109(49)，23715．23719．[22】Cheng，W．；Yah，F．；Ding，L．；Ju，H．X．；Yin，Y．B．Anal．Chem．2010,82(8)，3337—3342．[23】Dong，X．Y．；Mi，X．N．；Zhao，W．W．；Xu，J．J．；Chen，H．Y．Biosens．Bioelectron．2011．26(8)，3654-3659．[24】Yu，W．W．；Qu，L．H．；Guo，W．Z．；Peng，X．G．Chem，Mater．2003，15(14)，2854—2860．[25]Hu，P．；Huang，C．Z．；Li，Y．F．；Ling，J．；Liu，Y．L．；Fei，L．R．eta1．Anal,Chem．2008，80(5)，t819—1823．【26】Pinijsuwan，S．；Rijiravanich，P．；Somasundrum，M．；Surareungchai，W．Anal．Chem．2008，80(17)，6779·6784．[271Ding，C．F．；Ge，Y．；Lin，J．M．Biosens．Bioelectron．2010，25(6)，1290—1294．[281Li，D．；Song，S．P．；Fan，C．H．Acc．Chem．Res．2010，45(7)，631．641．[291Zhang，J．；Song，S．P．；Wang，L．H，；Pan，D．；Fan，C．H．Nat．Protoc．2007，2(11)，2888．289756 南京大掌博士掌位论文第四章第四章基于稳定Y型结构的DNA电化学传感器摘要：利用Y型DNA结构的稳定性成功的构建了一种具有良好选择性和较低检测限的DNA传感器。首先利用Au—S键将捕获探针DNA(p—DNA)有效地固定到纳米金膜(GNF)电极表面，在目标物存在的情况下，将其与标记有亚甲蓝(MB)的指示探针(r-DNA)杂交形成Y型结构。由于形成的Y型结构特点，使得MB更接近GNF，从而提高了电子传递速率。以差分脉冲伏安法(DPV)实现DNA特定序列的检测。与传统的signal—011传感器相比，本传感器由于Y型结构DNA的引入，提高了选择性，消除了背景电流，显著降低了检测限。结果表明，伏安还原峰电流与目标DNA(t—DNA)浓度呈线性关系，检测线性范围为1．0pM一1．0nM，检测下限为0．24pM。此外，该传感器表现出良好的重现性、选择性与稳定性，可以用于复杂样品中目标DNA的检测。关键词：DNA检测，Y结构DNA，消除背景，亚甲基蓝§4．1引言特定序列DNA杂交检测技术在法医检测和亲子鉴定、遗传性疾病的诊断以及传染病源的检测中起到非常重要的作用【1—17]】。近年来，基于DNA杂交引起结构转变的无试剂、两步操作的DNA电化学传感器得到快速发展。从广义而言，这些DNA电化学传感器可以归为两类[18—21]。第一类是signal—off传感器，这类传感器通过目标DNA与标记有氧化还原电活性探针DNA杂化后，改变DNA的构型，使标记的氧化还原活性物远离电极表面，减小法拉第电流[22．251。如用MB标记茎环结构适配体，当与干扰素分子结合后适配体发生构型转变，使MB远离电极界面，降低氧化还原活性物质与电极界面的电子转移效率，通过检测电流的减小量实现干扰素的高灵敏检测[26，27】。此外，将标记有二茂铁(Fc)的发卡式探针DNA通过金硫键组装到金电极，与目标DNA杂交后，探针茎环结构打开，Fc和电极之间电子传递隧道距离增加，电流减小，实现DNA的测定[281。第二类是signal—on传感器。与前一类相比，这类传感器中氧化还原标记物从电极的远端移动到近端，这种距离的改变导致电子传递效率的变化，通过检测电活性分子氧化还原电流的增景，可以方便快速地指示杂交反应的发生，并确定目标57 南京大掌博士掌位论文第四章DNA的浓度[29．34]。例如，将标记有MB的假结三级结构探针固定在金电极表面，通过与目标的杂化，MB靠近电极界面，增强电子的转移速率[30—31]。Immoos等135]通过聚二乙醇连接p-DNA和r．DNA形成三嵌段，三嵌段DNA链的一端标记有Fc，与目标物杂交后三嵌段DNA构型变化，改变了Fc与电极界面的距离，提高Fc与电极界面的电子转移速率，实现了对目标DNA的检测。Signal．off和signal—on这两种传感器是基于电化学信号的增强或减小进而确定目标DNA的含量。但由于本底信号的存在，限制了传感器灵敏度的提高。鉴于上述方法的局限性，本论文提出了一种新型具有高灵敏、宽线性范围、抗干扰能力强的DNA电化学生物传感器。这种Y构型传感器的构成过程及响应原理如图4—1所示。先将p-DNA通过金硫键自组装到纳米金膜(GNF)修饰电极表面以构成修饰界面A，界面A经过封闭活性位点形成界面B，当界面B与同时含有t-DNA和标记有MB的r-DNA的被测溶剂接触时，t-DNA便同时与r—DNA和p-DNA进行杂交形成三组分的Y型结构，其中r．DNA中的MB被固定到GNF电极界面，构成如图4—1所示的检测界面C。最后用DPV检测到MB的伏安电流。其电流大小与构成Y型结构数量有关，即与t-DNA的含量有关。若待测溶液中仅存在r-DNA，则无三组分的Y构型界面形成，也就不可能检测到MB的信号。在检测条件下，r—DNA和p-DNA都是过量的，显而易见，在～定范围内电极表面固载的MB量与t-DNA浓度呈一定关系，MB的电流的大小就构成溶液中所含t-DNA的定量基础，也是这种新颖生物传感器检测t-DNA含量的方法原理。因这种传感器的伏安蜂电流的大小从零起始，随着t-DNA浓度的增加而增加，其背景电流趋向于零，使其具有很强的抗干扰能力，从而降低了t-DNA的检测限，也使传感器的制备更加简单，扩大了应用范围。4．2．1试剂国)。§4．2实验部分三(2一羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、巯基乙醇(MCH)均购自Sigma公司(美DNA序列均购自于上海生工生物工程技术服务有限公司，碱基序列如下： 南京大学博士掌位论文第四章5’端修饰巯基的p-DNA序列：5'-HS一(CH2)6·AAAAGATCAAATTGGTGGACTCTAAAA一3’；3’端修饰亚甲基蓝(MB)的r-DNA序列：5'-TCTGAAGCTTTGATCGTGTA一(CH2)6-methyleneblue-3’；t-DNA序列：5’一AGAGTCCACCAAGCTTCAGATTAG-3’：单碱基错配序列DNA：5'-AGAGTCCACCAAGCTTGAGATTAG一3’；完全错配序列DNA：5'-AGAGTTCACCAAGCATGAGATTAG-3’；缓冲溶液：DNA固定液为10mM"Iris—HCl和1．0mMEDTA(pH7．4)；DNA杂化液为50mMTris—HCl(pH7．4)其中含0．50M的NaCI；淋洗液为10mMTiffs—HCI其中含100mM的NaCI；电化学检测液为20mM的Tris-HCl(pn7．4)，所有溶液均由超纯水配制。电化学测量均在AutolabPGSTAT-30仪器(EcoChemieBV,Utrecht，TheNetherlands)上操作。电化学测定采用三电极体系，以铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极(sCE)为参比电极，纳米金膜电极为工作电极。在5．0mMI拘[Fc(CN)6]3摊(其中含0．10mM的KN03)溶液中进行电化学阻抗(EIS)i贝!I量。20mM的Tris—HCI(pH7．4)溶液中进行CV和DPV测试。4．2．2GNF修饰电极的制备电极的制备过程参照第二章中2．2．44．2．3DNA在电极表面的自组装和杂交把制备好的GNF修饰电极浸于1．0pMp-DNA固定液中16h，以超纯水冲59 洗后浸入100止浓度为1．0mM的MCH溶液lh，使电极表面形成有序的p-DNA层。经MCH处理后的GNF电极再分别用淋洗液和超纯水冲洗，除去电极表面非特异性吸附杂质。37℃条件下，将电极浸入100IxL含有2．0“M的r-DNA和一定浓度t-DNA(或者单碱基错配DNA、完全错配DNA，但t-DNA的浓度低于r-DNA)的杂交溶液中，杂交lh用大量的淋洗液冲洗电极表面，然后进行电化学检测。4．2．4实际样品的处理人白血病HL60细胞株由南京鼓楼医院提供。该细胞置入含10％的胎牛血清、60pg／mL青霉素和100“咖L链霉素的RPMll640培养基的培养瓶内培养，培养箱的温度为370C，C02的含量为5％。48h后，移出细胞并在1000转／分的速度下离心5min后收集，然后用无菌PBS(pH=7．4)溶液清洗两次。细胞数目通过PetroffHausser计数测定。所得的细胞经过反复冻融后在3000转／分的转速下离心10min，收集上清液并在其中加入20pM的t-DNA和2laMr-DNA。牛血清蛋白和唾液分别用50mMTris．HCI(其中含0．5M的NaCl)溶液稀释一倍并加入一定量的t-DNA和2uM的r-DNA。在370C条件下，修饰有P—DNA的电极浸入样品溶液中杂交1h后淋洗。最后将所得传感器在浓度为20mM的Tris—HCl溶液中进行电化学测定。§4．3结果与讨论4．3．1DNA传感器的电化学性能图4．1是基于含有电活性组分MB和Y型结构DNA传感器的制备和检测过程。其中，p-DNA的两端分别与t-DNA的一端和与r-DNA的一端互补。r-DNA也包含两部分，一部分含8个碱基与t-DNA互补，一部分含7个碱基与MB标记的P．DNA互补。当试液中不含t-DNA时，r-DNA和P—DNA杂化不稳定，使MB不能结合到GNF修饰电极表面。当试液存在t-DNA的情况下，P．DNA与t-DNA和r-DNA杂交形成稳定的Y型结构，标记于r-DNA一端的MB结合到电 第四章Firgare4-1．SchematicdiagramforpreparationprocedureofDNAsensorandtheYjunctiontypedetectionstrategy．极表面，MB接近GNF修饰电极表面，提高了MB和GNF修饰电极之间的电子转移速率。由于电极表面的MB是通过与t-DNA杂交而固定到电极表面的，所以t-DNA的量与MB的量有依从的比例关系，所以可以通过检测MB的电化学信号实现t-DNA检测。循环伏安(CV)是最为常见的电化学技术，它能够提供电极表面发生的氧化还原反应信息。图4—2中曲线a是修饰有p-DNA的传感器在t-DNA浓度为00M，r-DNA浓度为2．0p．M的情况下于20m／Vl的Tis-HCI缓冲溶液中的循环伏安响应。曲线b是传感器在t-DNA浓度为10pM，r-DNA浓度为2．01．tM的情况下于20mM的Tis．HCL缓冲溶液中的循环伏安响应。由图4．2可知，在没有t-DNAFigure4-2．CVresponsesafterincubationwith(a)0pMtargetand2．0uMreporterprobeand(b)10pMtargetand2．0rtMreporterprobein20mMTris．HCI．Scanrate：100mVS～． 第四章的情况下，没有MB的峰电流产生。当修饰有p-DNA的传感器在t-DNA浓度为10pM，r-DNA浓度为0uM的情况下于20mM的Tis—HCI缓冲溶液扫描，发现也没有MB的峰电流产生(图形跟曲线a相同，所以数据没有显示)。曲线b中出现了一对明显的准可逆的氧化还原峰，其氧化峰电位于．0，29V，还原峰电位于．0．30V，表明MB结合到电极表面，Y结构在电极表面形成。因此，只有三组分同时存在下，Y构型才能够形成，才可以产生MB的电化学信号。4．3．2传感器界面构建的表征Figure4-3．(A)CyclicvoltammogramsofGNFelectrode(a)，P-DNAandMCHimmobilizedelectrode(b)，hybridizedwitht-DNAandr-DNA(c)inO．IMKN03containing5mMF《CN)63-似asredoxprobe．Scanrate：100mVs．DNA传感器构建过程分别用CV和电化学交流阻抗技术(EIS)来表征。如图4—3所示，GNF修饰电极在0．15V和0．23V处出现一对明显的氧化还原峰(曲线a)，当p-DNA和MCH组装到GNF修饰电极表面后，[Fe(CN)6】3-／4‘探针分子的氧化还原峰电流减小(曲线b)，当与t-DNA和r-DNA杂交后，峰电流进一步减小，氧化还原电位差进一步增加(曲线c)，这是由于t-DNA和r．DNA的引入增加了带负电荷的【Fe(cN)6—4’与带负电荷的DNA磷酸骨架之间的排斥。 南京大学博士掌位论文Figure4-4NyquistplotscorrespondingtoGNFelectrode(a)，afterimmobilizationofp-DNAandMCH(b)，hybridizationwitht-DNAandr-DNA(c)．Thedatawererecordedin0．IMKN03containing5mMFe(CN)63-／4-asredoxprobe，anduponapplicationofthebiaspotentialofO．20V，applying5mValternativevoltageinthefrequencyrangeof5MHz-10KHz．Theinsetshowstheequivalentcircuitappliedtofittheimpedancespectroscopy．我们采用EIS进一步对电极表面自组装过程进行表征。图4．4中插图为等效电路图，其中电荷转移阻抗(＆。)和物质传递阻抗(z。)与双电层电容(CdJ)平行。图4—4中曲线a几乎是一条直线，这表明GNF修饰电极有利于氧化还原探针在电极表面的电子传递。当电极表面组装上p-DNA并用MCH封闭之后(曲线b)，阻抗曲线上出现半圆，该半圆的直径反映界面电子转移的阻力，表明组装过p-DNA单分子层后，电子在该界面表现出了较大的界面电子转移阻力。当与t-DNA与r-DNA杂交后(曲线C)，电极界面产生更大的电化学阻抗，这是由于杂交后的电极界面上，DNA磷酸基团密度更大，更加阻碍电极表面电子转移。这一结果与上面CV结果一致。4．3．3实验条件的优化p-DNA的组装密度对杂交效率有一定的影响，为了获得较高的杂交效率和较快杂交速度，我们对p-DNA的组装浓度进行优化。图4—5A是固定t-DNA浓度 南京，罐挚博士掌位论文为20pM，r-DNA浓度2．0“M的情况下，p-DNA浓度对电化学信号响应的情况。随着p-DNA浓度的增加，电化学信号逐渐增大，在1．00M时达到最大值，因此我们选择1．0州作为p-DNA的固定浓度。350．30D．厂量三||厂善250厂《砉250．C￡／。2、0∞0．．§200．o150．0ro0151：o1：52：o‘“0151：01：52：02：53：o’⋯缅面4’05。0’6’07’08’13p-DNA／岬r-DNA，洲Incubation甘meIrain]ri鲫re4-5．Influencesofp-DNA(A)andr-DNA(B)concentrationonDPVresponseto2．0×10一¨Mt-DNAinTris—HCI(20mM，pH7．4)．(C)InfluenceofspecificbindingtimeonDPVresponseto2．0x10—11Mt-DNAinTris．HCI(20mM，pH7．4)．Theerrorbarsrepresentthestandarddeviation(S．D．)ofthreemeasurementsconducted．r-DNA的浓度也是影响杂化效率的一个重要因素，我们考察了r-DNA浓度从0．5—3．0洲时对电化学信号的影响。结果如图4—5B所示，电化学信号随着r-DNA浓度的增加而增加，当r-DNA浓度为2．0gM时，电化学信号达到最大值，这是由于增加r-DNA浓度，有利于其与p-DNA、t-DNA的碰撞机率，有利于三者的杂交。此后再增加r-DNA浓度，体系的电化学信号不再显著增强。因此，选择2．0斗M作为杂交时r．DNA的浓度。杂交时间是影响DNA杂交效率的又一因素，通常由DNA传质和杂交反应动力学控制。图4-5C考察了杂交时间对电化学信号的响应情况。随着杂交时间的增加，电化学信号逐渐增大，在60min时达到最大值，这是由于此时电极表面形成Y型结构DNA的量最大，固定MB的量最多。考虑到最佳实验效果，杂交时间选择为60min。4．3．4生物传感器的性能电化学分析方法中DPV中伏安图具有峰状，且电流电容小，也有利于峰高 南京大掌博士掌位论文的测量从而提高检测灵敏度。我们以DPV为检测方法，在杂交时间1h，r-DNA浓度为2．0uM的条件下，对不同浓度的t-DNA进行检i贝Jl(m4·6)。随着t-DNA浓度的增加，电流随之增大，在一定浓度范围内，t-DNA浓度的对数与电流呈线性关系，线性范围从1pM一1nM，线性回归系数为0．998，最低检测限为O．24pM。该检测限相当于100此样品中可以检测到24amol的目标DNA。Figure4-6．(A)DPVresponsesfordifferentconcentrationoft-DNAwith2．0州r-DNA．t-DNAconcentrationfroma--i：0M，1．0×10—12M，2．0×1012M，5．0x10—12M，1．0×10—11M，5．0x10—11M，1．0×10—10M，5．0x10—10M，1．0x10--9．(B)Linearrelationshipbetweenthepeakcurrentandthelogarithmofthet-DNAwithGNFmodifiedsensor(a)andbaregoldsensor(b)．Theerrorbarsrepresentthestandarddeviation(S．D．)ofthreemeasurementsconducted．在相同的实验条件下，我们利用裸金电极为基底做了对照实验(图4．6B中直线b)。利用裸金电极构建的传感器，峰电流与t-DNA浓度的对数成线性增加，检测的线性范围在lOpM一1nM内，检测限为4pM。这一对照结果表明，用GNF修饰电极构建的传感器比裸金电极构建的传感器在的检测限方面降低了16倍。另外，与以前报道的用嵌入试剂方法和氧化还原标记物方法相比，此传感器具有更低的检测下限。(见表4．1)65 南京大掌博士掌位论文Table4-1．Comparisonofbiosensors4．3．5样品分析为考察本体系应用于复杂样品中目标DNA的情况，我们分别向血清、唾液和细胞溶出物中加入一定量的目标DNA进行检测，检测结果如表4—2。检测结果表明本生物传感器对复杂样的中基质有较强的抗干扰能力。Table4-2．AssayresultsoftargetDNAinbloodsenlm，salivasampleandcelllysate(n=5)．SampleFinaladdedFoundRecoveryconcentration(pM)(％)bloodserum20．020．1±1．0100．7saliva20．020．7±1．3103．3Celllysate20．019．5±0．497．7 南京大掌博士掌位论文第四幸4．3．6对目标物特异性的考察为考察传感器的特异性，我们考察了该传感器对空白溶液、100pM单碱基错配DNA序列、100pM完全错配DNA序列和20pM的t-DNA序列的响应情况。从图4—7中可以看出，空白溶液中传感器的信号几乎可以忽略，完全错配DNA序列的响应与空白溶液的响应情况几乎相同，单碱基错配DNA序列虽然有一定的响应，但明显比t-DNA的响应信号低的多。由此可见，本文研制的DNA生物传感器不仅具有较低的检测下限，且具有良好的特异性。Figure4-7．ComparisonofDPVsignalforGNFelectrodeshybridizedwithwithoutt—E削A(a)，100pMone-basemismatchedDNA(b)，100pMnon—complementaryDNA(c)，20pMt-DNA(d)Theerrorbarsrepresentthestandarddeviation(S．D．)ofthreemeasurementsconducted．4-3．7再生性能和稳定性传感器的再生能力是传感器的重要性能指标之一。我们将组装了巯基DNA并通过MCH封闭后的GNF修饰电极与t-DNA和r-DNA杂交，检测其电化学信号，然后将该传感器反复变性一杂交，对其再生能力进行考察。变性时，如果条件过于温和，可能造成解链不完全而对下次测量产生干扰：相反，如果条件过于剧烈，则会对表面p-DNA的数量和杂交能力产生影响。因此，选择适当的变性条件以对传感界面的重现性进行评价是至关重要的。为使DNA变性的因素有高 南京大掌博士掌位论文温、酸碱变性等，其中酸变性或碱变性的条件较为剧烈，不容易控制，可能造成P．DNA失活或者脱落。所以本实验选取控制温度变性的方法。由于金．硫键的作用力较强，可以承受90℃左右的高温，本实验为了保持自组装层的稳定，选择了温度为80℃，时间为10min作为变性条件。图4—8是修饰有1．0洲的P—DNA的电极分别与以缓冲溶液和以血清为底液的目标和r-DNA杂交后，进行反复高温变性及杂交的实验结果。本传感器经过3次变性后，最终信号变化为原信号的83．9％。Figure4-8．Signalofthesensorchallengedwith20pMt-DNAinbuffer(A)andinbloodserumafter3cyclesofhybridization传感器稳定性是评估传感器性能的另重要指标。为了考察所构建的DNA传感器的稳定性，对浓度为20pM的t-DNA进行9次平行测定，得到的相对标准偏差(RSD)为2．8％。另外，将该传感器放在冰箱1周后进行检测，发现电流的减小量几乎可以忽略。§4．4结论本文所研制成的Y型结构的DNA电化学生物传感器具有灵敏较高、线性范围宽、抗干扰能力强、性能稳定等优点，它与传统标记氧化还原分子的方法相比，本传感器之所以有上述的优点是由于氧化还原标记物MB是通过r-DNA直接键合到电极表面，从而大大消除了背景电流，提高了检测的灵敏度；同时，这种构型的传感器还能够很好的区分单碱基错配DNA。因此，有望应用于其它特定序列DNA的检测。68 南京大掌博士掌位论文第四章参考文献[1】[2】[3】【4】4[5】[6】(7】【81Heller,M．J．AnnualRev．BiomedEng．211112，4，129-153Taton，T．A．；Mirkin，C．A．；Letsinger，R．L．Science2000，289，1757-1760Boon，E．M．；Ceres，D．M．；Drummond，T．G．；Hill，M．G．；Barton,J．K．Nat．Biotechn01．2000,18,1096-1100．Shan，Y．；Xu,J．J．；Chen，H．Y．Chem．Commun．2009，905—907．Fan，C．H．；Plaxco，K．W．；Heeger，A．J．TrendsBiotechn01．2005，23，186-192．Chen,Z，P．；Peng，Z．F．；Luo，Y．；Qu，B．；Jiang，J．H．；Zhang，X．B．；Shen,G．L．；Yu，RQ．Biosens．Bioelectron．2007，23，485—491．Park，S．J．；Taton,T．A．；Mirkin,C，A．Science2002，295,1503—1506．Tombelli，S．；Mascini，R．；Braccini，L．；Anichini，M．；Turner，A．P．F．Biosens．Bioelectron．2000，15，363—370【9]Ye，M．；Zhang,Y．Y．；Li，H．T．；Zhang，Y．Q．；Tan，P．；Tang，H．；Yao，S．Z．BiosensBioelectron．2009，24，2339—2345[10】Hu，K．C．；LaJl，D．X．；Li，X．M．；Zhang，S．S．Anal．Chem．2008，触9124—9130[11】Loaiza,0．A．；Campuzano，S．；Pedrero，M．；Pividori，M．I．；Garcia,P．；Pingarron，J．M．Anal,Chem．211118，80,8239-8245【12】Miranda—Castro,R．；De—Los-Santos—Alvarez，P．；Lobo-Castanon,M．J．；Miranda·Ordieres，A．J．；Tunon-Blanco，P．Anal．Chem．211117，79,4050—4055．[13】Ting，B．P．；Zhang，J．；Gao，Z．Q．；Ying，J．Y．Biosens．Bioelectron．2009，25，282-287．【14】Wang，J．；Liu，G．D．；Jan，M．R．■Am．Chem．Soc．211114，126，3010-3011[15】Chen,S．T．；Zhang，X．L．；Zhang，Q．H．；Tan，W．H．NanoscaleRes．Lett．2009，4，1159—1165．【16】Dong，X．Y．；Mi，X．N．；Wang，B．；Xu，J．J．；Chen，H．Y．Talanta2011，84，531．537[17】Dong，X．Y．；Mi，X．N．；Zhao，W．W．；Xu，J．J．；Chen，H．Y．Biosem．Bioelectron．2011，26，3654—3659．[18]Li，D．；Song，S．P．；Fan，C．H．Acc．Chem．Res．2010，43，631-641．[19]Lubin，A．A．；Plaxco，K．W．Acc．Chem．Res2010,43，496—505．【20】Uzawa，T．；Cheng，R．R．；White，R．j．；Makarov，D．E．；Plaxco，K．W．JAm．Chem．Soc 南京大掌博士学位论文第四-21t-2010，132，16120—16126．【21】Farjami，E．；Clima,L．；Gothelf,K．；Ferapontova,E．E．AnalChem．2011，83，1594-1602．【22】Lubin，A．A．；Lai，R．Y．；Baker,B．R．；Heeger,A．J．；Plaxco，K．W．AnalChem．2006，78，5671．5677．【23】Kang，D．；Zuo，X．L．；Yang，R．Q．；Xia,F．；Plaxco，K．W．；Wllite，R．J．Anal．Chem．211119，81，9109-9113．[24】Xiao，Y．；Lubin，A．A．；Heeger,A．J．；Plaxco，K．W．Angew．Chem．IntEd211115，44，5456．5459．[25】Ricci，F．；Lai，R．Y．；Plaxco，K．W．Chem．Commun．2007，3768—3770．[26】Immoos，C．E．；Lee，S．J．；Grinstaff,M．W．Chem．biochem2004，5，1100—1103．[27】Liu，Y．；Tuleouva,N．；Ramanculov，E．；Revzin，A．AnalChem．2010,82，8131—8136．[28】Fan，C．H．；Plaxco，K．W．；Heeger，A．J．Proc．NatLAcadSci．USA2003，100，9134．9137．【29】Lai，R．Y．；Plaxco，K．W．；Heeger，A．J．AnalChem．211117，79,229-233[30】Xiao，Y．；Qu,X。G．；Plaxco，K．W。；Heeger,A．J．J=Am．Chem．Soc211117,129,11896．11897．【31]Cash，K．J．；Heeger,A．J．；Plaxco，K．W．；Xiao，Y．Anal．Chem．2009，81，656—661【32】Zuo，X．L．；Song，S．P．；Zhang，J．；Pan，D．；Wang，L．H．；Fan，C．H．dAm．Chem．Soc2007，129，1042—1043．【33]Yang，K．；Zhang，C．Y．AnalChem．2010，82，9500—9505【34】Zhao，S．；Yang，W．W．；Lai，R．Y．Biosens．Bioelectron．2011，26，2442-2447【35】Immoos，C．E．；Lee，S．J．；Grinstaff,M．W．dAm．Chem．Soc．2004,z26,10814．10815．【36】Fang，C．；Ji，H．M．；Karen,W．Y．；Rafei，S．R．M．Biosem．Bioelectron．2011，26,2670．2674．[37】Garcia，T．；Revenga—Parra，M．；Abruna，H．D．；Pariente，F．；Lorenzo，E．AnalChem．2008，即，77-84．[38】Chen，J．H．；Zhang，J．；Wang，K．；Lin，X．H．；Huang，L．Y．；Chen，G．N．AnalChem．2008，80，8028-8034．[39】Wang，I．；Palecek，E．；Nielsen，P．E．；Rivas，G；Cai，X．H．；Shiraishi，H．；Dontha，N．；Luo，D．B．；Rarias，P．A．M．dAm．Chem．Soc．1996，118，7667．767070 南京大掌博士掌位-论·文第四章【40】Xiao，Y；Lou,X．H．；Uzawa．T．；Plakos．K．J．I．；Plaxco．K，w：；TomSob，H．』Am．Chem．Soc．2009，131，15311-15316．71 南京大掌博士掌位论文第五章基于适配体及CdS纳米粒子功能化碳球对凝血酶蛋白质的电化学检测摘要：通过原位合成方法，成功地在单分散性碳球(CPs)表面生长一层CdS纳米粒子(CdSNPs)，形成CdS／CPs功能复合物，利用该复合微球作为信号放大标记物，实现了对凝血酶蛋白质的检测。利用凝血酶与适配体特异性结合的性能，将凝血酶与固定在玻璃表面的适配体l和固定在CdS／CPs复合材料表面上的适配体II(AptamerII／CdS／CPs)进行夹心结合。再以方波溶出伏安法(swv)来检测CdS／CPs复合物中溶解下来的cd2+的量，成功实现了对凝血酶的问接定量检测。由于所制备的CPs表面能包裹大量的CdSNPs，使得间接检测凝血酶的下限低至60aM，与用单个CdSNPs标记适配体II(AptamerII／CdSNPs)的方法相比，检测下限降低了1000倍。此方法对凝血酶具有很高的特异性，即使样品在相对高含量的牛血清蛋白、溶菌酶、牛血红蛋白共存的情况下，也能满意地对其进行检测。本方法可以用于实际样品中凝血酶的快速、高效、超灵敏检测。关键词：碳球，硫化镉纳米粒子，凝血酶，适配体，电化学检测§5．1引言发展可靠、简便、低廉、高灵敏的检测方法，实现复杂样品中疾病相关蛋白的检测对早期疾病筛选、诊断等具有重要的意义。此外，它对于基本的生物过程包括反应治疗方法、疾病发展过程的监控也起着关键作用【1】。然而，常规方法对体液或组织中与疾病相关的低含量蛋白质检测却非常困难【2】。纳米材料由于具有独特的物理、化学、生物兼容等性能，已经被广泛应用于生物物质的检测，利用纳米材料可以增强与目标物的识别能力，降低DNA或蛋白的检测限等[3—8】。自Wang课题组将ZnS、CdS、PbS、CuS等无机纳米材料应用于免疫分析和DNA检测后【8一11】，各种无机纳米粒子在这方面的应用得到广泛的发展，这种方法的检测限一般在10-9M到10-14M之间【12．17]。为进一步改善检测灵敏度，满足痕量目标物的检测，近几年来，人们采用硅球、微珠、纳米金等 南京大掌博士掌位-论文负载无机纳米粒子对检测信号进行放大。例如，Qian和Chen等[18，19]通过交联反应将CdTeQDs包裹在硅纳米球表面进行蛋白质电化学检测。Ju等[20】通过层层组装方法将CdTeQDs富集在聚苯乙烯．丙烯酸微球表面，构建DNA传感器。此外，Wang等【21】通过寡聚核苷酸将CdS连接NAuNPs表面，实现了特定序列DNA的检测。尽管上述这些方法在一定程度上改善了传感器的检测性能，但人们仍然期望在降低实验成本、制备操作更加简单快速、检测性能更加完善等方面有新的进展。众所周知，单分散碳球(CPs)具有独特的物理性能和较高的化学稳定性而备受人们关注。CPs可以直接固定标记有二抗的辣根过氧化物酶，实现癌症标记物的检测[22】；也有利用层层自组装的方法在CPs表面包裹上AuNPs来构建免疫传感器[23】。这些成功的应用实例，主要是基于CPs的均一性、单分散性和优越的表面性能。基于以上的优良性能，CPs将是固定纳米材料及生物分子的理想的基质，也是提高DNA生物传感器性能的重要载体。本文通过微波的方式制备了高分散性的CPs，经过酸处理后，在其表面原位生长一层均匀分散的CdSNPs，形成CdS／CPs功能复合物，用CdS／CPs作信号放大标记物，制备成新型信号放大的电化学分析体系。在此检测体系中凝血酶作为目标物，有两个位点可以与适配体进行结合[：24】，其中一个位点与具有15个碱基的适配体l结合，另一个与具有29个碱基的适配体lI结合。适配体I通过交联反应结合到玻璃片上后，适配体I与凝血酶第一个结合位点特异性结合，然后凝血酶的第二个位点与标记有CdS／CPs复合材料的适配体1I结合形成夹心式结构。由于凝血酶的量与CdS／CPs复合材料的量呈一定的依从关系，因此，可以通过检测结合到玻璃表面_LCdS／CPs中Cd2+的量对凝血酶进行间接定量。再者，由于合成的CdS／CPs具有高的稳定性和携带大量的CdS纳米粒子，可以使凝血酶检测下限低达60amol，检测线性范围跨度达3个数量级。此方法制备简单快捷，已用于实际样品中凝血酶的检测，获得满意结果。§5．2实验部分5．2．1材料和试剂p—D一葡萄糖购自上海化学试剂厂，水合氯化镉(CdCl2"2．5H20)、硫代乙酰73 胺(C2H5NS)、巯基丙酸(MPA)、p(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)(98％)、十二烷基磺酸钠(SDS)、凝血酶、牛血红蛋白、牛血清蛋白、溶菌酶、胰酶购自Sigma-Aldrich公司，硼氢化钠(NaBH4)购置于国药试剂厂。寡核苷酸购自上海生工有限公司，序列如下，5’端修饰有氨基的适配体I序列(AptamerI)：5’H2N一(CH2)6一ATAGGTTGGTGTGGTTGG；5’端修饰有巯基的适配体II序列(AptamerII)：5’SH-(CH2)6-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT；5’端修饰有巯基的稀释探针序列(DilutingDNA)：5’SH一(CH2)6-GAGCGGCGCAACATTTCAGGTCGA．所用试剂均为分析纯。实验用水来自Milli．Q纯化系统。透射电子显微镜图(TEM，Japan)用JEOL公司的JEM．2100拍摄所得。X射线光电子能谱(XPS)使用ESCALAB250型X射线光电子显微镜(ThermoFisherScientificCo．，USA)测得。紫外光谱在UV-vis分光仪(Perkin-Elmerinstruments，USA)上测得。微波反应在微波加热系统MARS．5(CEM，USA)上完成的。用Rame-Hart．100进行接触角测量，电化学检测在CHI750A(上海辰华)电化学分析仪上完成。电化学装置为传统的三电极系统，其中铂片为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，修饰玻碳电极(GCE)为工作电极。5．2．2CPs、CdSICPs和CdSNIPs的制备CPs的制备根据文献利用微波水热方法制成[23】。主要步骤如下：将2．5g的葡萄糖溶于20mL水中形成均一溶液，然后在加热的功率为200W，温度为170。C，压力为180psi的条件下于反应釜中反应20min。产物用水洗3次后60。C条件下干燥。CdS／CPs的制备方法根据文献稍作修改【25]。利用CPsl_功能化基团对金属的配位作用，在特定位置上成核，生长CdS，(如图5—1)。具体步骤如下：先将3．5mg的CPs溶于体积比为3：1：6的H2S04、HN03和水的混合液中放置20rain，用水洗至pH为7．O后配成15mL的水溶液，用0．10M的Na0H将其调成pH10．0，搅拌 下将15mL浓度为O．50mM的CdCl2加到以上均一分散液中，反应3h后加入15mL新配的C2HsNS，80。C条件下反应5h。冷却至lJ40。C后力nA50止的MPA反应1h，整个反应在N2氛保护下进行。制得的CdS／CPs用水洗涤4次后分散于2mL50mMTris-HCl(pH7．4)溶液中放入冰箱备用。Figure5-1．SchematicdiagramrepresentationofpreparationprocedureofaptamerII／CdS／CNPsbioconjugates．CdSNPs的制备方法与CdS／CPs基本相同，只是制备过程中不}JllCPs。搅拌的情况下用0．10M的NaOH将15mL浓度为0．50mM的CdCl2调成pH10．0，然后加入15mL新配的C2HsNS，80。C反应5h。冷却至1]40。C后加入50止的MPA并反应1h，整个反应在N2氛保护下进行。制得的CdSNPs用超滤膜进行超滤后分散于2mL浓度为50mM的Tris-HCl(pH7．4)，最后放入冰箱中备用。5．2．3AptamerH／CdSNPs和AptamerH／CdS／CPs的制备AptamerII／CdSNPs和AptamerII／CdS／CPs的制备方法根据Willner报道的方法稍作修改【26]。]驭CdS／CPs或者CdSNPs0．5mL与O．10“M的适配体II和O．50“M稀释探针混合并加入到50mMpH7．4的Tris-HCl缓冲溶液中，避光轻振过夜，4。C1拘条件下，10000rpm的转速下离心10min，用50mMTris-HCl缓冲溶液洗涤3次，去除表面吸附的杂质之后放入冰箱中备用，用之前按照1：5进行稀 第五章释。5．2．4凝血酶识别界面的组装玻片基底先在Piranha洗液中(70％H2S04，30％H202)浸泡12h，超纯水彻底冲洗后，用N2吹干，放入含1％GPTMS的丙酮溶液进行硅烷化中过夜，用丙酮和乙醇彻底冲洗，去除表面物理吸附的GPTMS，N2吹干得到硅烷化的玻片。将适配体I固定在玻片上的过程如下：将10止浓度为1pM的探针I(10mMTris-HCl，含lm／VlEDTA，pH7．4)滴涂于硅烷化的玻片上反应3h，用50mMpH7．4的Tris．HCI淋洗液和超纯水交替淋洗3次，除去未反应的氨基适配体I。未反应的环氧基用NaBH4(1mg溶于3mLpH7．0PBS和1mL乙醇)还原5min，用0．2％SDS洗两次，吹干后备用。将修饰有适配体I的玻璃片浸入100此一定量的凝血酶中杂交40min(除了考察杂交时间的影响时)。杂交溶液为50mMTris—HCl，其中含1M的NaCl和1rnlVl的MgCl2。用淋洗液和二次水冲洗，将AptamerII／CdSNPs或AptamerII／CdS／CPs滴涂到玻璃片上，室温下温育40min。用淋洗液和超纯水分别冲洗3次除去未结合的AptamerII／CdSNPs和AptamerII／CdS／CPs。5．2．5溶出伏安检测将结合了AptamerII／CdSNPs或AptamerII／CdS／CPs的玻片在200儿浓度为0．1M的HN03中超声20min，用于溶解其中的CdSNPs。得到的溶液转移至800灿的NaAc--HAc缓冲溶液中(O．2M，pH5．2)，采用SWV检测溶解出的Cd2+。为了有效地检测Cd2+，玻碳电极先镀一层汞膜。汞膜的制备方法：将玻碳电极浸入含有40¨g／mL的Hg。2+的NaAc—HAc缓冲溶液中(0．2M，pH5．O)，在．1．0V的电位下扫描40S后，再于．0．9—0．2V电位之间循环扫描四次，冲洗电极即制的汞膜电极，整个过程在N2氛条件下。以镀汞膜的玻碳电极为工作电极，N：保护下，在。1．1V电位下电化学沉淀6min，然后在一0．9一O．2V电位问用SWV进行cd2+的检测。电位跃迁为4mV，频率为25Hz，振幅为25mV。 南京大学博士掌位论文第五章5．2．6血浆的处理血浆的处理根据文献[27]。主要步骤如下：将5此的0．25％胰酶加入到50此血浆中，使凝血酶原转化为凝血酶，然后jJIL,X,1皿浓度为50mM钙离子使凝血酶转化完全。然后将45皿浓度为0．50pM鱼精DNA加入到血浆中防止适配体降解，最后样品分别用杂交液进行稀释，稀释比例分别为1：1．5×107，1：2．0x107，1：2．5x107。§5．3结果与讨论5．3．1CdS／CPs的表征Figure5-2．(A)TEMimageofcarbonNPs．(B)TEMimageofCdS／CNPsconjugates．(C)HR—TEMimageofCdS／CNPsconjugates．(D)SelectedareadiffractionpatternofCdS／CNPsconjugates近年研究表明纳米粒子可以作为载体，负载大量酶，用于传感器的构建和分析[23，28]，然而，常规的方法相对比较繁琐。我们利用原位合成的方法以CPs为载体负载大量的CdSNPs形成CdS／CPs复合物，制备过程的示意图如图5．1。为了 南京大掌博士掌位论文在CPs表面得到大量的．COOH，首先将CPs在酸溶液中处理，进行表面氧化，然后加入NaOH使CPs表面一COOH转化为．COONa，当CdCl2加入其中后，Cd2+与CPs表面的Na+进行离子交换，形成一COOCd2+，加入的c2H5Ns作为S源，在CPs表面形成一层CdSNPs，用MAP进行保护形成均一的CdS／CPs复合物。图5．2是CPs和CdS／CPs复合物的TEM图，从图5．2A可以看出，CPs尺寸大约在200nin，尺寸比较均一，并且分散性好。形成CdS／CPs复合物后(图5．2B)，其尺寸在212--e2．1nm，表面比较粗糙。从图5．2A到图5．2B，粒径的增加表明CdSNPs均匀的包裹在CPs表面。图5．2C是CdS／CPs复合材料的高分辨率透射电镜图(HR．TEM)，图5．2D是选区衍射图，图中衍射环位置与强度分别对应于闪锌矿结构CdS的(111)，(220)和(311)面。Figure5-3．XPSspectraofcarbonNPsandCdS／CNPsconjugates：(A)Cd；(B)s；(C)c；(D)OXPS是一种对表面灵敏响应的检测技术，可监测材料表面5rim．10nm的元素存在信息。CPs和CdS／CPs复合物的xPS如图5—3，在图5．3A和5—3B中，CdS／CPs复合物有3个峰，峰位置分别在162．8eV，405．2eV和411．6eV，分别对应于S2p、 固堕竺竺坚—————————旦Cd3d5，2fl：ICd3d3，2的结合能，这些值与文献值非常吻合[30]，说明CdS／CPs复合物表面存在S和Cd。图5．3C和5．3D中，可以观察到C1s和Ols的结合能谱，证明CdS／CPs复合物中CPs的存在。以上Ⅺ，S结果与TEM结果一致。5．3．2识别界面的组装利用Apt锄erII／CdS／CPs对凝血酶的检测示意图如图5—4。经过GPn，IS处理后的玻璃表面带有环氧基，与带有氨基的配体I进行交联，使氨基适配体I固定到玻璃表面，然后将凝血酶、AptamerII／CdS／CPs分别与固定有适配体I的玻片温育，通过凝血酶与适配体的特异性结合形成夹心式结构。Figun5-4．Schematicdiagramrepresentationofthesandwich—typestrategywithCdS／CNPsconjugatesaSsignalamplificationdevice．我们采用UV对AptamerII／CdS／CPs进行了表征(如图5．5)。在整个扫描波段，CPs的水溶液没有明显的吸收峰(图5—5b)，曲线a是CdS／CPs水溶液的情况，在473nm处出现了一吸收峰，对应CdSNPs的特征吸收峰，说明CdSNPs成功的被负载至I]CPs表面。曲线c是AptamerII／CdS／CPs紫外吸收情况，在260nm附近出现了新的吸收，该位置对应适配体的吸收。表IjfJAptamerII成功的连接至UCdS／CPs上形成TAptamerII／CdS／CPs。根据文献报道[3l】，我们计算了CdSNPs的粒径为6．3nln，这一结果与图5—2B的TEM图的结果比较吻合。若按照CPs表面均匀覆盖一层粒径为6．3nm的CdSNPs来计算，每个CPs表面负载CdSNPs的量为4．0×103个，与标记单个CdSNPs相比，可以显著放大检测信号。 南京大掌博士掌位论文Figure5-5．Absorptionspectraof(a)CdS／CNPsconjugates，(b)carbonNPsand(c)AptamerII／CdS／CNPsbioconjugates．Figure5石．Contactanglesof(a)GPTMS—silylanizedglass，(b)aptamerIimmobilized(a)and(c)aptamerII／CdS／CNPsbioconjugatesfurtherbindingon(b)接触角用来表征基底及杂交后界面的亲水性(如图5-6)。GPTMS功能化的玻璃表面(5—6a)，适配体I修饰的玻璃片(5—6a)和结合了AptamerII／CdS／CPs的玻璃表面(5-6a)的接触角分别为60．3。，44．5。和30．2。[32】。适配体I修饰的80 玻璃片的接触角比GPTMS功能化的玻璃表面接触角要小，是由于DNA上的磷酸骨架带负电，本身亲水性比较强，适配体I的修饰改善其表面的亲水性。当AptamerII／CdS／CPs结合到玻璃片表面后，由于AptamerII／CdS／CPs表面也具有大量带负电的磷酸骨架，因此接触角进一步最小。由于AptamerII／CdS／CPs在玻璃片上的结合量直接与凝血酶的量有关，因此可以通过酸溶解AptamerII／CdS／CPs中的CdSNPs，测定释放的Cd2+的量来间接确定凝血酶的含量。5．3．3实验条件的优化适配体I的固定量和适配体与凝血酶的温育时间，影响适配体与凝血酶的结合效率和最终检测信号。因此对适配体I的固定浓度和温育时间进行了优化(如图5．7)。首先固定凝血酶浓度为O．50fM，对适配体I的浓度进行优化(图5．7A)。发现适配体I的浓度分别为0．10pM、O．50pM、1．0“M、2．0“M时，电流随着浓度的增加而增大，在浓度为1．0¨M时检测信号达到平台。Figure5-7．(A)lnfluenceofaptamer1concentrationonSWVresponseto50fMthrombininTris—HCl(10mM，pH7．4)．(B)InfluenceofspecificbindingtimeonSWVresponseto50IMthrombininTris-HCI(10mM，pH7．4)．Theerrorbarsrepresentthestandarddeviation(S．D．)ofthreemeasurementsconducted．图5-7B是固定适配体I的浓度1．0p,M，凝血酶浓度为0．50flvl，杂交时间从20min增加到50min时对电流的影响。发现当杂交时间为40min时电流达到平台。为得到最稳定、最灵敏的信号，我们选择适配体I浓度为1．0pM，杂交时间为40min。 南京大学博士掌位论文第五：，t5．3．4检测性能Figure5-8．(A)SWVresponsesforthethrombinofO．10fM，O．50fM，1．0fM，5．0fM，10fM，50fM，100fMwithaptamerII／CdS／CNPsbioconjugates．(B)LinearrelationshipbetweenthepeakcurrentandthelogarithmofthethrombinwithaptamerII／CdS／CNPsbioconjugates；(C)SWVresponsesforthethrombinof0．50pM，1．0pM，5．0pM，10pM，50pM，100pMwithaptamerII／CdSNPs．(D)Linearrelationshipbetweenthepeal(currentandthelogarithmofthethrombinwithaptamerII／CdSNPs。Theerrorbarsrepresentthestandarddeviation(S．D。)ofthreemeasurementsconducted．在最优化条件下，峰电流随着凝血酶浓度增加而增加(图5．8A和5—8B)。电流与DNA浓度的对数值在一13～一16范围内呈良好的线性关系，线性回归相关系数为0．999，检测下限低至60aM。这一检测限意味着在100laL溶液中能检测到3600个凝血酶分子。相同的条件下对用单个CdSNPs做标记物与用CdS／CPs做标记物做了对比实验(图5—8C和5-8D)。单个CdSNPs做标记物时，电流与凝血酶浓度的对数值在一11—·13范围内呈量好的线性关系，检测下限为0．08pM。用CdS／CPs做标记物的 固竺堂些坐鱼———————————旦检测限比用单个CdSNPS做标记物的检测限低3个数量级。这一高灵敏的检测方法是由于用CdS／CPs做标记物时，CPs荷载了大量的CdSNPs，因而放大了检测信号，提高了检测的灵敏度。另外，该方法的检测下限相要比以纳米金为标记方法的检测限(20pM)[71、生物条码方法的检测限(6．2fM)『3317}Ⅱ以硫化镉纳米粒子．寡聚核苷酸一纳米金复合材料为标记物的检测限(O．55fM)【34】都要低。5．3．5特异性检测Figure5-9．Peal(currentresponsesfromSWVforthebiorecognizationeventintheabsence(a)andinthepresenceofdifferentproteins(b-O：(b)1州BSA，(c)1山lysozyme，(d)1mMBHb，(e)0．05pMthrombin，(f)amixtureof0．05pMthrombin，1洲BHb，1删lysozymeandl脚BSA．ErrorbarsrepresentS．D．，n=3．特异性是评价传感器选择性的重要标准。通过比较不同的蛋白即：空白、1．OpM的牛血清蛋白、1．0pM的溶菌酶、1．0肛M的牛血红蛋白、0．05pM凝血酶以及前面四种物质的混合液所产生的信号(如图5—9)，发现在空白和高浓度的牛血清蛋白、溶菌酶、牛血红蛋白中产生的信号均非常弱，甚至可以忽略。而在凝血酶中产生的信号与包含其它蛋白的凝血酶混合液中产生的信号基本一样。说明即使在其它蛋白共存情况下，也可以特异性的对凝血酶进行检测。这一高选择性是由于适配体与凝血酶的高特异性结合的结果[35．38]。 在最佳的实验条件下，我们用7根电极对浓度为50fM的凝血酶进行检测，考察该方法的重现性。发现相对标准偏差仅为±5．2％，结果令人满意。5．3．6血浆中凝血酶的检测为了考察该方案的实用性，我们对实际血浆样品中凝血酶进行检测，检测结果如表5．1所示。实验发现，检测结果的回收率大于90％，但均小于100％，这可能是由于基质中存在与目标结合的其它蛋白[39，401，减小了目标与AptamerII／CdS／CPs的结合机会。与利用适配体进行检测的其它方法相比，该方法在灵敏度、选择性等方面基本满足复杂样品的检测要求。Table5-1．Assayresultsofthrombininrealplasmasample§5．4结论本工作通过原位合成的方法在C球表面生长CdS纳米粒子成功制备出一种新颖的复合功能CdS／CPs材料，并以其作为夹心式检测方法的示踪物，使得检测信号显著增强。本方法不需要复杂的材料制备过程，而由此材料构建成的检测体系对凝血酶的检测线性范围宽，检测下限低，选择性高；本文所构建的测试系统用于复杂样品中低含量目标蛋白的检测，结果满意。通过合理的设计，本系统有望用于其它低含量小分子、病毒、蛋白等的检测。参考文献[1]Wilson，M．S．；Nie，W．Y．AnalChem．2006，78，6476．6483． 南京大掌博士掌位论文第五||f2】Schweitzer,B．；Wiltshire，S．；Lambert，J．；O'Malley,S．：Kukanskis，K．；Zhu,Z．R．；Kingsmore，S．F．；Lizardi，P．M．；Ward，D．C．Proc．Natl．Acad．Sci．USA2伽岫，97,10113．10119．【3】Malhotra,R．；Patel，V．；Vaque，J．P．；Gutkind,J．S．；Rusling，J．F．AnalChem．2010，82，3“8．3123．【4】【5]5Nam，J．M．；Thaxton，C．S．；Mirkin，C．A．Science2003，301，1884·1886，Rosi，N．L．；Mirkin，C．A．Chem．Rev．211115，105，1547—1562．【6】Song，S．P．，Qha，Y．，He，Y．，Huang，Q．，FanC．H．，Chen,H．Y，Chem．Soc．Rev．2010，39(11)。4234--4243。[7】Li，D．，Song，S．P．，FanC．H．，Acc．Chem．Res．2010，43(5)，631—641[8]Wang，J．，Xu,D⋯KKawde，A．N．，Poisky,R．，AnaLChem．2001，3(22)，5576—5591[9]Wang，J．；L沁G．D．；Merkoci，A．■Am．Chem．Soc．2003，125，3214—3215【10]Wang，J．；Liu,G．D．；Polsky，R．；Merkoci，A．Electrochem．Commun．20舵，4，722—726．f11]Liu，G，D．；Wang，J．：Kim，．14Jan，M．R．；Collins，O。E，AnalChem．211114,76,7126-7130．【12】Gao，H．W．；Zhong，J．H，；Qin，P．；Lin，C．；Sun，W．；Jiao，K．Microchim．Acta21109，1657173一178．【13】Hansen，J．A．；Wang，J．；Kawde，A．N．；Xiang，Y．；Gothelf,K．V．；Collins，G．J=Am．Chem．Soc．：2006,128,2228·2229。【14】Matin，S．；Merkoci，A．Nanotechn01．21109，20，055101-055106．[15】Numnuam，A．；Chumbimuni—Torres，K．Y．；Xiang，Y．；Bash，R．；Thavarungkul，P．；Kanatharana,P．；Pretsch，E．；Wang，J．；Bakker，E．JAm．Chem，Soc．2咖暇，130，410-411【16】Xu，Y．；Cai，H．；He，P．G．；Fang，Y．Z．Electroanalysis2004，16，150—155【】7】Zhu，N．N．：Zhang，A．P．；He，P．G．；Fang，Y．Z．Analyst2003，12&260—264【18]Qian，J．；Zhang，C．Y．；Cao，X．D．；Liu，S．Q．Anal,Chem．2010，82，6422-6429．[19】Chen，L．Y．；Chen，C．L．；Li，R．N．；Li，Y．；Liu，S．Q，Chem．Commun．211119，2670．2672．【20】Dong，H．F．；Yan，F．；Ji，H．X．；Wong，D．K．Y．；Ju，H．X．Adv．Funct．Mater．2010，20，I173一1179．85 南京大掌博士掌口晴e文第五j}[21】Ding，C．F．；Zhang，Q．；Lin,J．M．；Zhang，S．S．Biosens．Bioelectron．2009,24，3140—3143．【22】Du，D．；Zou,z．X．；Shin，Y．s．；Wang，J．；Wu，H．；Engelhard，M．H．；Liu，J．；Aksay，I．A．；Lin，Y．H．AnalChem．201082，2989-2995【23】Cui，R．J．；Liu,C．；Shen,J．M．；Gao，D．；Zhu,J．J．；Chen，H．Y．Adv．Funct．Mater．211118918，2197—2204．【21】Wang，X．F．；Zhou,Y．；Xu，J．J．；Chen，H．Y．Adv．Funct．Mater．2009，19，1444—1450[22】Gill，R．；Willner，I．；Shweky，I．；Banin,U．J=ehys．Chem．B2005，109,23715·23719[23】Zheng，J．；Feng，W，；Lin，L．；Zhang,F．；Cheng,G．；He，P．；Fang，Y．Biosens．Bioelectron．2∞7，23，341-347．【24】Pei，H．，Lu，N．，Wen，Y．L．，Song，S．P．，Liu,Y．，Yah,H．，Fan，C．H．，AdvMater．2010，22(42)，4754—4758．[25】Wang，X⋯FZhou,Y．，Xu，J．J．，Chen，H．Y，Adv．Funct．Mater．211119，19(9)，1444—1450．【26】Gill，R．，Willner,I．，Shweky,I．，Banin，U．，Jehys．Chem．B2005，109(49)，23715-23719。【27】Zheng，J．，Feng，W．，Lin，L．，Zhang，F．，Cheng，G，He，P．，Fang，Y．，Biosens．Bioelectron．2007，23(3)，341-347．[28】Wei，M．；Sun，L．G．；Xie，Z．Y．；Zhi，J．F．；Fujishima,A．；Einaga,Y．；Fu，D．G．；Wang，X．M．；Gu，Z．Z．Adv．Funct．Mater．2008，18,1608—1608【29]Unni，C．；Philip，D．；Smitha,S．L．；Nissamudeen，K．M．；Gopchandran，K．GSpectrochim．ActaPartA2009，72，827—832．【30】Zelner，M．；Minti，H．；Reisfeld，R．；Cohen，H．；Tenne，R．Chem．Mater．1997，9，2541-2543．【31】Yu，W．W．；Qu,L．H．；Guo，W．Z．；Peng，X．G．Chem．Mater．2003，15，2854-2860[32】Correia,N．T．；Ramos，J．J．M．；Saramago，B．J．V．；Calado,J．C．G．ZColloidInterfaceSci．1997，189，361—369．【33】Zhang，X⋯RQi，B．P．，Li，Y．，Zhang，S．S．，Biosem．Bioelectron．2009，25(1)，259-262【34】Ding，C．F．，Ge，Y’，Lin，J．M．，Biosens．Bioelectron．2010，25(6)，1290-1294．【35]Sankaran，N．B．；Nishizawa,S．；Seino，T．；Yoshimoto，K．；Teramae，N．Angew．ChemInt．Ed．21106，45，1563·1568 南京大掌博士掌位论文第五章[361Shangguan，D．；Li，Y．；Tang，Z．W．；Cao，Z．H．C．；Chen，H．W．；Mallikaratchy，P．；Sefah，K．；Yang，C．Y．J．；Tan,W．H．Proc．Natl．Acad．&tUSA．2006，103，11838·I1843．【37】Wang，X．L．；Li，F．；Su,Y．H．；Sun,X．；Li，X．B．；Schluesener,H．J．；Tang，F．；Xu，S．QAnal．Chem．2004,76,5605—5610．[38]Wang，J．；Jiang，Y．X．；Zhou,C．S．；Fang，X．H．Anal．Chem．20惦，77,3542—3546[39】Xiao，Y．；Lubin，A．A．；Heeger,A．J．；Plaxco，K．W．Angew．Chem．Int．Ed．211115,44，5456．5459．[40】Ding，C．F．；Ge，Y．；Lin,J．M．Biosens．Bioelectron．2010，25，1290-129487 南京大学博士掌位论文附录期刊论文：附录作者在攻读博士学位期间发表和待发表论文1．Xiao-YaDong，Xiao-NaMi，Wei-WeiZhao，Jing-JuanXu，奉Hong—YuanChen．CdSnanoparticlefunctionalizedcolloidalcarbonparticles：Preparation，characterization，andapplicationforelectrochemicaldetectionofthrombin．Biosens．Bioelecton．2011，26，3654—3659．2．Xiao-YaDong,Xiao-NaMi，BoWang，Jing-JuanXu,+Hong—YuanChen．SignalamplificationforDNAdetectionbasedontheHRP-functionalizedfe304nanoparticles．Talanta．2011，84，531·537．3．Xiao-YaDong,Wei—WeiZhao，Jing—JuanXu．Hong·YuanChen．}Magneticparticlesandcadmiumsulfidenanoparticlestaggingforsignal-amplifyingdetectionofnucleicacids．ScienceChh2aChemistry．2011，54(8)，1304·1310．4．Xiao-YaDong,Wei—WeiZhao，Jing—JuanXu，+Hong—YuanChen．ElectrochemicalDNAbioanalysisbasedonthestableYjunctionprobe．Submitted．会议论文：1．董晓娅，徐静娟，陈洪渊，基于纳米金膜与磁性复合功能材料双信号放大的DNA传感器的研究，第三届全国生命分析化学学术报告与研讨会论文集，2010年8月，中国北京。2．董晓娅，米小娜，赵伟伟，徐静娟，陈洪渊，CdS纳米粒子功能化C球的制备及其对凝血酶的电化学检测，第十一届全国电分析化学学术会议论文集，2011年5月，中国聊城。88 南写C大掌博士掌位论文致谢本论文是在蓖的摹师陈洪渊院士和徐静娟教最的庵心指寻下兜成的。三年来，在掌术上，先生翱博的掌识、敏锐的思维、严谨的治学态度和勤勉的工作作风元不令我折服。先生引领羲进入掌科前沿，1电蕊供了自由的氛固，引冀我对科研的兴趣，井鼓励我不畏困难勇于创新，文促爱在工作中克己造取，迈上新的台阶。在生活中，先生不但给予了爱元饿不鼍的关怀，他竟l的品格、谦和的风范和育尚的品位，也影响了囊做事和—认的志度，是戋终生致仿的榜样。徐老师以渊博的知识、活跃的掌术思想、开放的科研思路启戋井引导受走进科掌的最堂。在掌术上，她思维敏锐、治掌严谨、筑兢业业。徐老师为我提供了良好的实脸环境，鼓励创新，藏促进取，指引方向，爱前毒中的每一步，凝景●思师的心血和汗水。在生活中，徐老师也给予了我元做不互的关怀。她璺忍不拨的性格、开朔乐观的态度使我受蓝臣浅。值此论文兜成之际．炙要向两位恩婀馆戈以l毒Ⅲ譬的感谢l在攻读博士学位期间．我得到了夏兴华教授、鞠规先教授、朱俊杰教授、许丹科教授、余晓冬喇教援、秦玉到教擐以A分析化拳教研宣其他老师的指导与帮助．在此向他们表示衷心的感谢l衷心感谢囊们诹曩组的．所有闰掌。奉论文的兜成与奥簟室全俸罔掌的密切合作和热心帮助是分不开的。其中师弟赵伟伟，李锦一、孙一宝和师妹米．‘卜钾．他们直接参与了实t的完成．对囊的实l堤供了很大蛉帮动和支持。衷心感谢我的父母、弟弟和妹妹。他们的关心、鼓励、支持和帮助是瑟不昕前进的动力．在此值向他们表示裹心的感谢!曩后．感谢田囊自然科掌l金、重家杰出青年科学l金、重家自菇科掌基金曩L涮新研囊埔F-||啜目等对囊研宴譬L作的I的资助。●陶乞垭=o●一一聿oe只于南京，0掌