西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的抗性监测及抗性分子机理研究

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单位代码10635学号112013327001850硕士学位论文西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的抗性监测及抗性分子机理研究论文作者：鲜菲指导教师：毕朝位副教授学科专业：植物病理学研究方向：分子植物病理学提交论文日期：2016年05月30日论文答辩日期：2016年06月03日学位授予单位：西南大学中国重庆2016年06月 SouthwestUniversityM.Sc.DissertationMonitoringandmoleculemechanismsofresistancetotebuconazolebyMagnaporthegriseainSouthwestChinaCandidate:FeiXIANSupervisors:ChaoweiBISpeciality:PlantPathologyResearchField:MolecularPlantPathologySouthwestUniversity,Chongqing,ChinaJune,2016 目录目录目录................................................................................................................................I摘要..............................................................................................................................IABSTRACT.................................................................................................................III第一章文献综述..........................................................................................................11稻瘟病及稻瘟病菌概述........................................................................................11.1稻瘟病研究概述...............................................................................................11.2稻瘟病菌研究概述...........................................................................................12稻瘟病的药剂防治概述........................................................................................22.1重金属及有机汞类...........................................................................................22.2有机氯类...........................................................................................................22.3有机磷类...........................................................................................................22.4黑色素合成抑制剂...........................................................................................32.5甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂...............................................................................33DMIS类杀菌剂概述...............................................................................................33.1DMIs类杀菌剂主要品种................................................................................33.2DMIs类杀菌剂作用机理................................................................................43.3植物病原菌对DMIs杀菌剂的抗性研究进展...............................................43.4植物病原菌对DMIs类杀菌剂的抗性机理研究...........................................44本论文研究的目的及意义....................................................................................8第二章西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线建立..........................................91供试材料.................................................................................................................91.1菌株...................................................................................................................91.2药剂...................................................................................................................91.3培养基...............................................................................................................91.4含药平板的制作.............................................................................................102试验方法..............................................................................................................102.1稻瘟病菌的分离、纯化与保存.....................................................................102.2稻瘟病菌的孢子培养.....................................................................................102.3稻瘟病菌对戊唑醇敏感性基线的建立.........................................................102.4部分地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性差异性分析.....................................113结果与分析..........................................................................................................11i 西南大学硕士学位论文3.1水稻稻瘟病调查、采样及病原菌分离结果.................................................113.2稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线.....................................................................133.3不同地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性差异性.............................................154讨论......................................................................................................................16第三章西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的抗性监测....................................................171试验材料..............................................................................................................171.1菌株.................................................................................................................171.2药剂.................................................................................................................171.3培养基.............................................................................................................171.4含药平板制作................................................................................................172试验方法..............................................................................................................172.1稻瘟病菌对戊唑醇的最低抑制浓度测定.....................................................172.2西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的田间抗性监测.............................................173结果与分析..........................................................................................................183.1稻瘟病菌对戊唑醇田间抗性监测的区分剂量.............................................183.2西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的田间抗性分布.............................................184讨论......................................................................................................................19第四章稻瘟病菌对戊唑醇抗性菌株的生物学特性研究........................................211试验材料...............................................................................................................211.1菌株.................................................................................................................211.2药剂.................................................................................................................211.3培养基.............................................................................................................211.4水稻.................................................................................................................212试验方法..............................................................................................................212.1抗戊唑醇稻瘟病菌的药剂驯化.....................................................................212.2戊唑醇抗性菌株的遗传稳定性测定.............................................................222.3戊唑醇抗性菌株适合度测定.........................................................................222.4温度和pH值对抗性菌株和亲本菌株菌丝生长影响的测定......................232.5戊唑醇抗性菌株的交互抗性测定.................................................................233结果与分析...........................................................................................................243.1戊唑醇室内抗性菌株的获得.........................................................................243.2戊唑醇抗性菌株的遗传稳定性.....................................................................243.3戊唑醇抗性菌株的适合度.............................................................................24ii 目录3.4温度和PH值对抗性菌株和亲本菌株菌丝生长的影响.............................283.5戊唑醇抗性菌株对不同药剂的交互抗性.....................................................304讨论......................................................................................................................33第五章稻瘟病菌戊唑醇抗性的分子机理研究........................................................351试验材料..............................................................................................................351.1菌株.................................................................................................................351.2试剂.................................................................................................................351.3培养基.............................................................................................................351.4仪器.................................................................................................................352试验方法..............................................................................................................362.1病原菌基因组DNA提取..............................................................................362.2cyp51基因的扩增测序..................................................................................362.3病原菌RNA的提取......................................................................................382.4cDNA的转化................................................................................................382.5cyp51基因的表达量的测定..........................................................................393.结果与分析...........................................................................................................403.1抗性菌株与亲本菌株的cyp51基因序列差异.............................................403.2cyp51基因表达量测定结果..........................................................................424讨论.......................................................................................................................43第六章结论与展望....................................................................................................451结论......................................................................................................................452展望......................................................................................................................45参考文献......................................................................................................................47附录..............................................................................................................................57致谢..............................................................................................................................69学习期间发表的论文及参加的课题..........................................................................71iii 摘要西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的抗性监测及抗性分子机理研究硕士研究生：鲜菲指导教师：毕朝位摘要稻瘟病是影响水稻产量和稻米品质的重要病害，目前对于稻瘟病的防治依然以化学防治为主，西南地区是我国稻瘟病的常发区，防治药剂主要有三环唑、稻瘟灵等，药剂的长期使用所带来的抗药性问题给稻瘟病的防治带来了重大隐患。戊唑醇是广谱性的内吸性DMIs类杀菌剂，对于多种真菌的防治都有良好的效果，在我国很多地区开始用于防治稻瘟病，但在西南地区还未广泛使用。本研究拟通过对西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线的建立，田间抗性监测，抗性菌株的生物学特性以及抗性分子机理等方面的研究，为该药剂在本地区用于防治稻瘟病提供理论指导。1.西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线随机选取分离自西南地区的稻瘟病菌野生菌株150株，通过菌丝生长速率法测定了它们对戊唑醇的敏感性，根据EC50值的分布建立了稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线。结果表明，EC50值的区间为0.0475~0.5996μg/mL，平均值为0.2154±0.1497µg/mL，其中最不敏感菌株的EC50值是最敏感菌株的12.62倍。敏感性频率分布呈连续性单峰曲线，因此本研究以供试菌株的EC50平均值作为西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线。同时发现，分离自不同地区的稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性呈现显著性差异：分离自四川绵阳的菌株最敏感，其平均EC50值为0.0872±0.0461µg/mL；贵州六枝特区和四川宣汉的菌株最不敏感，平均EC50值分别为0.4570±0.0855µg/mL和0.4436±0.1289µg/mL；四川绵阳的菌株与四川宣汉的菌株对戊唑醇的敏感性相差5.09倍。2.西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的田间抗性分布使用菌丝生长速率法测定了随机选取的30株稻瘟病菌对戊唑醇的MIC值，并以此作为抗性监测的区分剂量对所有采集分离的菌株进行抗性监测。MIC值分布在1.5~4.0µg/mL之间，最大的MIC值为4.0µg/mL。因此，本研究以4.0µg/mL作为稻瘟病菌对戊唑醇的敏感菌株和抗性菌株的区分剂量。对分离自西南地区的1014株稻瘟病菌的监测结果表明，本地区稻瘟病菌对于戊唑醇主要表现为敏感，仅在重庆涪陵和四川宣汉各有一株病菌表现出低抗。虽然西南地区已经有对戊唑醇产生抗药性的菌株出现，但是抗性较低且频率较低，四川和重I 西南大学硕士学位论文庆的的抗性菌株发生频率分别为0.33%和0.21%，因此在制定了合理的与其他药剂混用的策略下可以将戊唑醇作为西南地区进行稻瘟病防治的药剂，但是要做好田间抗性的实时监测工作，以延长药剂的使用寿命。3.稻瘟病菌戊唑醇室内抗性菌株的生物学特性通过稻瘟病菌野生菌株进行室内戊唑醇药剂驯化得到两株中抗菌株PWS2-1和PMY30-1，EC50值分别为2.5736µg/mL和1.7689µg/mL，抗性倍数为25.46和31.26。将其在无药的平板上连续培养8代以后，仍然表现为中抗，因此说明其抗性可以稳定遗传。对它们及其亲本菌株的生物学特性进行研究，结果表明，抗性菌株的生长速率显著低于其亲本菌株，产孢量也低于其亲本菌株，PWS2-1与PMY30-1的离体适合度分别为0.76和0.04，因此抗性菌株的离体适合度低于其亲本菌株。同时在水稻叶片上进行了孢子悬浮液的接种测定其致病性，结果表明，敏感菌株PWS2和PMY30的病斑长度分别为6.5±1.00mm和6.9±2.32mm，而抗性菌株PWS2-1和PMY30-1的病斑长度分别为3.6±0.52mm和5.0±0.90mm，说明抗性菌株的致病性显著低于其亲本菌株。测定其在不同的温度及pH值条件下的生长速率，结果表明，抗性菌株对温度和pH值的适应性与其亲本菌株基本一致。而对于不同作用机制的杀菌剂进行敏感性测定的结果表明，戊唑醇抗性菌株对于DMIs类杀菌剂烯唑醇、苯醚甲环唑存在正交互抗性，对于稻瘟灵、三环唑、稻瘟酰胺、吡唑醚菌酯则没有表现出交互抗性。4.稻瘟病菌对戊唑醇抗性的分子机理用CTAB法提取病原菌的DNA，使用特异性引物Cyp51-ⅠF:5’-ATGGGCCTTCTACAGGACACC-3’/Cyp51-ⅠR:5’-TTAGCGCCTCTCCCAGTAAATT-3’；和Cyp51-ⅡF:5’-CTACGCAGTCTTCGGGCT-3’/Cyp51-ⅡR:5’-ATGGCTTTCTTCTTCCC-3’分别对室内抗性菌株PWS2-1和PMY30-1及其亲本菌株PWS2和PMY30的cyp51-Ⅰ和cyp51-Ⅱ基因进行克隆，测序，比对，探寻抗性菌株的突变位点。结果表明，抗性菌株各自的突变位点并不一致：菌株PWS2-1的cyp51-Ⅰ基因未发生突变，cyp51-Ⅱ基因具有3个突变位点，分别为R163C、F253I和V257A；菌株PMY30-1的cyp51-Ⅰ基因具有1个突变位点，为R23G，而cyp51-Ⅱ基因未发生突变。同时对于抗性菌株PWS2-1和PMY30-1及其亲本菌株PWS2和PMY30的cyp51-Ⅰ和cyp51-Ⅱ基因的表达量进行了荧光定量PCR检测，结果表明，抗性菌株与其亲本菌株的cyp51-Ⅰ基因的表达量的变化趋势并不一致，抗性菌株PWS2-1的表达量较亲本菌株高，而抗性菌株PMY30-1的表达量较亲本菌株低；cyp51-Ⅱ基因的表达量则为抗性菌株明显低于亲本菌株。因此本研究所驯化的抗性菌株的抗性分子机理可能与cyp51基因的点突变有关而与其表达量的关系并不明确，这需要更进一步的实验进行验证。关键词：水稻稻瘟病菌；戊唑醇；敏感性基线；抗性监测；分子机制II AbstractMonitoringandmoleculemechanismsofresistancetotebuconazolebyMagnaporthegriseainSouthwestChinaCandidate:FeiXIANSupervisors:ChaoweiBIAbstractRiceblastisoneofthemostimportantricedisease,whichcausedseriouslossofriceproductionandquality.Currently,themajorstrategytocontrolthisdiseasewaschemicalfungicides,andSouthwestChinawastheregionwhichoccurredriceblastfrequently.Tricyclazoleandisoprothiolanewerethepopularfundicides,anditbroughtaboutpotentialsafetyhazardforafungicidewascontinuouslyusedforalongperiodofmanyyears.TebuconazolestillnotwidelyusedinSouthwestChinaisanewsystemictriazolefungicidewhichhasexcellentcontrolefficacyinmanyfungushasalreadyusedinotherregion.Inthisstudy,weestablishedthebaselineofMagnaporthegriseatotebuconazoleandmonitoredtheresistanceofisolatescollectedfromSouthwestChina,comparedthebiologicalcharacteristicsbetweentebuconazole-resistanceisolateswhichinducedbyfungicideinlaborandtheirparentisolatesandstudiedthepreliminarymolecularmechanismswhichtebuconazole-resistanceisolatesoccurringresistance.AndwewantedprovidetheoreticalguidanceforcontrollingriceblastofSouthwestChinabytebuconazole.1.SensitivitybaselineofMagnaporthegriseatotebuconazoleInthisstudy,thesensitivityto14α-demethylationinhibitorsfungicidetebuconazoleof150isolatesofMagnaporthegriseawastestedbymyceliumgrowthratemethod.StatisticalanalysisshowedthattheEC50valuesoftheseisolateswerebetween0.0475μg/mLto0.5996μg/mL,theaveragevalueofEC50was0.2154±0.1497μg/mLandthehighestEC50fortheleastsensitiveisolateswas12.62timeshigherthanthemostsensitiveisolates.Sensitivitydistributiontotebuconazolewasunimodalandcontinuouswithonlyonesusceptibility.So,weused0.2154±0.1497µg/mLasthesensitivitybaselineofMagnaporthegriseatotebuconazoleinSouthwestChina.ThesensitivityofMagnaporthegriseaisolatestotebuconazolein10countiesofSouthwestChinawasanalyzedbySPSS.StatisticalanalysisshowedthattherewassignificantdifferenceinEC50valuestotebuconazolebetweenpopulationsfromdifferentextents.AndtheaveragevalueofEC50ofisolatesfromMianyanginSichuanprovincewas0.0872±0.0461μg/mLwasthemostsensitive.TheEC50ofisolatesfromXuanhaninSichuanprovincewithameanvalueofIII 西南大学硕士学位论文0.4570±0.0855μg/mLandisolatesfromLiuzhitequinGuizhouprovincewithameanvalueof0.4436±0.1289μg/mLwerethemostnon-sensitive.2.MonitoringofresistantisolatesinSouthwestChina.30wildstrainsofMagnaporthegriseawereselectedfortestingtheminimuminhibitoryconcentration(MIC)valuebymyceliumgrowthratemethod.TheMICvaluewasusedtomonitorallisolatescollectedinSichuan,GuizhouandChongqingprovinceofChina.ThevaluesofMICrangefrom1.5to4.0µg/mL,so4.0μg/mLwasassignedasthedifferentialdoseoftebuconazole-resistantandtebuconazole-sensitiveisolatesofMagnaporthegriseainmonitoringtheresistance.Theresultshowedthattherewere2strainscomefromXuanhanandFulingrespectivelycangrowupin4.0µg/mltebuconazole.TestingEC50ofhypotheticresistantisolatesandcalculatingresistancefactor.TheresultshowedthattheirEC50were0.6512μg/mland0.6557μg/ml,theresistancefrequencywere3.02and3.04,respectively.SothemostofisolatesofMagnaporthegriseainSouthwestChinaweresensitivityandafewofthemwerelow-resistance.3.Biologicalcharacteristicsoftebuconazole-resistanceisolates.Inthisstudy,weobtainedtwomid-resistanceisolatesPWS2-1andPMY30-1byfungicidetaming.AfterculturedonPDAplateswithoutthefungicidecontinuouslyfor8generations,theyremainedresistance,sotheresistancecouldbeinheritedstable.Wecomparedthebiologicalcharacteristicsbetweenresistanceisolatesandtheirparentisolates,theresultshowedthatthegrowthrateandconidialproductionofresistantisolateswerebelowtheirparentisolates.Inoculatingthesporesuspensiononthericeleaves,theresultshowedthatthepathogenicityofresistantisolateswerelessthantheirparentisolates.BytestingmyceliagrowthrateofdifferenttemperatureandpHvaluesontheresistantstrainsandsensitivestrainwasdetermined.TheresultshowedthattherewasnosignificantlydifferenceintheeffectonthesensitiveandresistantstrainofpHvalueandtemperature.Testingthesensitivityofisolatestosixfungicideswhichhavedifferentmechanismofaction,theresultshowedthatthetebuconazole-resistanceisolateshavepositivecross-resistancetofungicidesofDMIs.Buttheydon’thavecross-resistancetoisoprothiolaneandtricyclazolewhichhavebeenwidelyappliedincontrollingofriceblast,sotebuconazolecouldsubstituteoralternatethesefungicides.4.Molecularmechanismsoftebuconazole-resistanceisolates.ThegenomesDNAofPWS2-1,PMY30-1andtheirparentisolatesPWS2,PMY30weregainedusingtheCTABmethodandthepartialnucleotidesequencesofcyp51-Ⅰandcyp51-ⅡgenewereobtainedbyPCRamplificationusingspecificprimersCyp51-ⅠF:5’-ATGGGCCTTCTACAGGACACC-3’/Cyp51-ⅠR:5’-TTAGCGCCTCTCCCAGTAAATT-3’andCyp51-ⅡF:5’IV Abstract-CTACGCAGTCTTCGGGCT-3’/Cyp51-ⅡR:5’-ATGGCTTTCTTCTTCCC-3’.Theresultshowedthatresistantisolatesbothhavemutationsitesbutnotunanimous.Comparedcyp51genesequencesbetweenPWS2-1andPWS2,theresultshowedthat,cyp51-Ⅰhavenotlocusmutationandthreemutationsitesincyp51-Ⅱgene,R163C，F253IandV257A.Comparedcyp51genesequencesbetweenPMY30-1andPMY30,theresultshowedthat,therehaveonemutationsiteincyp51-Ⅰgene,R23Gandhavenotlocusmutationincyp51-Ⅱgene.Testingexpressionlevelofcyp51-Ⅰandcyp51-Ⅱgenebyreal-timequantitativePCRbetweenresistantisolatesandsensitiveisolates,theresultshowedthatthetrendofcyp51-ⅠwasnotconsistencybetweenPWS2-1andPMY30-1,theexpressionlevelofPWS2-1washigherthanPWS2andtheexpressionlevelofPMY30-1waslessthanPMY30.Andthetrendofcyp51-Ⅱexpressionlevelofresistantisolateswerelessthantheirparentisolates.Sothemoleculemechanismsoftebuconazole-resistanceisolateswhichobtainedbyfungicidetamingmaybeconnectwithmutationsites,anddidnotrelatedtoexpressionofcyp51gene,butfurtherstudyisnecessarytoconfirmit.Keywords:Magnaporthegrisea;tebuconazole;sensitivitybaseline;resistancemonitoring;moleculemechanisms.V 第一章文献综述第一章文献综述1稻瘟病及稻瘟病菌概述1.1稻瘟病研究概述水稻是全球约半数人口的主食，根据国际水稻研究所的估算，为了满足人口增长的需要，在2020年水稻产量必须在目前的基础上再增加三分之一[1]。而在我国，水稻是65%以上人口的主食[2]，南方稻区是主要的水稻种植区域，包括华中，华东，华南及西南地区的18个省市，2002年南方稻区的水稻种植面积和总产均占全国的88.3%[3]。稻瘟病是水稻上的重要病害，在世界上的水稻种植区域均有可能发生，并且对水稻生产有严重的危害。每年在全球由于稻瘟病所造成的水稻减产量可达10~30%[4]，损失量足够喂养约六千万人口[1]。在我国，稻瘟病与水稻白叶枯病、水稻纹枯病合称为水稻三大病害，而稻瘟病每年都会在水稻种植区域有不同程度的发生和流行。近几年来，稻瘟病在长江中游、西南和东北等稻区持续爆发大流行，其损失的稻谷达数亿公斤，给我国的粮食安全带来了隐患[5]。在贵州地区，曾经多次爆发流行，常年发生面积在20万hm2左右[6]；而四川地区，也是稻瘟病发生的重灾区，尤其是近年来，由于生产上大批主栽品种抗性的丧失，其发病面积均在33.3万hm2以上，稻瘟病的流行正严重威胁着四川省水稻的生产安全[7]。1.2稻瘟病菌研究概述稻瘟菌的无性世代为灰梨孢菌（Pyiculariagrisea），属于半知菌亚门梨孢属；有性世代为灰色大角间座壳菌（Magnaporthegrisea），属于子囊菌亚门球壳目真菌。稻瘟病菌菌丝具有分隔和分枝，开始为无色，后变为褐色。分生孢子梗一般为3-5根丛生，有时候多达10根，从寄主的气孔或者表皮伸出，不分枝但有2-4个分隔，基部呈淡褐色，顶部的颜色则较浅，从顶部形成分生孢子，然后侧面生出短枝，再次形成分生孢子，循环连续多次。分生孢子则呈洋梨形，基部钝圆，顶端较尖，有突起的脚孢；开始形成的时候并无分隔，成熟后则通常有2个分隔，分隔处细缢，为无色或淡橄榄色，集结数量过多时则呈现出灰绿色。有性世代的成熟子囊壳具有黑色的球部，在球部的顶端产生长喙，单根或分枝，子囊则呈圆柱形或近棍棒形，多数子囊含有8个子囊孢子，少数为1-6个不等。子囊孢子呈钝棱形，两端略弯，通常有3个隔膜[8]。在适宜的温湿度条件下，稻瘟病菌的分生孢子接触到寄主表皮上的细胞后，1 西南大学硕士学位论文其尖端将释放出粘液并且形成芽管将孢子紧紧地粘连在寄主的表面[9,10]，随后芽管将分化出附着胞，附着胞产生出侵染栓能够穿透角质层和表皮细胞壁[11,12]。侵入后的稻瘟病菌将分化出次生菌丝在寄主细胞中生长，并且侵染邻近的表皮细胞，深入叶肉细胞中[13,14]，5-7d后便开始出现症状。分生孢子梗从病斑中释放出大量的分生孢子，重新侵染寄主，再以菌丝体和分生孢子的形式越冬以完成侵染循环。2稻瘟病的药剂防治概述稻瘟病的防治对于农业的发展以及稻谷质量的提高来说迫在眉睫。而目前世界上对于稻瘟病的防治措施主要以抗病品种的选育、田间栽培管理和化学防治为主，其中，化学防治因为其经济、高效等优点占据着不可替代的地位[15]。而稻瘟病的化学防治也在漫长的探索中经历了几个重要的时期。2.1重金属及有机汞类重金属类杀菌剂主要包含波尔多液等铜制剂，属于保护性、多作用位点的杀菌剂，主要干扰病原菌的膜结构和能量形成，但是对稻瘟病的防治效果较差，并且仅具有保护性不具有内吸性，很容易产生药害[16]。而有机汞类杀菌剂如醋酸苯汞等，虽然对稻瘟病有一定的防效并且药害小于铜制剂，但却因为毒性问题而被禁止使用。后来替代有机汞的如灭瘟素、复端孢菌素、春雷霉素等农用抗生素，作用机制主要是对菌体蛋白质的生物合成有影响[17],[18]。其中灭瘟素对于稻瘟病的防治有较好的效果，但是在分蘖期使用比较容易产生药害。而春雷霉素具有很强的内吸性和保护治疗的作用[19]，在活体条件下对于稻瘟病的防治有较好的效果，但是已经出现稻瘟病菌产生抗药性而导致防治失败的报道[20]。2.2有机氯类有机氯类杀菌剂主要包含四氯苯肽、稻瘟醇、稻瘟清等。但是由于这类农药的残留不易降解并且对后茬作物存在药害，对人畜具有威胁性的原因[21]，目前只有四氯苯酞因为毒性较小而商品化。四氯苯酞除了对黑色素的生物合成具有抑制作用外，还能够减少稻瘟病菌附着胞的形成从而达到阻止病菌侵入的目的[22]。2.3有机磷类有机磷类杀菌剂主要包含稻瘟净、异稻瘟净[23]等，而稻瘟灵虽然不属于该类群却具有相似的作用机制[24,25]，作用机制为抑制磷脂类生物的合成[26]。由于2 第一章文献综述杀菌剂的长期使用，从1976年起，世界多地都发现稻瘟病菌已经对异稻瘟净产生了抗性，并且对稻瘟净表现出了交互抗性[27,28]。在我国的部分地区也出现了稻瘟病菌对稻瘟灵不再敏感的报道[29]。2.4黑色素合成抑制剂黑色素抑制剂主要包含两大类，还原酶抑制剂和脱水酶抑制剂。这类化合物的防治谱较窄，一般只能用于稻瘟病的防治。还原酶抑制剂类化合物主要包含三环唑、咯喹酮、灭瘟唑等，其中三环唑是我国防治稻瘟病的主要药剂[30-32]。还原酶抑制剂类化合物主要作用于黑色素合成途径中由三羟基萘酚还原酶和四羟基萘酚还原酶催化的两步还原反应。目前，三环唑对于稻瘟病菌仍然属于极低抗性风险的药剂，我国也并未出现稻瘟病菌对三环唑产生田间抗药性的报道[33,34]，但是沈瑛等通过活体条件下的药剂连续驯化研究表明，稻瘟病菌对三环唑的敏感性会随着药剂筛选代数的增加而下降[35]。脱水酶抑制剂化合物主要包含环丙酰菌胺、dilocymet和氰菌胺3种[36,37]。脱水酶抑制剂化合物主要作用于由小柱孢酮脱水酶催化的两步脱水反应。2.5甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂主要包含嘧菌酯、苯氧菌酯和苯氧菌胺等。该类化合物是以天然产物strobilurinA为先导化合物所开发得到的新型杀菌剂[38]，具有杀菌谱广，杀菌活性高的特性，能够有效的防治由担子菌、半知菌和子囊菌等引起的真菌病害。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂主要作用于真菌的呼吸作用，通过与电子传递链中的复合物Ⅲ结合，从而阻断电子由Cytbc1复合物流向Cytc从而破坏能量合成以致杀死真菌[33]。但是目前已经有稻瘟病菌对该类杀菌剂产生抗性的报道，其抗药性机制主要涉及到电子传递链中旁路氧化酶的活性，通过旁路途径减少甚至消除QoIs对病菌电子传递的抑制作用[39,40]。3DMIs类杀菌剂概述戊唑醇为甾醇14-α脱甲基抑制剂（DMIs），DMIs类杀菌剂一般是指含有三氮唑的化合物，主要具有内吸功能和保护、治疗作用，它不仅对致病的真菌具有极高的生物毒性并且能够被植物根系所吸收，随着蒸腾流运输到植物体各部分，对植物体无害，由于其独特的作用机制和良好的药效，目前被广泛地应用于由子囊菌、担子菌等真菌引起的多种病害的防治[41]。3.1DMIs类杀菌剂主要品种3 西南大学硕士学位论文DMIs类杀菌剂根据结构进行分类主要有6种。吗啉类（morpholines）：如氟吗啉、烯酰吗啉、苯锈啶等；哌嗪类（piperazines）：如嗪胺灵等；咪唑类（imidazoles）：如咪鲜胺等；吡啶类（pyridines）：如吡氯灵、氯甲基吡啶等；嘧啶类（pyrimidines）：如甲菌定，嘧菌胺等和目前种类最多的一类麦角甾醇合成抑制剂，三唑类（triazoles）：如三唑酮、丙环唑、苯醚甲环唑、氟环唑、丙硫菌唑、戊唑醇等。3.2DMIs类杀菌剂作用机理DMIs类杀菌剂属于麦角甾醇合成抑制剂（SterolBiosynthesisInhibitors,SBIs）。麦角甾醇存在于大多数真菌中，是细胞膜的重要组份之一，具有重要的生物功能——调控细胞膜的流动性和渗透性，是细胞生存的关键因子[42-44]。一旦麦角甾醇缺乏，将会引起真菌细胞膜结构和功能的破坏，甚至发生细胞破裂，最终导致细胞死亡[45]。甾醇14-α去甲基化酶是甾醇生物合成途径中的关键酶，麦角甾醇的缺乏将伴随着甲基化的甾醇前体的积累，将会影响膜的完整性和膜结合蛋白的功能，从而导致真菌的生长受到抑制[43,46,47]。去甲基化酶抑制剂能够通过抑制cyp51基因，从而干扰或阻断麦角甾醇生物合成，破坏真菌细胞膜结构而达到抑菌、杀菌目的[48,49]。3.3植物病原菌对DMIs杀菌剂的抗性研究进展在20世纪70年代，DMIs类杀菌剂刚刚进行商品化生产的时候，人们普遍认为植物病原真菌不可能对DMIs杀菌剂产生田间抗性[50,51]。但是由于该类杀菌剂具有特殊的专一作用位点，以及广泛地使用，田间已有许多重要的植物病原真菌都对该类杀菌剂产生了不同程度的抗药性[52,53]。1980年和1981年，分别在英国和德国出现了大麦白粉病菌对DMIs类杀菌剂的田间抗性菌株[54]。到80年代末，在法国和葡萄牙的葡萄园中均出现了葡萄白粉病菌的田间抗药性菌株[55]。近些年的研究表明，柑橘绿霉病菌对抑霉唑[56]、大麦云纹病菌对三唑醇[57]、小麦白粉病菌对三唑酮和三唑醇[58,59]、番茄叶霉病菌对氟硅唑[60]、苹果黑星病菌对几种三唑类杀菌剂[61]等部分重要的植物病原真菌都产生了田间抗药性。同时，在田间应用中发现，DMIs杀菌剂对梨疮痂病菌[62]等病原菌的防治效果也明显下降。3.4植物病原菌对DMIs类杀菌剂的抗性机理研究3.4.1植物病原菌对DMIs类杀菌剂的抗药性遗传机制研究表明，病原真菌对DMIs类杀菌剂的抗药性遗传机制较为复杂，难以用一种模式来进行解释[63]。一般认为病原真菌对DMIs类杀菌剂的抗药性遗传机制是由微效基因所控制，在田间表现出连续的数量性状。但通过对田间分离到的抗4 第一章文献综述性菌株研究发现，病原真菌对DMIs类杀菌剂的抗药性遗传机制并非这样简单。例如在对大麦网斑病菌的研究中发现，其对三唑醇表现为主效基因遗传，但是对于丙环唑却表现为多基因遗传[64]。在对实验室所获得的抗药性突变体的研究中发现，番茄叶霉病菌和苹果黑星病菌对氟硅唑[60,65]、玉蜀黑粉菌对粉锈宁[66]、红粒丛赤壳菌对戊唑醇[67]的抗药性遗传都是受多基因控制的，其抗性水平相对较低，且抗性具有累加效应；但是红粒丛赤壳菌南瓜变种对三唑醇[68]的抗性却是受单基因控制的，其抗性水平相对较高。3.4.2植物病原真菌对DMIs杀菌剂抗药性的生理生化机制(1)增加对药剂的排泄紫外灯诱导的粗糙脉孢菌抗性突变体的抗药机制研究表明，抗性突变体增加了对三唑醇的排泄作用，能够降低药剂在细胞体内的积累量，从而使其麦角甾醇的生物合成过程阻力减小，合成量较敏感菌株高[59]。另外，巢曲霉和意大利青霉对DMIs的抗性突变体均表现出药剂在菌体细胞内的积累量减少的现象，因此到达作用靶点的杀菌剂药量不足而表现出杀菌活性下降[69]。(2)解毒代谢作用病原真菌在体内可以通过一系列的代谢过程将有毒的杀菌剂转化成无毒物质，从而使得杀菌剂失去作用，则病原真菌表现出对药剂的抗性。例如，立枯丝核菌能够将抑霉唑代谢成为没有毒性的化合物，从而产生抗性[63]。瓜枝孢菌对DMIs杀菌剂的抗性也与该作用有关[70]。意大利青霉菌对抑霉唑的抗性研究表明，抗性菌株对抑霉唑的解毒代谢能力较敏感菌株快，因此而产生抗性[71]。另外，部分抗性病原菌代谢杀菌剂成为更高活性化合物的能力的丧失也会表现出抗性，例如三唑酮在菌株内代谢成为更高效的三唑醇才能发挥更好的杀菌作用，而抗性菌株则阻止了该代谢作用[72]。3.4.3植物病原真菌对DMIs杀菌剂抗药性的分子机制(1)与ABC运输体或MFS运输体有关的抗性分子机制现有的研究表明，ATP-bindingcassette(ABC)transporters与生物中的多药抗药性有关，能够依靠能量将有毒的物质排出细胞外，减少其在细胞内的浓度[73-75]。在进行灰葡萄孢菌对DMI杀菌剂的抗性机制研究时发现，其敏感性与MFS基因Bcmfs1的表达水平相关[76]；另有研究表明ABC转运蛋白基因BcatrA与多种药剂的抗性机制有关[77]；而ABC转录蛋白AtrB与灰葡萄孢菌的多药抗性相关[78]；戊唑醇可以诱导一些ABC和MFS基因的表达[79]。在进行构巢曲霉对DMIs类杀菌剂的抗性机制研究发现，ABC运输体的AtrBp基因缺失则对药剂敏感性增强，过量表达则对药剂敏感性降低[80]；另有研究表明将ABC运输体的artB基因转录至酵母中，能够对三唑类杀菌剂产生抗性[81]。5 西南大学硕士学位论文对DMIs类杀菌剂的抗性与ABC运输体的相关性报道也有很多。在桃疮痂病原菌的研究中发现，其对DMIs类杀菌剂产生抗性的分子机制可能包含ABC运输体能够增加对有毒物质的排出[62]。在对指状青霉的研究中发现，ABC转运蛋白的PMR1基因的缺失突变体对DMIs类杀菌剂表现出抗性，同时DMIs类杀菌剂可以诱导PMR1的产生[82]。在禾生球腔菌对DMIs类杀菌剂产生抗性的机制研究中发现，ABC转运蛋白的编码基因MgAtr1是其产生抗药性的原因之一[83]。在进行草坪草币斑病菌对DMIs类杀菌剂的抗性分子机理研究时发现，其对丙环唑的抗性与ABC转运蛋白ShatrD的过量表达显著相关[84]。但是也有研究表明，抗性菌株对DMIs类杀菌剂的抗性机制可能与P-糖蛋白的表达量有关。在对田间获得的抗DMIs的柑橘青霉病菌进行研究表明，在施药后，抗性菌株的编码ABC运输体的PMR1基因的组成型表达水平比敏感菌株明显增加，但是在将其与组成型启动子一起转入到敏感菌株内后，敏感菌株的抗性却并未有明显的增加，因此，PMR1基因的组成型表达水平并不是植物病原真菌对DMIs杀菌剂产生抗性的决定因素，而最基本的抗性机制可能是P-糖蛋白的过度表达[85]。(2)与cyp51基因有关的抗性机制cyp51基因属于细胞色素P450家族，广泛存在于各种生物体中。cyp51基因主要编码甾醇合成途径中的关键酶—14α-脱甲基酶。而DMIs杀菌剂的作用机制是抑制14α-脱甲基酶的活性，因此，植物病原菌对DMIs杀菌剂的抗性很可能与cyp51基因的变化有关。现有的研究表明，与cyp51基因有关的植物病原真菌对DMIs杀菌剂的抗性机制主要与cyp51基因点突变或cyp51基因的过度表达有关。（1）cyp51基因点突变cyp51基因的位点的突变可以通过改变氨基酸从而降低靶标酶与药剂亲和性使病原菌表现出抗药性[63]。目前的研究表明，大麦白粉病菌、指状青霉病菌、葡萄白粉病菌等植物病原真菌对DMIs的抗性都与cyp51的基因突变有关。在指状青霉对抑霉唑的抗性分子机制研究中，对一个敏感菌株和两个抗性菌株的cyp51基因序列进行比对，抗性菌株cyp51基因在编码区发生了4个核苷酸的取代，从而引起了氨基酸的变化，209位由甘氨酸（Gly）变为丙氨酸（Ala），308位从酪氨酸（Tyr）变为组氨酸（His），437位的组氨酸（His）变为酪氨酸（Tyr）。同时，指状青霉对抑霉唑的抗性并不完全由cyp51基因的点突变引起，还与cyp51基因的过度表达有关[86]。在禾生球腔菌对丙硫菌唑和氟环唑的抗药性分子机制研究中发现，抗性菌株通常带有S524T的点突变，而在进行定点突变之后的结果证明了单独的S524T突变或者与Y461S联合突变都能造成菌株的抗药性[87]。6 第一章文献综述在大麦白粉病菌对DMIs类杀菌剂的抗性机制研究中发现，抗性菌株含有K147Q的突变，而通过对敏感菌株和抗性菌株的杂交后代的序列分析表明，点突变Y136F和K147Q随菌株的抗性而产生分离，因此点突变Y136F和K147Q是抗药性的原因[88]。禾生球腔菌的cyp51基因的点突变与DMIs类杀菌剂的抗性相关，有Y137H点突变的菌株对三唑醇不再敏感，有I381V点突变的菌株对戊唑醇敏感性降低，有V136A点突变的菌株对咪鲜安的抗性增加，而Y459和G460的缺失可使菌株对戊唑醇和氟环唑产生抗性，有A379G、I381V点突变和Y459/G460缺失的菌株对咪鲜安则表现为更加敏感[89]。同时，另有禾生球腔菌对DMIs类杀菌剂的抗性机制研究表明，抗药性与密码子459、460、461有关，I381V点突变与这些突变的组合会导致病原菌对DMI高水平的抗药性[90]。在进行葡萄白粉病菌对三唑醇的抗性菌株的抗性机制研究表明，抗性倍数大于5的菌株都含有点突变Y136F，而其他所有的敏感菌株和抗性倍数小于5的菌株则没有该突变，因此可以说明Y136F与抗药性明显相关[91]。（2）cyp51基因过度表达cyp51基因的过度表达可以导致菌体内形成过量的脱甲基酶，可以结合DMI类杀菌剂，同时还可以进行正常的催化反应，真菌细胞膜可以保持良好的流动性和稳定性，从而导致抗药性的产生。在进行甜菜生尾孢对DMIs类杀菌剂的抗性机制研究表明，其与cyp51基因的过量表达存在显著的相关性[92]。在进行苹果黑星病菌对DMIs杀菌剂产生抗性的研究中发现主要机制为cyp51基因的过度表达[93]。在进行樱桃叶斑病对DMIs类杀菌剂的抗性机制研究中发现，抗性菌株的cyp51表达量比敏感菌株高5-12倍，并且通过序列分析发现59个抗药菌株在cyp51上游序列有不同大小的片段插入，而22个敏感菌株均不含有插入片段[94]。对从田间分离得到的腈菌唑敏感菌株和抗性菌株的cyp51基因进行了克隆和测序，结果表明cyp51基因的序列并没有差异。但是在进行cyp51基因的表达水平的测定时发现抗性菌株要明显高于敏感菌株，且在抗性菌株的cyp51基因序列的5′端含有三个启动子的区域内插入了一段553bp大小的片断，插入的片断能够引起cyp51的过度表达，从而导致了抗性的发生。在研究指状青霉对DMIs的抗性机制时发现，所有抗性菌株内都含有126bp的5个重复序列，而所有的敏感菌株内则只有一个重复，因此认为，这个126bp的序列能够使cyp51的表达水平显著提高，从而导致抗药性的发生[95]。李红叶等的研究也发现，指状青霉对抑霉唑的抗性与cyp51基因序列上游的4个序列一致的126bp大小的重复序列的插入有关[86]。在对指状青霉的抑霉唑抗性菌株的研究发现，其cyp51B的表达量比敏感菌株高7.5-13.6倍，而在序列对比发现其的启动子区域存在199bp的插入片段[96]。桃褐腐病菌对DMIs类杀菌剂具有抗性的菌株的cyp51的表达量显著高7 西南大学硕士学位论文于敏感菌株，且在其上游启动子区域有65bp的片段插入从而导致了表达量的上升[97]。禾生球腔菌对DMIs类杀菌剂的抗性机制的研究发现，cyp51基因调控区的120bp的插入所导致的过量表达，是其抗性产生的主要原因[87]。4本论文研究的目的及意义水稻是世界上最重要的粮食作物之一，而稻瘟病是导致水稻产量下降，品质降低的主要原因之一。近年来，我国的东北稻区，长江中游稻区以及西南稻区的稻瘟病持续发生，对于水稻的生产带来了困难[98]。但是由于稻瘟病菌生理小种的多样性和易变性导致抗病品种在推广2-3年后就逐渐丧失抗性，因此，化学防治在稻瘟病的防治中仍起着重要作用。西南地区的主要防治药剂为稻瘟灵和三环唑，因此对稻瘟病菌的研究也多集中在这两种药剂上。戊唑醇是一种广谱、高效的内吸性杀菌剂，可用于多种真菌的防治中，而戊唑醇在稻瘟病的防治上主要以复配剂的形式为主，并取得了良好的效果，比如石凤梅的研究结果表明，25％戊唑醇ＷＧ对水稻稻瘟病叶瘟和穗颈瘟的防治效果良好，并有一定的增产效果[101]；黎永健研究表明，75%肟菌·戊唑醇WG对水稻叶瘟、穗颈瘟均有良好的防治效果，增产效果明显且无药害现象发生[103]。但是目前没有西南地区稻瘟病菌对其敏感基线和抗性监测的报道。因此，本研究主要针对四川省、重庆市和贵州省等主要水稻种植区的稻瘟病菌进行了戊唑醇的敏感性测定，以期完成西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的抗药性风险分析的基础研究，从而为戊唑醇在西南地区的使用和用药策略的制定提供理论依据。通过室内抗性菌株的驯化进行相关的生物学特性研究以及抗性分子机制的研究，全面了解稻瘟病菌对于戊唑醇抗性发展的规律，交互抗性的产生和相关的分子机制等等，全面分析稻瘟病菌对戊唑醇产生抗性的原因，为戊唑醇的抗性风险分析提供基础，同时为后期稻瘟病的防治药剂的使用提供相应的方法以及为抗性产生的分子机制的深入研究提供基础。8 第二章西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线建立第二章西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线建立稻瘟病是水稻的三大病害之首，在我国的水稻栽培区均有发生，我国对于稻瘟病的防治主要以化学防治为主。但是由于化学药剂的常年的单一使用，田间已经出现了稻瘟病菌的抗药性增强以及药剂的防效降低的现象，稻瘟净、稻瘟灵、异稻瘟净等药剂都已经在田间发现了抗性菌株[99,100]，同时研究发现稻瘟病菌菌株经过连续的药剂驯化后对三环唑的敏感性也会降低[35]。因此，对于防治稻瘟病的新型药剂的研究开发很重要。戊唑醇(tebuconazole)是拜耳公司研发的一种DMIs类杀菌剂，对多数的作物真菌病害都能够有良好的防治效果。其在稻瘟病上的应用多以复配剂为主，肟菌·戊唑醇、稻瘟酰胺·戊唑醇、嘧菌酯·戊唑醇、氯啶菌酯·戊唑醇等均对稻瘟病有良好的防治效果[101-103]。为了进行戊唑醇在西南地区的推广使用，需要先进行药剂对病原菌抗药性风险分析，而建立病原菌对杀菌剂的敏感性基线是研究田间菌株敏感性变化的重要步骤，也是风险分析建立的基础[104]。1供试材料1.1菌株2013-2015年在四川省、重庆市和贵州省的16个区县里进行稻瘟病的调查采样（图2-1）。本研究主要采集的为水稻稻瘟病的穗颈瘟样品，采集后将样品风干并用吸水纸包裹保存于4℃冰箱内用于下步实验。1.2药剂戊唑醇（tebuconazole，97%）原药由湖北康宝泰精细化工有限公司提供，用丙酮配制为1×104μg/mL的母液，4℃冰箱保存，备用。1.3培养基马铃薯琼脂培养基（PDA）：马铃薯（去皮）200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g和蒸馏水。马铃薯去皮后切成块状，加入蒸馏水煮约30min至沸腾，用双层纱布进行过滤，然后在滤液中加入葡萄糖和琼脂粉，搅拌均匀并补足蒸馏水至1000mL，再次煮沸，124℃下湿热灭菌40min备用。燕麦琼脂培养基（OA）：燕麦片50g、琼脂粉20g和蒸馏水。燕麦片，加入蒸馏水在65℃水浴锅中水浴2h，用双层纱布过滤，然后在滤液中加入琼脂粉，搅拌均匀并补足蒸馏水至1000mL，稍煮沸，124℃下湿热灭菌40min备用。9 西南大学硕士学位论文1.4含药平板的制作将戊唑醇母液用丙酮稀释成所需要的系列浓度，分别加100μl至200mL已灭菌的培养基中（培养基温度不宜过高，约45-55℃），摇晃均匀后，倒入已经经过高温灭菌的培养皿中，每皿约20mL，制成系列浓度的含药平板。2试验方法2.1稻瘟病菌的分离、纯化与保存将实验室采集并保存的穗颈瘟样品用灭菌水浸泡约12h后，放于垫有两根“L”型玻璃棒的培养皿中，置于28℃下保湿培养48h。然后用灭菌的玻璃棒敲击穗颈上所产生的灰绿色霉层，将孢子敲击到PDA培养基上，置于28℃下黑暗培养48h，然后根据形态学进行基本判定，挑取白色的单菌落转接到PDA平板上，每个穗颈瘟样品各挑取一个单菌落，置于28℃下黑暗培养10天，通过观察菌落的生长速率和菌落形态等对其进行初步鉴定。最后通过在OA培养基上进行产孢培养，通过孢子形态鉴定确认菌株，对于最终确认为稻瘟病菌的菌株用PDA斜面培养保存。2.2稻瘟病菌的孢子培养将活化后的稻瘟病菌接种到OA培养基平板上（平板略厚约占培养皿体积的五分之四），倒置于28℃下黑暗培养10d左右，待其菌丝长满培养基表面后，用接种针刮除表面的气生菌丝，用灭菌纱布代替皿盖盖住培养皿，并将培养皿放置于含有灭菌水的稍大的培养皿内，用于纱布的保湿，每隔12h加一次灭菌水，然后置于28℃下使用12h（黑光灯+荧光灯）/12h黑暗的灯光设置培养4-5d，直至培养基表面长出灰色的孢子层。2.3稻瘟病菌对戊唑醇敏感性基线的建立从实验室分离保存的稻瘟病菌菌株中随机选取150个野生菌株，采用菌丝生长速率法[105]测定稻瘟病菌对戊唑醇的EC50值。将供试菌株在PDA培养基上进行活化，28℃黑暗培养8d后，在菌落边缘用直径为7mm的打孔器制取菌丝块，分别接种到含0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0及2.0μg/mL戊唑醇的PDA平板上（菌饼反面朝上），以加入等体积丙酮的不含药平板作为对照，每处理重复3次。倒置于培养箱中28℃黑暗培养，10d后用十字交叉法测量各处理的菌落直径，并计算菌丝的生长抑制率。通过Excel对各处理药剂浓度的对数（X）和菌丝生长抑制率的几率值（Y）10 第二章西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线建立进行线性回归分析，求出线性回归方程Y=aX+b，计算出戊唑醇对各供试菌株的抑制中浓度（EC50值）。根据150株野生稻瘟病菌株对戊唑醇的敏感性频率分布，建立西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线[106]。菌丝生长抑制率（%）=[1-（药剂处理菌落直径-7mm）/（对照处理菌落直径-7mm）]×100%2.4部分地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性差异性分析在稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线的建立过程中，对部分地区的稻瘟病菌对戊唑醇的平均EC50值进行统计，并使用SPSS软件进行差异显著性分析，比较不同地区的菌株对戊唑醇的敏感性是否存在差异性。3结果与分析3.1水稻稻瘟病调查、采样及病原菌分离结果2013-2015年，本实验室在四川省、重庆市和贵州省的16个区县（图2-1）共采集分离到1014个稻瘟病菌菌株（表2-1），其中2013年从8个区县分离得到300株，2014年从10个区县分离得到602株，2015年从1个区县分离得到112株。图2-12013-2015年西南地区水稻稻瘟病采样地区分布图Figure.2-1DistributionofsamplingareasforriceblastinSouthwestChinain2013-201511 西南大学硕士学位论文表2-12013-2015年水稻稻瘟病调查、采样及病原菌分离Table2-1.Investigation,sampleandpathogenseparationofriceblastin2013-2015采集时间采集地点编号菌株数TimeLocationCodeNumberofisolates重庆永川PYC89ChongqingYongchuan重庆酉阳PYY8ChongqingYouyang重庆璧山PBS69ChongqingBishan四川岳池PSYC59SichuanYuechi2013年四川雅安PYA23SichuanYa‘an四川绵阳PMY30SichuanMianyang四川武胜PWS3SichuanWusheng四川阆中PLZ19SichuanLangzhong重庆永川PYC42ChongqingYongchuan重庆武隆PWL36ChongqingWulong重庆涪陵PFL92ChongqingFulin重庆忠县2014年PZX55ChongqingZhongxian重庆石柱PSZ76ChongqingShizhu四川都江堰PDJY14SichuanDujiangyan四川岳池PSYC55SichuanYuechi12 第二章西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线建立采集时间采集地点编号菌株数TimeLocationCodeNumberofisolates四川宣汉PXH96SichuanXuanhan贵州盘县PPX14GuizhouPanxian贵州六枝特区PGLZ122GuizhouLiuzhiTequ四川宣汉2015年PXH112SichuanXuanhan总数16个区县----------------1014TotalSisteencounties3.2稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线根据对于随机选取的150株稻瘟病菌的敏感性的测定结果显示，供试的150株稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性呈现连续性分布（图2-2A）。EC50值的变化范围在0.0475~0.5996μg/mL之间，其中最不敏感菌株的EC50值是最敏感菌株的12.62倍（见附录1）。将EC50值划分为几个区间，统计每个区间的菌株数及发生频率，绘制菌株敏感性频率分布图（图2-2B）。由图2-2可见，供试稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性频率分布呈连续性单峰曲线，未出现敏感性明显下降的抗药性亚群体，因此可将此150株敏感菌株的平均EC50值作为田间菌株抗性监测的参考标准。其EC50平均值为(0.2154±0.1497)µg/mL。本研究以供试菌株的EC50平均值0.2154µg/mL作为西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线，以进行后续的田间抗性监测。13 西南大学硕士学位论文图2-2.稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性（A）及频率分布（B）Figure2-2.Sensitivity(A)anddistribution(B)ofEC50valueof150Magnaporthegriseaisolatestotebuconazole14 第二章西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线建立3.3不同地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性差异性用Excel统计了西南地区10个区县的野生型稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性结果，用SPSS软件进行计算分析得到，不同地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性存在显著性差异（表2-2）。其中，四川绵阳菌株最敏感，其平均EC50值为(0.0872±0.0461)μg/mL；贵州六枝特区和四川宣汉的菌株最不敏感，平均EC50值分别为(0.4570±0.0855)μg/mL和(0.4436±0.1289)μg/mL；四川绵阳菌株与四川宣汉菌株的敏感性相差5.09倍。表2-2.不同地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性差异Table2-2.Sensitivity(EC50value)ofMagnaporthegriseafromdifferentareastotebuconazole采集地菌株数EC50值范围EC50平均值LocationIsolatesRangeofEC50values/(μg/mL)AverageofEC50values/(μg/mL)四川宣汉100.2360~0.59950.4436±0.1289aSichuanXuanhan贵州六枝特区80.3244~0.58180.4570±0.0855aGuizhouLiuzhiTequ重庆涪陵130.1344~0.55570.3697±0.1419bChongqingFulin四川雅安120.0782~0.34880.1874±0.0849cSichuanYa‘an重庆永川200.0558~0.43470.1546±0.0869cdChongqingYongchuan重庆璧山170.0643~0.37430.1465±0.0726cdChongqingBishan四川阆中130.0726~0.31870.1432±0.0733cdSichuanLangzhong重庆酉阳80.0710~0.24730.1409±0.0619cdChongqingYouyang四川岳池180.0475~0.27490.1145±0.0614cdSichuanYuechi四川绵阳120.0478~0.20430.0872±0.0461dSichuanMianyang注:表中同列数据后不同字母表示采用Duncan氏新复极差法检验数值间差异显著(P＞0.05)。Note：DatainthesamecolumnfollowedbythedifferentlettersaresignificantlydifferentbyDuncan’snewmultiplerangetest(P＞0.05).15 西南大学硕士学位论文4讨论DMIs类农药属于较易产生抗性的中等风险杀菌剂，而稻瘟病菌则属于容易产生抗药性的高风险病原菌。现在在稻瘟病的防治中使用较多的DMIs类杀菌剂主要有咪鲜胺，丙环唑，三唑酮，苯醚甲环唑，氟环唑等。而本研究中主要采用菌丝生长速率法，对采自于西南地区未使用戊唑醇区域的150株野生稻瘟病菌菌株对戊唑醇的EC50值进行了测定，初步建立起了稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线。西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的EC[107]50平均值为0.2154µg/mL，该值与Yan等测定的稻瘟病菌野生敏感菌株对戊唑醇的EC50值相近，因此可将其作为田间稻瘟病菌对戊唑醇抗性监测的参考标准。该值与戊唑醇对草莓枯萎病菌的敏感性值相近[108]，较戊唑醇对辽宁省黄瓜靶斑病菌的敏感基线值低[109]，戊唑醇对于病原菌的防治效果较为稳定。将该研究结果与其他地区稻瘟病菌对其他DMIs类杀菌剂的敏感性基线进行比较。祁之秋等研究表明2011年辽宁省稻瘟病菌对咪鲜胺的敏感基线为0.0710μg/mL±0.0410μg/mL[110]。李波涛等从中国黑龙江、福建、江苏等9个省份所随机选取的菌株进行苯醚甲环唑、氟环唑和咪鲜胺的敏感性测定，敏感性基线分别为1.755±0.463μg/mL、0.301±0.101μg/mL和0.103±0.024μg/mL[111]。方敏彦测定了采自广西、桂州、浙江、安徽、福建、江苏、广东省不同地区的稻瘟病菌菌株对三唑类杀菌剂丙环唑的敏感性，其EC[112]50平均值为0.901μg/mL。因此，西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线值较苯醚甲环唑、氟环唑、丙环唑低，较咪鲜胺略高，在对于稻瘟病的防治能有一定的作用。在敏感性基线建立过程中，对于西南地区不同区县的稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性进行了差异显著性分析，其中最敏感菌株与最不敏感菌株EC50值差异达12.62倍，分别出现在四川岳池与重庆涪陵，且各区县之间的平均EC50值存在显著性差异，说明不同地区的稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性并不一致，推测这可能与当地的用药策略或者各地病原菌本身的差异性有关。16 第三章西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的抗性监测第三章西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的抗性监测戊唑醇(tebuconazole)属于DMIs类杀菌剂，具有高效、广谱、内吸性强的特性，因此在多种作物的真菌病害防治中均有所应用。但是由于DMIs类杀菌剂的作用位点较单一，因此田间已有多种重要的植物病原真菌对该类杀菌剂产生了不同程度的抗药性[67,113,114]。西南地区是我国稻瘟病的常发区，但不同地域不同年份的发病程度不一，常用的防治药剂主要有三环唑、稻瘟灵等，戊唑醇在该地区尚未大面积使用。本研究主要针对西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的抗药性进行监测，以期为戊唑醇在西南地区的合理使用及应用前景提供一定的数据参考。1试验材料1.1菌株来自本研究第二章所分离保存的1014个菌株。1.2药剂戊唑醇，同第二章1.2。1.3培养基马铃薯琼脂培养基（PDA），同第二章1.2。1.4含药平板制作同第二章1.4。2试验方法2.1稻瘟病菌对戊唑醇的最低抑制浓度测定在1014个菌株中随机选取30个野生菌株，用直径7mm的打孔器制取菌饼，并分别接种至含2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0μg/mL戊唑醇的PDA平板上（菌丝朝下），以加入了等体积丙酮所配制的培养基作为对照，每处理重复3次。10d后测量观察，以菌株不能生长的最低的戊唑醇浓度作为戊唑醇对稻瘟病菌野生菌株的最低抑制浓度（MIC值），即后续试验中西南地区稻瘟病菌对戊唑醇抗性监测时的区分剂量。2.2西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的田间抗性监测将全部菌株在无药的PDA平板上活化培养8d后，用直径7mm的打孔器制17 西南大学硕士学位论文取菌饼，接种至戊唑醇浓度为4μg/mL的含药平板上，以加入等体积丙酮的平板作为对照。倒置于培养箱中，28℃黑暗培养，每处理重复3次。10d后观察菌株生长情况，将能在含药平板上生长的菌株视为疑似抗性菌株。计算各地区抗性菌株的发生频率。将疑似抗性菌株在无药平板上重新活化，使用菌丝生长速率法测定其EC50值，计算其与敏感基线的比值，得到其抗性倍数(resistancefactor)。根据抗性倍数将供试菌株划分为敏感、低抗、中抗和高抗菌株[115]。其中，抗性倍数≤3为敏感菌株；3<抗性倍数≤10为低抗菌株；10<抗性倍数≤100为中抗菌株；抗性倍数>100为高抗菌株。3结果与分析3.1稻瘟病菌对戊唑醇田间抗性监测的区分剂量30株田间野生型稻瘟病菌株对戊唑醇的MIC值的测定结果表明，所测菌株对戊唑醇的MIC值分布在1.5~4.0μg/mL之间，最大的MIC值为4.0μg/mL。因此，本研究以4.0μg/mL作为稻瘟病菌对戊唑醇的敏感菌株和抗性菌株的区分剂量，即能在含4.0μg/mL戊唑醇的PDA培养基上生长的菌株为田间抗性菌株，而不能再此浓度上生长的菌株为敏感菌株。3.2西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的田间抗性分布以MIC值作为田间稻瘟病菌对戊唑醇抗性的区分剂量，对分离于重庆市（永川、酉阳、璧山、武隆、涪陵、忠县、石柱）、四川省（都江堰、宣汉、阆中、绵阳、岳池、雅安、武胜）和贵州省（盘县、六枝特区）16个区县的稻瘟病菌菌株进行监测。结果表明，所采集的病原菌仅四川宣汉和重庆涪陵各有1株能在含4μg/mL戊唑醇的PDA平板上生长，视为疑似抗性菌株。由此可得，四川省、重庆市和贵州省的采样所得稻瘟病菌对戊唑醇的抗性频率分别为0.33%、0.21%和0（表3-1）。测定两株疑似抗性菌株对戊唑醇的敏感性，得到其EC50值分别为0.6512μg/mL和0.6557μg/mL，抗性倍数分别为3.02和3.04（表3-2）。由此可见西南地区稻瘟病菌对戊唑醇多数仍为敏感菌株，仅极少数出现了低水平抗性。18 第三章西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的抗性监测表3-1.西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的田间抗性频率Table3-1．TheresistancefrequencyofMagnaporthegriseatotebuconazole采集地点菌株数抗性菌株数抗性频率(%)CollectinglocationIsolatesResistanceisolatesquantitiesResistancefrequency(%)四川省29910.33SichuanProvince重庆市46710.21Chungking贵州省13600GuizhouProvince表3-2.稻瘟病田间监测抗性菌株对戊唑醇的敏感性Table3-2．SensitivityofMagnaporthegrisearesistance-isolatestotebuconazole菌株毒力回归方程相关系数EC50抗性倍数IsolatesRegressionequationRelativecoefficientμg/mLResistanceindexPXH8y=1.3698x+5.25520.95860.65123.02PFL19y=1.4184x+5.26000.98650.65573.044讨论对2013-2015年在西南地区所采集分离保存的1014株稻瘟病菌进行了其对戊唑醇的抗性监测，结果表明，西南地区稻瘟病菌对于戊唑醇主要表现为敏感，仅仅极少数表现出低抗。那么戊唑醇可以作为稻瘟病的防治药剂在西南地区进行使用，但是在用药过程中需要制定科学的施药策略，与作用机制不同的杀菌剂进行混合使用，以延缓田间抗性的产生，延长戊唑醇在稻瘟病防治中的使用寿命。部分地区低抗菌株的出现可能与菌株的个体差异性或者是其他药剂的微弱交互抗性等有关，但这并不意味着戊唑醇不能用于该地区稻瘟病的防治。植物病原菌对杀菌剂能否产生抗性以及产生的速度等与多种要素有关，比如病原菌的遗传特性、用药措施与对策和发病环境条件等等[116]，抗性菌株并不一定能发展成为优势种群。而对于没有抗性菌株产生的地区也并不意味着药剂的随意使用，由于戊唑醇的单一位点的作用特性，容易使病原菌产生抗性，因此在使用过程中要制定科学的抗性管理策略。在使用戊唑醇防止稻瘟病的过程中，需要进行实时监测，更新抗性菌株的信息，注意与不同作用机制的药剂进行混合使用，以延缓抗性的产生。19 西南大学硕士学位论文在本研究中，仅仅涉及到3年的稻瘟病菌的抗性监测，并且地区的覆盖不完全，如果是由主效基因所引起的抗药性，需要在持续多年的多种药剂使用的田间试验的结果来进行抗药性的分析，而如果是由多效基因所控制的抗性则能有抗性监测进行早期的风险分析[117]。因此该研究中的实验数据还需要进行田间试验的测定以及多年的抗性监测的结果，为戊唑醇的田间抗性分析和风险管理提供更为准确全面的数据。20 第四章稻瘟病菌对戊唑醇抗性菌株的生物学特性研究第四章稻瘟病菌对戊唑醇抗性菌株的生物学特性研究目前，植物病原菌对杀菌剂的抗性已经植物病害防治过程中所面临的严峻问题。抗性菌株与敏感菌株的相对适合度，新杀菌剂与常用的杀菌剂之间所存在的交互抗性关系以及杀菌剂的作用机制等等都是抗药性形成和发展的重要因素[118]。而相对适合度主要包括在无药剂选择条件下抗药菌株相对野生菌株的菌丝线性生长，产孢量，以及在极端温度和pH值条件下的适合度差异，致病性等等方面[104]。本研究通过对室内驯化的抗性菌株的生物学特性进行研究，以期为抗性风险分析提供一定的理论基础。1试验材料1.1菌株选取在敏感基线建立过程中，所测得的EC50值较小的敏感型菌株15个，进行室内抗性菌株的驯化。本研究中用于抗戊唑醇稻瘟病菌驯化的菌株有：PMY30、PLZ8、PBS69、PBS57、PYA19、PSYC47、PYC52、PYC28、PLZ4、PYY1、PWS2、PYA16、PYC84、PZX17、PWL8。1.2药剂戊唑醇(tebuconazole，97%)、稻瘟灵(Isoprothiolane，97.9%)、吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin，98.03%)、三环唑(Tricyclazole，95.8%)、稻瘟酰胺(Fenoxanil，95%)、烯唑醇(Diniconazole，95%)，以上原药均由湖北康宝泰精细化工有限公司提供，用丙酮溶解配置为1.0×105μg/mL母液，置于4℃冰箱保存备用。1.3培养基马铃薯琼脂培养基（PDA），燕麦琼脂培养基（OA），同第二章1.3。1.4水稻水稻品种：西大1B，由西南大学农学及生命科学学院水稻研究所提供。2试验方法2.1抗戊唑醇稻瘟病菌的药剂驯化将待驯化菌株在无药的PDA平板上进行活化，培养8d后在菌落边缘用打孔器制取直径为7mm的菌饼，接种在含0.5μg/mL戊唑醇的PDA培养基平板上，21 西南大学硕士学位论文28℃条件下黑暗培养。待菌落生长20天后，将能够继续生长的菌株作为第一代，从菌落边缘制取7mm的菌株接种至下一代含药的PDA平板上进行培养。循环培养，逐渐增加药剂驯化的浓度直到没有菌株能够再次在平板上生长。保存每一代的驯化菌株，置于4℃冰箱备用。2.2戊唑醇抗性菌株的遗传稳定性测定根据2.1中所驯化出的菌株，使用菌丝生长速率法测定其EC50值，与其亲本菌株的敏感性进行对比，计算出抗药性倍数，确定抗性菌株。将戊唑醇抗性菌株在无药PDA培养基上培养10d后转接到下一代，共连续培养8代，保存每代的菌株，并且每隔一代用菌丝生长速率法测定其对戊唑醇的EC50值，每处理设置3次重复，28℃下黑暗培养。将在无选择压力下培养8代后的戊唑醇抗性菌株的EC50值与其亲本菌株的EC50进行比较，计算出抗药性倍数，再根据抗性水平划分标准判断突变体的抗性水平程度，最后根据其是否具有抗性来判断突变体是否能够稳定遗传。抗性倍数计算公式为：抗性倍数=抗性菌株的EC50/敏感菌株的EC50。抗性水平标准划分：小于5倍为敏感；5-15倍为低抗；15-50倍为中抗；大于50倍为高抗。2.3戊唑醇抗性菌株适合度测定2.3.1戊唑醇抗性菌株离体适合度测定（1）菌丝生长速率测定：将戊唑醇的抗性菌株及亲本菌株在无药的PDA平板上进行活化，28℃黑暗培养10d后，在菌落边缘制取直径7mm的菌饼，分别接种到无药的PDA平板上，每处理重复3次。每隔24h使用十字交叉法测定菌落直径，培养10d，用Excel软件对测量的数据进行分析，比较抗性菌株与亲本菌株的生长速率是否存在差异性。（2）产孢量测定：将戊唑醇的抗性菌株及对应的亲本菌株在无药的PDA平板上进行活化，28℃黑暗培养10d后，在菌落边缘制取直径7mm的菌饼，分别接种至OA平板上，进行产孢培养，每处理重复3次。约5天后，用等量的灭菌蒸馏水对培养皿中的孢子进行洗脱（用灭菌的毛笔轻刷培养基表面），并且定容到10mL，用血球计数板来计数稻瘟病菌的产孢量，并使用SPSS软件计算供试菌株的产孢量是否存在显著差异性。（3）戊唑醇抗性菌株的离体适合度指数计算：22 第四章稻瘟病菌对戊唑醇抗性菌株的生物学特性研究2.3.2戊唑醇抗性菌株致病性测定（1）致病性测定：用1%的吐温-60溶液将戊唑醇的抗性菌株及对应的亲本菌株的孢子配置为1×106个孢子/mL的孢子悬浮液，用于离体接种水稻叶片，同时以1%的吐温-60溶液作为对照。保湿培养7d后，十字交叉法测定病斑的直径，每处理重复3次。（2）接种方法：摘取处于相同的生长期并且长势一致的较嫩的水稻叶片，叶片背面朝上平铺在玻璃培养皿内，叶片的两端用灭菌的卫生纸保湿包裹，用灭菌的针尖对每个叶片的位置均等的3个部位进行微创伤，然后将4μL的孢子悬浮液用移液枪打在微创伤处，每个处理重复3次；盖上皿盖，置于28℃恒温培养箱中黑暗12h/光照12h进行保湿培养。7天后按十字交叉法测量病斑大小，对抗性菌株及其亲本菌株的致病性进行比较。2.4温度和pH值对抗性菌株和亲本菌株菌丝生长影响的测定2.4.1温度对抗性菌株生长影响的测定将戊唑醇的抗性菌株及对应的亲本菌株在无药的PDA平板上进行活化，28℃黑暗培养10d后，在菌落边缘制取直径7mm的菌饼，分别接至相同PH值的PDA培养基上(pH＝7.0)，置于不同温度梯度的培养箱中黑暗培养，温度梯度为8、12、16、20、24、28、32、36℃，10d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次。2.4.2pH值对抗性菌株生长影响的测定将戊唑醇的抗性菌株及对应的亲本菌株在无药的PDA平板上进行活化，28℃黑暗培养10d后，在菌落边缘制取直径7mm的菌饼，接至不同pH值的PDA平板上，pH值的梯度为4、5、6、7、8、9、10、11、12，倒置于28℃恒温培养箱中黑暗培养，10d后用十字交叉法测量菌落直径，每个处理重复3次。2.5戊唑醇抗性菌株的交互抗性测定采用菌丝生长速率法测定戊唑醇的抗性菌株及亲本菌株对三环唑、稻瘟灵、苯醚甲环唑、烯唑醇、稻瘟酰胺、吡唑醚菌酯的EC50值，再根据PMY30-1和PWS2-1及亲本菌株PMY30和PWS2的EC50的比值，判断戊唑醇与三环唑、稻瘟灵、苯醚甲环唑、烯唑醇、稻瘟酰胺、吡唑醚菌酯是否存在交互抗性。三环唑浓度梯度设置：12.5、25、50、100、200、400μg/mL；稻瘟灵浓度梯度设置：1.25、2.5、5、10、20、40μg/mL；苯醚甲环唑浓度梯度设置：0.025、0.5、1、2、4、8μg/mL；烯唑醇浓度梯度设置：0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1μg/mL；稻瘟酰胺浓度梯度设置：12.5、25、50、100、200、400μg/mL；23 西南大学硕士学位论文吡唑醚菌酯浓度梯度设置：0.0005、0.0015、0.0045、0.0135、0.0405、0.1215μg/mL3结果与分析3.1戊唑醇室内抗性菌株的获得经过药剂驯化后，获得了两株戊唑醇抗性菌株，亲本菌株分别为PWS2和PMY30，因此抗性菌株分别命名为PWS2-1与PMY30-1。其EC50值分别为2.5736μg/mL与1.7689μg/mL，为亲本菌株的25.46与31.25倍，均为中抗菌珠（表4-1），保存用于下一步实验。表4-1.稻瘟病菌戊唑醇室内抗性菌株对药剂的敏感性Table4-1.Theresultoffungicidetamingoftebuconazole-resistantstrainofMagnaporthegriseainlaboratory.菌株编号毒力回归方程相关系数EC50值抗性倍数抗性划分isolateRegressionequationRelativecoefficientEC50valueresistancefactorPWS2y=1.6321x+6.62430.95850.1011PWS2-1y=1.2703x+4.47850.95602.573625.46中抗PMY30y=1.3897x+6.73290.9630.0566PMY30-1y=1.6818x+4.58340.97321.768931.26中抗3.2戊唑醇抗性菌株的遗传稳定性在经过8代无选择压力的培养下，PWS2-1与PMY30-1仍然表现为中抗菌株（表4-2），说明抗药性能够稳定遗传，因此可以用于下一步试验。3.3戊唑醇抗性菌株的适合度3.3.1离体适合度（1）戊唑醇抗性菌株菌丝生长速率通过对PWS2、PMY30和PWS2-1、PMY30-1在PDA培养基上的菌丝生长速率测定，对测定结果进行分析后发现，抗性菌株在培养基上的生长速率比其亲本菌株慢（表4-3）；以测定时间和生长速率构建生长速率图，亲本菌株的生长曲线基本重合，但是抗性菌株的生长趋势较缓，并且差异性显著，且其中抗性菌株PWS2-1的生长速率最慢（图4-1）。菌丝生长速率测定结果表明，抗性菌株的菌丝生长速率比敏感菌株慢，呈现出差异显著性。24 第四章稻瘟病菌对戊唑醇抗性菌株的生物学特性研究表4-2.抗戊唑醇菌株PWS2-1和PMY30-1连续转接培养后EC50值的变化Table4-2.ThechangesofEC50oftebuconazole-resistantstrainofMagnaporthegriseaPWS2-1andPMY30-1aftercontinuoustransferencePWS2-1PMY30-1转接代数毒力回归方程EC50值(μg/mL)抗性倍数抗性水平毒力回归方程EC50值(μg/mL)抗性倍数抗性水平GenerationRegressionequationEC50valuesRe.multipleRe.standardRegressionequationEC50valuesRe.multipleRe.standardF0y=1.2703x+4.47852.573625.46中抗y=1.6818x+4.58341.768931.25中抗F2y=1.1618x+4.49382.727126.97中抗y=1.4758x+4.64211.747930.88中抗F4y=1.0574x+4.68671.978319.57中抗y=1.2873x+4.71101.676929.63中抗F6y=1.1210x+4.70541.831518.12中抗y=1.7810x+4.61931.635928.9中抗F8y=1.0054x+4.80461.564415.47中抗y=2.0818x+4.75531.310823.16中抗注：抗性倍数=抗性菌株EC50/亲本菌株EC50，PWS2-1与PMY30-1均为室内药剂驯化所得的中抗菌株，其亲本菌株分别为PWS2与PMY30。表格中均为无药平板转接培养。Note:resistancemultiple=EC50ofresistant-isolate/EC50ofparent-isolate,PWS2-1andPMY30-1wereobtainedbyfungicidetaminginlaboratory,andtheirparent-isolatewerePWS2andPMY30respectively.Theplatesfortransferringwerenofungicide.25 西南大学硕士学位论文表4-3.抗戊唑醇稻瘟病菌PWS2-1和PMY30-1及其亲本菌株PWS2和PMY30的菌丝生长速率测定Table4-3.Growthrateofisolatestebuconazole-resistantisolatesPWS2-1,PMY30-1andtheirparentisolatesPWS2,PMY30onPDA菌株生长时间Time(d)Isolate12345678910PWS24.08±0.14a11.50±0.50a19.17±0.76a27.67±1.15a35.83±1.44a43.17±1.04a50.67±2.08a58.17±2.25a66.17±2.75a71.92±1.18aPWS2-10.5±0.00c4.83±1.18c8.83±1.61c13.92±1.46c18.83±2.08c23.00±1.80c27.67±2.36c31.67±2.36c36.67±2.75c41.17±2.96cPMY304.33±0.29a11.00±0.00a18.25±0.43a26.08±0.14a34.17±0.29a41.58±1.01a49.50±0.87a58.08±4.27a64.33±2.31a71.33±1.53aPMY30-12.08±0.14b8.00±0.50b13.25±0.43b19.67±0.76b25.33±0.58b31.00±0.66b36.33±0.29b41.75±0.75b48.08±0.63b53.75±1.15b注:表中同列数据后不同字母表示采用Duncan氏新复极差法检验数值间差异显著(P＞0.05)。Note:DatainthesamecolumnfollowedbythedifferentlettersaresignificantlydifferentbyDuncan’snewmultiplerangetest(P＞0.05)807060PWS25040PWS2-130PMY30diameter(mm)菌落直径20PMY30-110colony01234567891011时间time(d)图4-1.PWS2,PMY30和抗戊唑醇菌株PWS2-1,PMY30-1的菌丝生长曲线Figure4-1.GrowthcurveofisolatesPWS2,PMY30andtebuconazole-resistantstrainPWS2-1,PMY30-1onPDA26 第四章稻瘟病菌对戊唑醇抗性菌株的生物学特性研究（2）戊唑醇抗性菌株的离体适合度亲本菌株PWS2在PDA培养基上生长10天后的菌落直径为71.92±1.18mm，而抗性菌株PWS2-1的菌落直径为41.17±2.96mm，存在显著性差异；而进行产孢量测定的结果显示，PWS2在OA培养基上5天产孢培养后平均每皿产孢1.44±0.05×108个，而抗性菌株PWS2-1的平均产孢量为1.90±0.25×108个，不存在显著性差异。离体适合度指数结果表明，抗性菌株PWS2-1的离体适合度指数为0.76，因此抗性菌株的离体适合度低于其亲本菌株（表4-4）。亲本菌株PMY30在PDA培养基上生长10天后的菌落直径为71.33±1.53mm，而抗性菌株PMY30-1的菌落直径为53.75±1.15mm，存在显著性差异；而进行产孢量测定的结果显示，PMY30在OA培养基上5天产孢培养后平均每皿产孢37.50±8.77×108个，而抗性菌株PMY30-1的平均产孢量为1.90±0.19×108个，存在显著性差异。离体适合度指数结果表明，抗性菌株PMY30-1的离体适合度指数为0.04，因此抗性菌株的离体适合度显著低于其亲本菌株（表4-4）。表4-4.抗戊唑醇的稻瘟病菌菌株的离体适合度Table4-4.Fitnessinvitrooftebuconazole-resistantisolateinMagnaporthegrisea菌株菌丝生长速率每皿产孢量离体适合度IsolateColonialgrowthrateSporesnumberperdish(×108)FitnessindexinvitroPWS271.92±1.18a1.44±0.05a1.00PWS2-141.17±2.96c1.90±0.25a0.76PMY3071.33±1.53a37.50±8.77b1.00PMY30-153.75±1.15b1.90±0.19a0.04注:表中同列数据后不同字母表示采用Duncan氏新复极差法检验数值间差异显著(P＞0.05)。Note:DatainthesamecolumnfollowedbythedifferentlettersaresignificantlydifferentbyDuncan’snewmultiplerangetest(P＞0.05).3.3.2戊唑醇抗性菌株的致病性接种戊唑醇抗性菌株PWS2-1和PMY30-1以及他们的亲本菌株PWS2和PMY30的孢子悬浮液于水稻叶片上，保湿培养后，进行致病力的比较，结果表明：戊唑醇抗性菌株PWS2-1和亲本菌株PWS2的致病性存在显著性差异，PMY30-1和亲本菌株PMY30的致病性也存在一定的差异性（表4-5，图4-2）。本研究中驯化所得的戊唑醇抗性菌株的致病性都比亲本菌株弱。27 西南大学硕士学位论文PWS2PWS2-1CKPMY30PMY30-1图4-2.离体叶片7d后的病斑产生情况Figure4-2.Theleafspotsafterinoculation7dinvitrobydifferentisolate表4-5.抗性菌株与亲本菌株的致病力比较Table4-5.AbilityofpathogenicitybetweentebuconazolesensitivestrainsandresistancestrainsofMagnaporthegrisea菌株病斑平均长度（mm）IsolateAveragelengthofdiseasespotPWS26.5±1.00bPWS2-13.6±0.52aPMY306.9±2.32bPMY30-15±0.90ab注:表中同列数据后不同字母表示采用Duncan氏新复极差法检验数值间差异显著(P＞0.05)。Note:DatainthesamecolumnfollowedbythedifferentlettersaresignificantlydifferentbyDuncan’snewmultiplerangetest(P＞0.05)3.4温度和PH值对抗性菌株和亲本菌株菌丝生长的影响(1)温度对菌丝生长速率的影响测定在不同的温度下抗性菌株及其亲本菌株的菌丝生长速率，以判定温度对28 第四章稻瘟病菌对戊唑醇抗性菌株的生物学特性研究于菌丝生长的影响。结果表明（表4-6，图4-3）温度对抗性菌株和其亲本菌株的菌丝生长均有影响。在不同温度下培养10d后，亲本菌株在8℃下生长缓慢，在36℃时不生长，抗性菌株在8℃与36℃时均不生长。最适宜的生长温度均为28℃，且抗性菌株的生长速率在每个温度下均显著低于其亲本菌株。说明抗性菌株的温度抗逆性不如其亲本菌株。9080706050PWS2diameter(mm)40菌落直径PWS2-130PMY30colonyPMY30-120100481216202428323640温度temperature(℃)图4-3.温度对抗戊唑醇菌株生长速率的影响Figure4-3.ColonydiameterofPWS2-1,PWS2andPMY30-1,PMY30indifferenttemperaturecultivatedfor10days.（2）pH值对菌丝生长速率的影响测定在不同的pH值下抗性菌株及其亲本菌株的菌丝生长速率，以判定pH值对于菌丝生长的影响。结果表明（表4-7，图4-4），pH值对于抗性菌株及其亲本菌株的菌丝生长均有影响。在不同的pH条件下生长10d后，抗性菌株及其亲本菌株在4~11的pH值范围内均能生长，最适pH值均为7，但是敏感菌株PMY30对强酸性环境的适应力较其他菌株强，而抗性菌株PMY30-1对强碱的适应力比其他菌株强。29 西南大学硕士学位论文80706050diameter(mm菌落直径PWS240PWS2-1colonyPMY3030PMY30-1201003456789101112温度temperature(℃)图4-4.pH值对抗戊唑醇菌株生长速率的影响Figure4-4.ColonydiameterofPWS2-1,PWS2andPMY30-1,PMY30indifferentpHvaluescultivatedfor10days.3.5戊唑醇抗性菌株对不同药剂的交互抗性采用菌丝生长速率法测定戊唑醇抗性菌株及其亲本菌株对三环唑、稻瘟灵、苯醚甲环唑、烯唑醇、稻瘟酰胺、吡唑醚菌酯的敏感性，以判定是否有交互抗性的现象。结果表明，戊唑醇抗性菌株和敏感菌株对DMIs类杀菌剂的敏感性有差异性，因此戊唑醇的抗性菌株对DMIs类杀菌剂有正交互抗性，对有机杂环类杀菌剂，苯氧酰胺类杀菌剂，黑色素合成抑制剂和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，敏感性差异不明显，因此无交互抗性。30 第四章稻瘟病菌对戊唑醇抗性菌株的生物学特性研究表4-6.戊唑醇抗性菌株在不同温度下的菌落生长直径（10d）Table4-6.Thecolonygrowthdiameterondifferenttebuconazole-resistantstrainsofMagnaporthegriseaindifferenttemperature菌株温度temperature(℃)Isolate812162024283236PWS20.33±0.38ab10.33±0.52a29.42±0.38a52.83±0.52a68.25±3.44a74.75±0.75a69.75±1.25a0.00±0.00aPWS2-10.00±0.00b1.75±1.15b13.17±1.18b24.92±1.61c32.83±1.18c42.50±1.89d40.42±0.95c0.00±0.00aPMY300.50±0.25a10.75±1.09a29.42±0.72a50.42±0.88b65.83±1.28a72.17±1.04b67.75±1.56a0.00±0.00aPMY30-10.00±0.00b2.00±0.43b13.33±0.38b26.08±0.52c38.17±0.80b49.33±1.15c43.67±2.16b0.00±0.00a注:表中同列数据后不同字母表示采用Duncan氏新复极差法检验数值间差异显著(P＞0.05)。Note:DatainthesamecolumnfollowedbythedifferentlettersaresignificantlydifferentbyDuncan’snewmultiplerangetest(P＞0.05)表4-7.戊唑醇抗性菌株及其亲本菌株在不同pH条件下的菌落生长直径（10d）Table4-7.Thecolonygrowthdiameterondifferenttebuconazole-resistantstrainsofMagnaporthegriseaindifferentpH菌株pH值pHvalueIsolate4567891011PWS255.00±1.32b67.92±0.38a70.67±1.38a73.25±0.75a70.00±0.50a61.83±3.79a49.00±2.00ab37.83±1.76aPWS2-118.83±2.08d36.42±0.95c40.17±0.38c43.25±0.66c43.67±0.88c40.17±0.38c16.58±4.64c13.33±4.86bPMY3064.50±0.00a69.67±0.29a71.50±0.50a72.17±0.58a69.50±0.50a64.50±0.00a51.50±3.97a41.17±4.65aPMY30-144.00±1.80c55.33±1.61b54.75±0.66b56.92±0.52b55.75±0.66b51.08±0.38b40.33±6.69b38.42±8.32a注:表中同列数据后不同字母表示采用Duncan氏新复极差法检验数值间差异显著(P＞0.05)。Note:DatainthesamecolumnfollowedbythedifferentlettersaresignificantlydifferentbyDuncan’snewmultiplerangetest(P＞0.0531 西南大学硕士学位论文表4-8.抗戊唑醇菌株对不同杀菌剂的交互抗性测定Table4-8.Cross-resistanceofPWS2-1andPMY30-1tosixkindsoffungicidesEC50值抗性倍数交互抗性杀菌剂菌株编号毒力回归方程相关系数EC50resistanceCrossFungicidesisolateRegressionequationRelativecoefficientvaluefactorresistancePWS2y=1.6321x+6.62430.95850.1011戊唑醇PWS2-1y=1.2703x+4.47850.95602.573625.46中抗TebuconazolePMY30y=1.3897x+6.73290.9630.0566PMY30-1y=1.6818x+4.58340.97321.768931.25中抗PWS2y=2.0620x+3.44960.97965.65稻瘟灵PWS2-1y=1.5955x+3.43870.97279.521.69无IsoprothiolanePMY30y=2.6224x+2.81690.9116.80PMY30-1y=1.9898x+3.00290.960110.081.48PWS2y=1.8023x+1.00220.9757165.26稻瘟酰胺PWS2-1y=0.7241x+3.33680.9357198.121.20无FenoxanilPMY30y=1.3987x+2.26690.951389.96PMY30-1y=1.2375x+2.15600.9709198.692.21PWS2y=2.7982x-0.74510.902113.02三环唑PWS2-1y=2.1976x+0.80210.9181.320.72无TricyclazolePMY30y=2.6434x-0.25560.903497.32PMY30-1y=1.9440x+1.02960.9337110.251.13PWS2y=1.1440x+6.85090.97540.02吡唑嘧菌酯PWS2-1y=0.8267x+6.25300.99250.031.27无PyraclostrobinPMY30y=0.8594x+6.61880.98190.01PMY30-1y=1.0168x+6.51790.98090.032.45PWS2y=1.0392x+5.58140.91610.28烯唑醇PWS2-1y=0.8081x+4.78980.99121.826.60正交互抗性DiniconazolePMY30y=1.4323x+6.01580.9250.20PMY30-1y=0.8222x+4.99240.99161.025.23PWS2y=1.0469x+4.89040.92941.27苯醚甲环唑PWS2-1y=0.4297x+4.61060.90558.066.33正交互抗性DifenoconazolePMY30y=0.9505x+4.73570.93191.90PMY30-1y=0.4430x+4.56260.95139.715.1232 第四章稻瘟病菌对戊唑醇抗性菌株的生物学特性研究4讨论抗性菌株的适合度的强弱是影响抗性群体形成的重要因素之一，其将会影响抗性菌株与敏感菌株在田间的竞争力的结果。如果抗性菌株的生长竞争力弱于敏感菌株，通过对于药剂的使用策略的调整，降低选择压力后，在田间便很难形成抗性菌株的优势群体，则抗药性问题较难出现[119]。因此在药剂的大量使用前，可以先进行抗性风险分析，根据分析结果来指导田间用药的策略，从而延缓田间抗药性产生的时间与速率，延长药剂的使用寿命。目前所报道的多数病原菌的抗性菌株的适合度都低于敏感菌株。室内紫外灯诱导所形成的小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性菌株在适合度测定时显示，虽然其产孢能力，生长速率等方面与敏感菌株无显著性的差异，但是其孢子萌发能力显著低于敏感菌株，50%抗性突变体的孢子萌发时间也比野生菌株滞后[120]。紫外灯诱导获得的禾谷镰孢菌对戊唑醇的抗性菌株的适合度测定结果显示，抗性菌株的在菌落生长速率、菌丝干重、对温度和pH值的敏感性等方面与其亲本菌株相比较均有所下降[121]。药剂驯化所产生的禾谷丝核菌的戊唑醇抗性菌株的菌丝生长速度和菌核产生速度比敏感菌株有所下降[113]。室内诱导形成的抗啶酰菌胺的蔬菜灰霉病菌突变体的生长速率，对酸碱和pH值的适应能力、产孢能力和孢子萌发能力等均低于敏感菌株[122]。本研究在实验室内通过药剂驯化的方式得到两株戊唑醇的中抗菌株，并将它们的生物学特性与亲本菌株进行比较。结果表明，抗性菌株的生长速率显著低于亲本菌株；产孢能力没有差异或者显著低于亲本菌株；致病性显著低于亲本菌株；抗逆性趋势一致；因此，戊唑醇抗性菌株的生长适应性较亲本菌株弱，即使在田间出现了抗药性菌株，抗药性菌株的竞争力比敏感菌株弱，则不易形成优势种群。但是抗性菌株对于作用机制相同的三唑类药剂能产生正向交互抗性，因此也不排除其形成优势种群的可能性。在以后药剂的使用过程中应该进行实时监测，并与其它不同机制的药剂进行混合使用，已达到有效进行稻瘟病菌药剂治理的目的。33 西南大学硕士学位论文34 第五章稻瘟病菌戊唑醇抗性的分子机理研究第五章稻瘟病菌戊唑醇抗性的分子机理研究病原菌对杀菌剂产生抗性的根本原因是对于杀菌剂作用机制的破坏，主要包含有生理生化机制和分子机制等方面。而其中的分子机制则是抗性形成与发展的本质因素。因此对于抗性菌株的抗药性产生的分子机制的研究有利于从根本上规避抗药性的形成和发展提供理论依据。植物病原真菌对DMIs类杀菌剂产生抗药性的机制较为复杂，关于分子机制目前的报道主要集中在ABC运输体的多药抗性与cyp51基因的基因突变和过量表达方面。本研究主要对戊唑醇的靶标基因cyp51的编码序列和表达量进行研究，以期找到稻瘟病菌在经过药剂驯化后产生抗药性的分子机理，为后面的稻瘟病菌对戊唑醇的抗性分子机理的深入研究打下坚实的基础。1试验材料1.1菌株PWS2-1、PMY30-1均由实验室药剂驯化所得（第四章），PWS2、PMY30田间采集保存。1.2试剂pGM-T克隆载体试剂盒（天根）、通用型DNA纯化回收试剂盒（天根）、DL2000DNAMarker（天根）、TRNzol试剂（天根）、DNase（宝生物工程(大连)有限公司）、ReventAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit反转录试剂盒（MBIFermentas公司）、2×SYBRGreenRealtimePCRMasterMix（东洋纺(上海)生物科技有限公司），其余试剂均为国产分析纯。1.3培养基马铃薯琼脂培养基（PDA），同第二章1.3。1.4仪器S1000TM梯度PCR扩增仪（美国伯乐公司）；5424高速离心机（德国艾本德公司）；GelDoxXR凝胶成像仪（美国伯乐公司）；实时荧光定量PCR仪（美国伯乐CFX96TMRealtimeSystem;Xylanfrombeechwood购于美国sigma公司）、35 西南大学硕士学位论文2试验方法2.1病原菌基因组DNA提取采用CTAB法[123]提取戊唑醇抗性菌株及其亲本菌株的DNA。A．将PWS2、PMY30与PWS2-1、PMY30-1在PDA平板上28℃下培养10天，刮取菌落表面的菌丝，加少量石英砂和液氮迅速研磨2-3次将菌丝磨成细粉状。B．将研磨后的菌丝粉末转移至灭菌后的1.5mL的EP管内，迅速加入在65℃水浴锅中预热后的2%CTAB提取液800μl和10%的SDS80μl，快速混匀，65℃水浴30-60min，期间每隔5-10min轻柔震荡一次。C．水浴结束后在室温下下离心10min（10000-12000rpm），缓慢吸取上清液至新的1.5mLEP管中。加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液进行抽提，10000-12000rpm离心10min，重复两次。D．缓慢吸取上清液至新的1.5mLEP管中，加入2.5倍体积的无水乙醇（或者等体积的异丙醇），再加入0.1体积的3MNaAc，在-20℃下沉淀过夜。E．沉淀后在离心10min（10000-12000rpm），舍弃上清液，加入70%的乙醇漂洗两次。离心10min，用移液枪沿着管壁轻轻吸出多余的乙醇，置于室温敞开离心管盖子晾干至沉淀半透明。F．将所得到的沉淀用50-100μl的TE缓冲液（或者灭菌后的ddH2O）进行溶解，取5μl进行点样进行凝胶检测，其余的置于-20℃下保存备用。2.2cyp51基因的扩增测序2.2.1引物的设计与合成cyp51基因在稻瘟病菌中具有两个蛋白亚型，因此具有两段基因序列（MGC_04432.4，MGC_04628.4）[124]，其基因序列由NCBI上获得。使用primerpremier软件对两段cyp51基因进行扩增的引物设计，并由上海生物工程技术公司进行合成。引物序列如下：Cyp51-Ⅰ：Cyp51-ⅠF：5’-ATGGGCCTTCTACAGGACACC-3’Cyp51-ⅠR：5’-TTAGCGCCTCTCCCAGTAAATT-3’Cyp51-Ⅱ：Cyp51-ⅡF：5’-CTACGCAGTCTTCGGGCT-3’Cyp51-ⅡR：5’-ATGGCTTTCTTCTTCCC-3’2.2.2cyp51基因序列扩增本章PCR所用的DNALAtaq酶均购自于takarabiotechnology(dalin)co.ltd.36 第五章稻瘟病菌戊唑醇抗性的分子机理研究（宝生物工程有限公司）。以2.1所提取的DNA作为模板，对戊唑醇抗性菌株PWS2-1和PMY30-1以及他们的亲本菌株PWS2和PMY30的cyp51基因进行扩增。2.2.2.1PCR扩增体系TaKaRaLATaq(5U/µL)0.25µLdNTPMixture(2.5mmol/L)4.0µL10×LAPCRBufferⅡ(Mg+Free)2.5µLMgCl2(25mmol/L)1.6µLprimer1（10µmol/L）1.0µLprimer2（10µmol/L）1.0µLDNA约0.5ngddH2Oupto25µL2.2.2.2PCR反应程序94℃10min94℃1min58℃1min35cycles72℃2min72℃10min16℃10min2.2.3PCR产物连接转化A取PCR扩增产物6µL在含goldview1.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，100伏稳压电泳约30min，在凝胶成像系统上观察扩增的片断大小并拍照。B电泳检测确定后，用通用型DNA纯化回收试剂盒对目的片段进行回收，回收产物在-20℃下保存。C将反应体系内的各种成分加入到无菌的离心管中反应体系如下：目的PCR片段（约50ng/ul）3pGM-TVector(50ng/ul)110*T4DNALigationBuffer1T4DNALigase(3U/ul)1ddH2O4D轻弹离心管，短暂离心，在16℃下进行过夜连接。将过夜连接后的离心37 西南大学硕士学位论文管置于冰上进行下步反应。E将连接产物加入到50μL的感受态细胞DH5α中（感受态细胞置于冰上溶解，刚解冻时即加入），移液枪轻轻吹打冰浴30min，后置于42℃水浴90s，取出后立即在冰盒中放置3min。F将LB液体培养基（不含抗生素）在37℃培养箱进行预热，加入500μL的预热后的培养基置于离心管中，37℃震荡培养45min（150rmp），复苏菌体。G吸取离心管中的菌液100μL涂布在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养12h。H挑取单菌落在含50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，用37℃摇床培养约6h（140rmp/min），用目的基因的引物对菌液进行PCR扩增，然后进行电泳检测，选取3个连接转化成功的菌液送至上海生工生物工程有限公司测序。2.2.4测序结果分析对测序结果用Bioxm和DNAMAN软件进行处理。对同一个菌株的三个测序样品的基因序列进行比对，确认完全一致后再进行使用。将戊唑醇抗性菌株PWS2-1和PMY30-1以及他们的亲本菌株PWS2和PMY30的基因序列进行比对分析。寻找是否具有突变位点，若有位点的突变则对其翻译的氨基酸序列进行比对，找到由于突变造成氨基酸改变的氨基酸位点。2.3病原菌RNA的提取A．将PWS2、PMY30与PWS2-1、PMY30-1在PDA平板上28℃下培养10天，刮取菌落表面的菌丝，加少量石英砂和液氮迅速研磨2-3次将菌丝磨成细粉状。B将研磨后的粉末迅速转移到经过depc水处理后的1.5mLEP管中，并加入1mlTRNzol混匀，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。C4℃离心10min(12,000r/min)，将上清液转移至新的depc水处理后的1.5mL的EP管中，并加入0.2ml的氯仿，剧烈振荡15s后在室温下放置3min。D在4℃离心机下离心15min（12,000r/min），样品呈现分层，因为RNA主要在上层的水相中，因此取上层的水相至新的EP管中，并加入等体积的异丙醇混匀，在室温下放置20-30min。E在4℃离心机下离心10min（12,000r/min），去掉上清保留沉淀，用75%的乙醇(RNase-FreeddH2O配置)对沉淀进行洗涤，离心10min，用移液枪沿着管壁轻轻吸出多余的乙醇，置于室温敞开离心管盖子晾至2-3min。F加入42μLRNase-FreeddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。2.4cDNA的转化A向2.6所获得的42μLRNA溶液中加入10×DnaseIBuffer5μL，Recombinant38 第五章稻瘟病菌戊唑醇抗性的分子机理研究Dnase2μL，RRI1μL，将混合液在离心机上稍微离心一下，37℃反应20-30min，72℃反应5min后迅速放回冰上冷却2min，稍微离心一下。B从处理过的RNA中取出2μL加入到经depc处理过的PCR管中，再加入1μL的oligo（dT）18primer，加水9μL补足至12μL，离心机稍微离心后迅速放入72℃水浴锅中反应5min后放置于冰上。C在混合液中加入5×ReactionBuffer4μL，10mMdNTPMix2μL，RiboLockRNaseInhibitor1μL，RevertAidM-MuLVReverseTranscriptase1μL，混合均匀并短暂离心，置于42℃水浴锅中反应60min，迅速转移至72℃反应5min后置于冰上。cDNA在-20℃短暂保存的时间不超过7d，-80℃下可长期保存，但也不能超过1个月。2.5cyp51基因的表达量的测定以稻瘟病菌的tublin基因作为对照基因，用实时荧光定量PCR检测戊唑醇抗性菌株PWS2-1、PMY30-1与亲本菌株PWS2、PMY30的cyp51基因的表达量。2.5.1引物设计根据GenBank中找到的稻瘟病菌的基因序列，使用primerpremier软件对tublin基因和两段cyp51基因进行定量PCR的引物设计，并由上海生物工程技术公司进行合成。引物序列如下：Tublin：tubulin-F:5’-AGCGGTCTGGATGTTGTT-3’tubulin-R:5’-TGATGGCTGCTTCTGACTT-3’CYP51-ⅠCYP51-1-1:5’-GAAGCGTATTCGTTAGTCCC-3’CYP51-1-2:5’-TTCGACGGTCACGTATGG-3’CYP51-ⅡCYP51-2-1:5’-TGGCCGCCAGGTTGAGAT-3’CYP51-2-2:5’-CGCCCAGGACGACGAGATT-3’2.5.2反应体系2×SYBRGreenRealtimePCRMasterMix10μL正向引物0.2μmol/L反向引物0.2μmol/LcDNA模板50ng总体积20μL39 西南大学硕士学位论文2.5.3反应程序95℃，2min95℃20s56℃15s40cycles72℃20s16℃10min3.结果与分析3.1抗性菌株与亲本菌株的cyp51基因序列差异3.1.1cyp51基因的克隆通过引物对cyp51-ⅠF和cyp51-ⅠR对戊唑醇抗性菌株PWS2-1，PMY30-1和其亲本菌株PWS2，PMY30的cyp51-Ⅰ基因进行了PCR扩增，均获得长度为1710bp的DNA片段。通过引物对cyp51-ⅡF和cyp51-ⅡR对戊唑醇抗性菌株PWS2-1，PMY30-1和其亲本菌株PWS2，PMY30的cyp51-Ⅱ基因进行了PCR扩增，均获得长度为1553bp的DNA片段（图5-1）。M123456782000bp1000bp750bp图5-1PWS2-1与PMY30-1及其亲本菌株PWS2和PMY30的目的基因片段电泳图Figure5-1.TheelectropherogramoftargetgenesegmentinPWS2-1,PMY30-1andparentalisolatesPWS2,PMY30注：1.菌株PWS2的cyp51-Ⅰ基因片段；2.菌株PWS2-Mut1的cyp51-Ⅰ基因片段；3.菌株PMY30的cyp51-Ⅰ基因片段；4.菌株PMY30-Mut1的cyp51-Ⅰ基因片段；5.菌株PWS2的cyp51-Ⅱ基因片段；6.菌株PWS2-Mut1的cyp51-Ⅱ基因片段；7.菌株PMY30的cyp51-Ⅱ基因片段；4菌株PMY30-Mut1的cyp51-Ⅱ基因片段。3.1.2基因序列比对结果40 第五章稻瘟病菌戊唑醇抗性的分子机理研究3.1.2.1PWS2-1及其亲本菌株的cyp51-Ⅰ基因序列的比对结果经过双向测序后确定了PWS2-1和PWS2的cyp51-Ⅰ的基因片段序列，在进行比对后发现，抗性菌株与其亲本菌株的基因序列完全一致，没有出现基因位点突变。3.1.2.2PMY30-1及其亲本菌株的cyp51-Ⅰ基因序列的比对结果经过对PMY30-1和PMY30的cyp51-Ⅰ基因测序结果进行比对后发现，PMY30-1的基因序列与其亲本菌株的序列存在一个位点的突变（图5-2）。第68位碱基由A变成G，则相应的第23位氨基酸由精氨酸变成甘氨酸（表5-1）。表5-1.抗性菌株PMY30-1与亲本菌株PMY30的cyp51-Ⅰ编码基因及相应的氨基酸位点Table5-1.ComparisonpositionofPMY30-1andPMY30ofcyp51-Ⅰgeneandthecorrespondingencodedaminoacid菌株碱基位点BaseSiteIsolate68CAGPMY30ArgCGGPMY30-1Gly3.1.2.3PWS2-1及其亲本菌株的cyp51-Ⅱ基因序列的比对结果经过对PWS2-1和PWS2的cyp51-Ⅱ基因测序结果进行比对后发现，PWS2-1的基因序列存在四个位点的突变（图5-2），第487位碱基由C变成T，757位碱基由T变成A，770位碱基由T变成C，1338位碱基由C变成T。氨基酸也有相应的变化（表5-3），第163位氨基酸由精氨酸变成半胱氨酸，253由苯基丙氨酸变成异亮氨酸，257由缬氨酸变成丙氨酸，第446位氨基酸仍然为半胱氨酸，没有变化。表5-2.抗性菌株PWS2-1与其亲本菌株PWS2的cyp51-Ⅱ编码基因及相应的氨基酸位点Table5-2.ComparisonpositionofPWS2-1andPWS2ofcyp51-Ⅱgeneandthecorrespondingencodedaminoacid碱基位点菌株BasesiteIsolate4877577701338CGCTTCGTCTGCPWS2ArgPheValCysTGCATCGCCTGTPWS2-1CysIleAlaCys41 西南大学硕士学位论文3.1.2.4PMY30-1及其亲本菌株的cyp51-Ⅱ基因序列的比对结果经过双向测序后确定了PMY30-1和PMY30的cyp51-Ⅱ的基因片段序列，在进行比对后发现，抗性菌株与其亲本菌株的基因序列完全一致，没有出现基因位点突变。3.2cyp51基因表达量测定结果3.2.1抗性菌株及其亲本菌株的cyp51-Ⅰ基因表达量测定结果使用稻瘟病菌的保守序列tublin基因作为对照，使用引物对cyp51-1-1/cyp51-1-2对抗性菌株及其亲本菌株的cyp51-Ⅰ基因的表达量进行测定。结果表明，PWS2-1的cyp51-Ⅰ基因表达量较PWS2明显增加，而PMY30-1的表达量较PMY30明显降低。推测抗性的大小与cyp51-Ⅰ基因的表达量不存在明显的因果关系，这可能与病原菌本身所存在的差异性有关。表5-4抗性菌株PWS2-1、PMY30-1与亲本菌株PWS2、PMY30的cyp51-Ⅰ基因表达量的对比Table5-4.Comparisonexpressionlevelofcyp51-Ⅰgenebetweentebuconazole-resistantstrainsPWS2-1、PMY30-1andparentstrainsPWS2、PMY30目的基因菌株编号表达量标准偏差TargetSampleExpressionExpressionSEMcyp51-ⅠPWS20.400250.03154cyp51-ⅠPWS2-11.000000.04945cyp51-ⅠPMY305.456600.67442cyp51-ⅠPMY30-10.528030.032777.006.005.004.00表达量3.00Expression2.001.000.00PWS2PWS2-1PMY30PMY30-1菌株编号isolate图5-4.抗性菌株PWS2-1、PMY30-1与亲本菌株PWS2、PMY30的cyp51-Ⅰ基因表达量Figure5-4.Expressionlevelofcyp51-Ⅰgenebetweentebuconazole-resistantstrainsPWS2-1、PMY30-1andparentstrainsPWS2、PMY30.42 第五章稻瘟病菌戊唑醇抗性的分子机理研究3.2.1抗性菌株及其亲本菌株的cyp51-Ⅱ基因表达量测定结果使用稻瘟病菌的保守序列tublin基因作为对照，使用引物对cyp51-2-1/cyp51-2-2对抗性菌株及其亲本菌株的cyp51-Ⅱ基因的表达量进行测定。结果表明，抗性菌株PWS2-1与PMY30-1的cyp51-Ⅱ基因表达量均明显低于其亲本菌株。表5-5.抗性菌株PWS2-1、PMY30-1与亲本菌株PWS2、PMY30的cyp51-Ⅱ基因表达量的对比Table5-5.Comparisonexpressionlevelofcyp51-Ⅱgenebetweentebuconazole-resistantstrainsPWS2-1、PMY30-1andparentstrainsPWS2、PMY30目的基因菌株编号表达量标准偏差TargetSampleExpressionExpressionSEMcyp51-ⅡPWS21.009740.08521cyp51-ⅡPWS2-10.063420.00871cyp51-ⅡPMY302.119410.31778cyp51-ⅡPMY30-10.087680.006593.002.502.001.50表达量Expression1.000.500.00PWS2PWS2-1PMY30PMY30-1菌株编号isolates图5-5.抗性菌株PWS2-1、PMY30-1与亲本菌株PWS2、PMY30的cyp51-Ⅱ基因表达量Figure5-5.Expressionlevelofcyp51-Ⅱgenebetweentebuconazole-resistantstrainsPWS2-1、PMY30-1andparentstrainsPWS2、PMY30.4讨论戊唑醇是DMIs类杀菌剂，主要作用于14α-脱甲基酶，目前已有其他菌株产生抗药性的报道。病原菌产生抗药性的分子机制主要包括：ABC基因的多药性抗性以及靶标基因cyp51的相关位点突变，过量表达等等。本研究主要扩增出了稻瘟病菌的两个cyp51蛋白亚型的编码基因，通过测序以及荧光定量PCR的43 西南大学硕士学位论文测定，以完成对于稻瘟病菌对戊唑醇产生抗药性的分子机制的初步研究。本研究的结果表明，抗性菌株PWS2-1的cyp51-Ⅰ基因没有发生位点的突变；cyp51-Ⅱ基因的序列与亲本菌株相比有三个氨基酸发生了变化。抗性菌株PMY30-1的cyp51-Ⅰ基因的序列与亲本菌株相比有一个氨基酸发生了变化；cyp51-Ⅱ基因没有发生位点的突变。因此通过不同菌株的横向比较可以发现，两个抗性菌株的基因位点突变并不一致，这可能与菌株的个体差异性有关。但是这仅仅是初步的研究结果，并且在李波涛等对室内诱导产生的对DMIs类杀菌剂氟环唑产生抗性的稻瘟病菌的抗性分子机理研究结果表明，部分抗性菌株的cyp51A基因分别在I125L、Y126F、H297Y发生了点突变，部分抗性菌株不存在点突变；抗性菌株的cyp51B基因没有发生点突变[111]与本研究结果并不一致。在用S.cerevisiae异源表达的验证结果表明，同一点突变对不同的三唑类杀菌剂敏感性表现不一致，且不同位置的点突变在同一病原菌中对不同三唑类杀菌剂的敏感性影响也不同[125]。cyp51基因的点突变数量在不同的真菌中不同，有单个发生的，也有多个同时发生的，并且对抗药性具有积累效应[126]。因此本研究的结果仅仅只是稻瘟病菌对戊唑醇抗性分子机理的初步探讨，要想验证与稻瘟病菌抗性产生相关的cyp51基因点突变的准确信息，需要进行基因敲除，基因沉默等技术手段的应用对更多的戊唑醇抗性菌株进行深入研究。本研究的结果表明，抗性菌株PWS2-1的cyp51-Ⅰ基因表达量较亲本菌株高；cyp51-Ⅱ基因表达量较亲本菌株低。抗性菌株PMY30-1的cyp51-Ⅰ基因的表达量显著降低；cyp51-Ⅱ基因表达量较亲本菌株低。因此通过不同菌株的横向比较可以发现cyp51-Ⅰ基因的表达量变化趋势不一致，说明稻瘟病菌的抗性产生机制可能与cyp51-Ⅰ基因的表达量没有直接的相关性；而抗性菌株的cyp51-Ⅱ基因的表达量与亲本菌株相比均显著降低，而在李波涛的研究中实时荧光定量PCR表明，药剂可诱导稻瘟病菌cyp1A基因的过量表达[111]，且在其他病原菌对DMIs类杀菌剂的分子机理研究中的与cyp51基因表达量相关的机制也均为上游区域小片段的插入所引起的过量表达相关[95-97,127]，与本研究的结果并不一致。因此本研究中的抗性菌株的cyp51基因表达量或许与菌株的抗性倍数不同或者不同菌株的个体差异性有关，而与抗性产生的分子机制可能没有直接关系。为了确定抗性菌株与cyp51基因的表达量之间的关系可以通过基因操纵的方式插入片段进行目的基因过量或者少量表达来验证菌株的抗性变化，对于目的基因表达量与对药剂的敏感性之间的关系进行确认。同时，稻瘟病菌对DMIs类杀菌剂的分子抗性机制也可能与ABC运输体的多药抗性相关，在本研究中并未涉及对于ABC基因的位点突变，表达量的变化以及基因敲除等方面的研究，这些均需要进一步的研究证明。44 第六章结论与展望第六章结论与展望1结论本研究通过对四川省、重庆市和贵州省的16个区县的稻瘟病菌进行采集分离共获得了1014株野生型稻瘟病菌。通过菌丝生长速率法进行了西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感基线的建立，为0.2154±0.1497µg/mL。根据MIC值的测定结果4µg/mL作为区分剂量对所有菌株进行抗药性监测，结果表明西南地区共出现2株低抗菌株，分别来自四川宣汉和重庆涪陵，且抗性极低，因此对戊唑醇敏感的菌株依然为西南地区稻瘟病菌的优势种群。室内药剂驯化得到的中抗菌株的生物学特性研究的结果表明抗性菌株的离体适合度和致病性均低于抗性菌株较难形成优势种群，但是抗性菌株对于相同机制的三唑类杀菌剂具有正交互抗性，因此田间用药需要制定合理的策略来延缓抗性。对抗性菌株的分子机制研究结果表明，抗性菌株与其亲本菌株相比具有目的基因的位点突变，只是两个抗性菌株的突变位点并不一致，PWS2-1的cyp51-Ⅱ基因有四个碱基发生突变，而PMY30-1的cyp51-Ⅰ基因有一个碱基发生突变，这可能是他们产生抗性的原因。而在本研究中目的基因cyp51基因的表达量与对戊唑醇的抗性之间并不存在明显的相关性，可以采集田间的抗性菌株或者是实验室诱导稳定遗传的高抗菌株等方式进行进一步的研究证明。2展望采样过程中的调查结果显示，西南地区的主要防治稻瘟病菌的药剂为稻瘟灵和三环唑，戊唑醇并未在该地区进行使用。而本研究结果表明，西南地区的戊唑醇抗性菌株发生频率极小且为低抗，而且室内驯化的抗性菌株对稻瘟灵与三环唑不具有交互抗性，因此可以在今后对稻瘟病的防治过程中，制定将戊唑醇与稻瘟灵或三环唑进行混用等策略来合理高效的防治西南地区稻瘟病的发生与流行。本研究的室内药剂驯化仅仅获得了中抗菌株，对于抗性研究的代表性并不是很强。因此在以后的研究过程中，可以再次进行药剂驯化或者紫外灯诱变的方式来获得高抗菌株，再次进行生物学特性的分析以及抗性机制的研究等等，为稻瘟病菌对戊唑醇的抗性风险分析提供更有利的基础。本研究仅仅是进行了抗性分子机制的研究，且仅仅是cyp51基因的研究。可以在此基础上进行cyp51基因的深入研究，以验证抗性的产生是否与cyp51基因的位点突变或者表达量的变化有关。同时也可以进行ABC运输体的研究以及其他的生理生化机制的研究等等。45 西南大学硕士学位论文46 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附录附录附表1.2013-2015年西南地区150株稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性Table.1Sensitivityof150MagnaporthegriseaisolatestotebuconazoleinSouthwestChinain2013-2015序号菌株编号毒力回归方程相关系数EC50SequenceIsolatesRegressionequationCorrelationcoefficientμg/mL1PSYC47y=1.2708x+6.68130.96840.04752PMY16y=1.2458x+6.64500.97450.04783PYC84y=1.2662x+6.58680.98650.05584PMY30y=1.3897x+6.73290.9630.05665PMY7y=1.3055x+6.62050.97180.05746PMY13y=1.5105x+6.86420.95810.05837PMY18y=1.2067x+6.48090.96170.05938PSYC37y=1.4176x+6.72610.97380.06069PSYC35y=1.2987x+6.55920.98310.063010PBS69y=1.2788x+6.52390.98680.064311PSYC44y=1.2816x+6.51030.94590.066312PMY15y=1.3420x+6.57750.96050.066813PBS50y=1.2652x+6.48180.93380.067414PMY11y=1.4571x+6.70340.94370.067815PSYC29y=1.2103x+6.40520.9670.06916PZX12y=1.4109x+6.63460.94210.069417PYY1y=1.2420x+6.42640.95870.071018PLZ11y=1.3133x+6.49560.98660.072619PLZ18y=1.1503x+6.30500.98660.073420PSYC16y=1.2364x+6.38480.93350.075921PMY29y=1.4649x+6.63380.9670.076722PYC27y=1.3738x+6.52190.95410.078023PYA5y=1.5324x+6.69570.97060.078224PLZ3y=1.6166x+6.78680.97620.078525PYC28y=1.3432x+6.48190.96190.078826PYC61y=1.3200x+6.45350.95680.079227PYC37y=1.3521x+6.43980.94650.086157 西南大学硕士学位论文序号菌株编号毒力回归方程相关系数EC50SequenceIsolatesRegressionequationCorrelationcoefficientμg/mL28PLZ4y=1.5713x+6.66350.99620.087429PSYC4y=1.3168x+6.38810.96550.088330PBS63y=1.5198x+6.59030.95690.089931PSYC52y=1.3600x+6.41920.94650.090532PYC34y=1.5671x+6.62820.9930.091433PMY4y=1.3831x+6.43450.97120.091834PSYC46y=1.6387x+6.69700.99070.092135PSYC31y=1.4183x+6.44620.93770.095636PSYC32y=1.3475x+6.36000.95640.097937PYY5y=1.7090x+6.72470.95220.097938PYC71y=1.2724x+6.28040.96380.098639PLZ14y=1.3311x+6.33750.96050.098940PWS2y=1.6321x+6.62430.95850.101141PYA21y=1.3436x+6.33640.98190.101242PBS55y=1.4027x+6.37750.96980.104243PBS38y=1.3944x+6.36660.95860.104744PSYC39y=1.5200x+6.45440.96810.110445PLZ2y=1.5120x+6.43220.96620.112946PYY8y=1.6131x+6.52750.96170.113047PBS34y=1.5931x+6.49630.95590.115048PBS57y=1.7949x+6.68540.92020.115149PYY7y=1.6536x+6.54640.9130.116150PWS1y=1.6905x+6.58010.95740.116251PYY4y=1.6404x+6.53340.95670.116252PSYC57y=1.5424x+6.42200.96540.119753PMY26y=1.4182x+6.29980.93310.121254PYA14y=1.5733x+6.44150.960.121355PBS44y=1.1720x+6.06880.92470.122556PYC88y=1.5916x+6.43530.97910.125457PLZ19y=1.5761x+6.38860.98510.131558PYA8y=1.3763x+6.21210.9760.131659PYC66y=1.5090x+6.32640.94240.132158 附录序号菌株编号毒力回归方程相关系数EC50SequenceIsolatesRegressionequationCorrelationcoefficientμg/mL60PYC40y=1.5346x+6.34810.94110.132361PSZ24y=0.9701x+5.85010.92460.13362PFL91y=0.9572x+5.83440.91990.134463PSYC36y=1.4748x+6.2790.92730.135864PBS21y=1.0743x+5.93080.93360.136065PLZ10y=1.3936x+6.20330.93760.136966PMY1y=1.8180x+6.56470.9450.137867PBS60y=1.5696x+6.34860.92690.138368PLZ15y=1.7215x+6.47250.98590.139569PYC36y=1.2322x+6.05010.94760.140570PYA23y=1.6900x+6.43210.96260.142171PYY2y=1.4590x+6.23500.96670.142472PYA4y=1.4061x+6.18120.95340.144573PYC7y=1.3990x+6.15250.95310.150074PBS15y=1.3898x+6.12930.92360.154075PBS66y=1.4356x+6.16500.95750.154376PYA12y=1.4921x+6.20520.96850.155777PSYC41y=1.2819x+6.02270.9440.159378PBS53y=1.2505x+5.99460.94020.160279PLZ13y=1.7392x+6.36580.96980.163980PYC49y=1.4641x+6.14740.94320.164681PSZ42y=1.1572x+5.90020.93320.166882PFL7y=1.8839x+6.44510.78210.171083PBS4y=1.3716x+6.04370.92860.173484PYC25y=1.2652x+5.96060.96010.174185PYC78y=1.2791x+5.97020.96290.174486PBS23y=1.2625x+5.92700.95090.184487PYC73y=1.4318x+6.04560.90680.186188PSYC48y=1.1929x+5.85880.96630.190689PMY22y=1.4155x+5.97620.96390.204390PFL39y=0.8616x+5.58880.93310.207391PZX23y=1.4526x+5.99170.94610.207659 西南大学硕士学位论文序号菌株编号毒力回归方程相关系数EC50SequenceIsolatesRegressionequationCorrelationcoefficientμg/mL92PYC20y=1.2343x+5.82920.94710.212993PFL58y=1.3931x+5.93560.97980.213094PYC54y=1.6977x+6.10960.98660.222095PLZ7y=1.1597x+5.75610.92330.222996PSYC42y=1.2395x+5.80790.98730.222997PYY3y=1.3501x+5.87990.97520.223098PSZ37y=1.4588x+5.94800.94380.223999PLZ16y=1.2979x+5.84100.94580.2249100PYA19y=1.0558x+5.67990.93650.2270101PBS28y=1.1898x+5.75270.96130.2330102PXH47y=0.9022x+5.56580.9350.2360103PYA1y=1.0401x+5.63850.95260.2433104PYY6y=1.1694x+5.70950.98510.2473105PWL3y=1.3903x+5.81730.960.2583106PYA10y=1.6618x+5.96880.96060.2612107PZX17y=2.443x+6.37650.96280.2734108PYC52y=1.1976x+5.67310.96050.2741109PSYC59y=2.3521x+6.31930.92010.2749110PWL23y=2.2709x+6.23910.99310.2847111PYA16y=2.6977x+6.43320.97190.2943112PXH31y=2.3538x+6.24120.94850.2969113PLZ17y=0.9570x+5.47530.97940.3187114PMG22y=2.7059x+6.32300.92460.3244115PSZ14y=2.1173x+6.03480.94160.3245116PZX46y=0.9326x+5.44460.93560.3336117PXH1y=2.558x+6.21090.93100.3362118PSZ26y=3.1411x+6.46760.93320.3410119PYA17y=1.5181x+5.69440.96260.3488120PXH32y=2.4886x+6.10520.91160.3597121PDJY9y=2.0090x+5.88090.91810.3644122PFL16y=1.5083x+5.65870.93770.3658123PWL9y=1.3436x+5.58590.92950.366460 附录序号菌株编号毒力回归方程相关系数EC50SequenceIsolatesRegressionequationCorrelationcoefficientμg/mL124PBS40y=1.4821x+5.63260.97780.3743125PFL51y=1.9495x+5.82630.92330.3768126PZX50y=1.9068x+5.79400.96540.3834127PMG8y=2.0762x+5.85730.94930.3864128PFL53y=2.2211x+5.89870.9360.3939129PXY6y=2.1215x+5.79110.93990.4237130PYC15y=1.5780x+5.57090.96070.4347131PLJ16y=1.8742x+5.66680.98070.4408132PFL13y=1.5266x+5.53610.95120.4455133PXH46y=1.3325x+5.46460.94680.4481134PDJY3y=1.5560x+5.53650.91710.4521135PXY23y=2.3030x+5.78330.96870.457136PFL70y=1.1918x+5.39790.92480.4636137PXY15y=2.2009x+5.70320.95630.4792138PFL42y=1.6247x+5.51140.92050.4844139PFL82y=0.4985x+5.15670.9460.4849140PPX1y=2.1677x+5.67940.96090.4859141PXH4y=1.4258x+5.43710.96730.4937142PFL44y=1.6000x+5.46750.95580.5103143PXH36y=1.7928x+5.50310.96250.5241144PXH7y=1.3134x+5.33770.94110.5532145PFL31y=1.8319x+5.46740.93730.5557146PLJ6y=2.0275x+5.50630.97170.5627147PLJ25y=2.0240x+5.47610.93100.5818148PXH20y=1.3900x+5.32020.93690.5884149PXH38y=1.7445x+5.38760.98660.5995150PWL25y=0.5790x+5.12860.95730.599661 西南大学硕士学位论文PBS4PDJY3PFL1PFL4PSYC59PXH1PYA16PYC15CKW6W5W4W3W2W1附图1.稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性测定Figure1.Sensitivitybioassayof8isolatesofMagnaporthegriseatotebuconazole注：以上菌株均为野生型菌株；CK：不含戊唑醇的PDA平板；W6-W1:浓度分别为0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL。Note:TherewereisolatesofMagnaporthegriseacollectedfromfield.CK:platehaven’ttebuconazole;W6-W1:tebuconazole,inorder:0.0625μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL.62 附录附图2.稻瘟病菌对戊唑醇的MIC值测定Figure2.MinimuminhibitoryconcentrationofMagnaporthegriseatotebuconazole注：A：对照；B~F：戊唑醇浓度依次为：2.5μg/mL；3μg/mL；3.5μg/mL；4μg/mL；4.5μg/mLNote:A：CK；B~F：tebuconazole,inorder:2.5μg/mL；3μg/mL；3.5μg/mL；4μg/mL；4.5μg/mLPXH8PFL19CKW6W5W4W3W2W1附图3.抗药性监测获得的田间抗稻瘟灵菌株PFL19和PXH8（照片）Figure3.PFL19andPXH8,tebuconazole-resistantisolatesofMagnaporthegriseafromthefield注：以上菌株均为野生型菌株；CK：不含戊唑醇的PDA平板；W6-W1:浓度分别为0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL。Note:TherewereisolatesofMagnaporthegriseacollectedfromfield.CK:platehaven’ttebuconazole;W6-W1:tebuconazole,inorder:0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL.63 西南大学硕士学位论文cyp51-1-PMY30ATGGGCCTTCTACAGGACACCACCGGCCCGCTGGTAGATGCCTTCTACCAGCTGGGCACTGGGGCGCAGGTTGGTGTTGCATGGGCCTTCTACAGGACACCACCGGCCCGCTGGTAGATGCCTTCTACCAGCTGGGCACTGGGGCGCAGGTTGGTGTTGC80cyp51-1-PMY30-1ATGGGCCTTCTACAGGACACCACCGGCCCGCTGGTAGATGCCTTCTACCAGCTGGGCACTGGGGCGCGGGTTGGTGTTGCATGGGCCTTCTACAGGACACCACCGGCCCGCTGGTAGATGCCTTCTACCAGCTGGGCACTGGGGCGCGGTTGGTGTTGC80cyp51-1-PWS2ATGGGCCTTCTACAGGACACCACCGGCCCGCTGGTAGATGCCTTCTACCAGCTGGGCACTGGGGCGCAGGTTGGTGTTGCATGGGCCTTCTACAGGACACCACCGGCCCGCTGGTAGATGCCTTCTACCAGCTGGGCACTGGGGCGCAGGTTGGTGTTGC80cyp51-1-PWS2-1ATGGGCCTTCTACAGGACACCACCGGCCCGCTGGTAGATGCCTTCTACCAGCTGGGCACTGGGGCGCAGGTTGGTGTTGCATGGGCCTTCTACAGGACACCACCGGCCCGCTGGTAGATGCCTTCTACCAGCTGGGCACTGGGGCGCAGGTTGGTGTTGC80Consensusatgggccttctacaggacaccaccggcccgctggtagatgccttctaccagctgggcactggggcgcggttggtgttgccyp51-1-PMY30CTTCGTCAGCTTCATCTTCCTCTCGGTCTTTTTCCACGTAGCGCAGCAGATCTTCTTCAAGAACCCCCATGAGCCGCCCGCTTCGTCAGCTTCATCTTCCTCTCGGTCTTTTTCCACGTAGCGCAGCAGATCTTCTTCAAGAACCCCCATGAGCCGCCCG160cyp51-1-PMY30-1CTTCGTCAGCTTCATCTTCCTCTCGGTCTTTTTCCACGTAGCGCAGCAGATCTTCTTCAAGAACCCCCATGAGCCGCCCGCTTCGTCAGCTTCATCTTCCTCTCGGTCTTTTTCCACGTAGCGCAGCAGATCTTCTTCAAGAACCCCCATGAGCCGCCCG160cyp51-1-PWS2CTTCGTCAGCTTCATCTTCCTCTCGGTCTTTTTCCACGTAGCGCAGCAGATCTTCTTCAAGAACCCCCATGAGCCGCCCGCTTCGTCAGCTTCATCTTCCTCTCGGTCTTTTTCCACGTAGCGCAGCAGATCTTCTTCAAGAACCCCCATGAGCCGCCCG160cyp51-1-PWS2-1CTTCGTCAGCTTCATCTTCCTCTCGGTCTTTTTCCACGTAGCGCAGCAGATCTTCTTCAAGAACCCCCATGAGCCGCCCGCTTCGTCAGCTTCATCTTCCTCTCGGTCTTTTTCCACGTAGCGCAGCAGATCTTCTTCAAGAACCCCCATGAGCCGCCCG160Consensuscttcgtcagcttcatcttcctctcggtctttttccacgtagcgcagcagatcttcttcaagaacccccatgagccgcccgcyp51-1-PMY30TCGTCTTCAGCTGGTTCCCCGTCGTCGGTTCGACGGTCACGTATGGAAAGGACCCGCCACAGTTCTTCCGGGACATGGCCTCGTCTTCAGCTGGTTCCCCGTCGTCGGTTCGACGGTCACGTATGGAAAGGACCCGCCACAGTTCTTCCGGGACATGGCC240cyp51-1-PMY30-1TCGTCTTCAGCTGGTTCCCCGTCGTCGGTTCGACGGTCACGTATGGAAAGGACCCGCCACAGTTCTTCCGGGACATGGCCTCGTCTTCAGCTGGTTCCCCGTCGTCGGTTCGACGGTCACGTATGGAAAGGACCCGCCACAGTTCTTCCGGGACATGGCC240cyp51-1-PWS2TCGTCTTCAGCTGGTTCCCCGTCGTCGGTTCGACGGTCACGTATGGAAAGGACCCGCCACAGTTCTTCCGGGACATGGCCTCGTCTTCAGCTGGTTCCCCGTCGTCGGTTCGACGGTCACGTATGGAAAGGACCCGCCACAGTTCTTCCGGGACATGGCC240cyp51-1-PWS2-1TCGTCTTCAGCTGGTTCCCCGTCGTCGGTTCGACGGTCACGTATGGAAAGGACCCGCCACAGTTCTTCCGGGACATGGCCTCGTCTTCAGCTGGTTCCCCGTCGTCGGTTCGACGGTCACGTATGGAAAGGACCCGCCACAGTTCTTCCGGGACATGGCC240Consensustcgtcttcagctggttccccgtcgtcggttcgacggtcacgtatggaaaggacccgccacagttcttccgggacatggcccyp51-1-PMY30AAGAAGGTTAGTTGAACACTCTACCTGCTGGTTGGTTTCTTTTTTGCTCCGCATGAGCACCAAGGACAGCTTTGCTGGGCAAGAAGGTTAGTTGAACACTCTACCTGCTGGTTGGTTTCTTTTTTGCTCCGCATGAGCACCAAGGACAGCTTTGCTGGGC320cyp51-1-PMY30-1AAGAAGGTTAGTTGAACACTCTACCTGCTGGTTGGTTTCTTTTTTGCTCCGCATGAGCACCAAGGACAGCTTTGCTGGGCAAGAAGGTTAGTTGAACACTCTACCTGCTGGTTGGTTTCTTTTTTGCTCCGCATGAGCACCAAGGACAGCTTTGCTGGGC320cyp51-1-PWS2AAGAAGGTTAGTTGAACACTCTACCTGCTGGTTGGTTTCTTTTTTGCTCCGCATGAGCACCAAGGACAGCTTTGCTGGGCAAGAAGGTTAGTTGAACACTCTACCTGCTGGTTGGTTTCTTTTTTGCTCCGCATGAGCACCAAGGACAGCTTTGCTGGGC320cyp51-1-PWS2-1AAGAAGGTTAGTTGAACACTCTACCTGCTGGTTGGTTTCTTTTTTGCTCCGCATGAGCACCAAGGACAGCTTTGCTGGGCAAGAAGGTTAGTTGAACACTCTACCTGCTGGTTGGTTTCTTTTTTGCTCCGCATGAGCACCAAGGACAGCTTTGCTGGGC320Consensusaagaaggttagttgaacactctacctgctggttggtttcttttttgctccgcatgagcaccaaggacagctttgctgggccyp51-1-PMY30ATGCATATACAATACATGTATCCCGGGACTAACGAATACGCTTCAAAATCTACAGTACGGCAACATCTTTACCTTCATTCATGCATATACAATACATGTATCCCGGGACTAACGAATACGCTTCAAAATCTACAGTACGGCAACATCTTTACCTTCATTC400cyp51-1-PMY30-1ATGCATATACAATACATGTATCCCGGGACTAACGAATACGCTTCAAAATCTACAGTACGGCAACATCTTTACCTTCATTCATGCATATACAATACATGTATCCCGGGACTAACGAATACGCTTCAAAATCTACAGTACGGCAACATCTTTACCTTCATTC400cyp51-1-PWS2ATGCATATACAATACATGTATCCCGGGACTAACGAATACGCTTCAAAATCTACAGTACGGCAACATCTTTACCTTCATTCATGCATATACAATACATGTATCCCGGGACTAACGAATACGCTTCAAAATCTACAGTACGGCAACATCTTTACCTTCATTC400cyp51-1-PWS2-1ATGCATATACAATACATGTATCCCGGGACTAACGAATACGCTTCAAAATCTACAGTACGGCAACATCTTTACCTTCATTCATGCATATACAATACATGTATCCCGGGACTAACGAATACGCTTCAAAATCTACAGTACGGCAACATCTTTACCTTCATTC400Consensusatgcatatacaatacatgtatcccgggactaacgaatacgcttcaaaatctacagtacggcaacatctttaccttcattccyp51-1-PMY30TCCTCGGAAAGAAGACAACCGTCTACATCGGCACCGAAGGCAACGAGTTCATCCTCAACGGCAAGCTGCGCGATGTCAATTCCTCGGAAAGAAGACAACCGTCTACATCGGCACCGAAGGCAACGAGTTCATCCTCAACGGCAAGCTGCGCGATGTCAAT480cyp51-1-PMY30-1TCCTCGGAAAGAAGACAACCGTCTACATCGGCACCGAAGGCAACGAGTTCATCCTCAACGGCAAGCTGCGCGATGTCAATTCCTCGGAAAGAAGACAACCGTCTACATCGGCACCGAAGGCAACGAGTTCATCCTCAACGGCAAGCTGCGCGATGTCAAT480cyp51-1-PWS2TCCTCGGAAAGAAGACAACCGTCTACATCGGCACCGAAGGCAACGAGTTCATCCTCAACGGCAAGCTGCGCGATGTCAATTCCTCGGAAAGAAGACAACCGTCTACATCGGCACCGAAGGCAACGAGTTCATCCTCAACGGCAAGCTGCGCGATGTCAAT480cyp51-1-PWS2-1TCCTCGGAAAGAAGACAACCGTCTACATCGGCACCGAAGGCAACGAGTTCATCCTCAACGGCAAGCTGCGCGATGTCAATTCCTCGGAAAGAAGACAACCGTCTACATCGGCACCGAAGGCAACGAGTTCATCCTCAACGGCAAGCTGCGCGATGTCAAT480Consensustcctcggaaagaagacaaccgtctacatcggcaccgaaggcaacgagttcatcctcaacggcaagctgcgcgatgtcaatcyp51-1-PMY30GCAGAGGAGATCTACGGACCCATGACCACTCCCGTGTTCGGCAAGGACGTCGTCTATGACTGCCCCAACGCCAAGCTGATGCAGAGGAGATCTACGGACCCATGACCACTCCCGTGTTCGGCAAGGACGTCGTCTATGACTGCCCCAACGCCAAGCTGAT560cyp51-1-PMY30-1GCAGAGGAGATCTACGGACCCATGACCACTCCCGTGTTCGGCAAGGACGTCGTCTATGACTGCCCCAACGCCAAGCTGATGCAGAGGAGATCTACGGACCCATGACCACTCCCGTGTTCGGCAAGGACGTCGTCTATGACTGCCCCAACGCCAAGCTGAT560cyp51-1-PWS2GCAGAGGAGATCTACGGACCCATGACCACTCCCGTGTTCGGCAAGGACGTCGTCTATGACTGCCCCAACGCCAAGCTGATGCAGAGGAGATCTACGGACCCATGACCACTCCCGTGTTCGGCAAGGACGTCGTCTATGACTGCCCCAACGCCAAGCTGAT560cyp51-1-PWS2-1GCAGAGGAGATCTACGGACCCATGACCACTCCCGTGTTCGGCAAGGACGTCGTCTATGACTGCCCCAACGCCAAGCTGATGCAGAGGAGATCTACGGACCCATGACCACTCCCGTGTTCGGCAAGGACGTCGTCTATGACTGCCCCAACGCCAAGCTGAT560Consensusgcagaggagatctacggacccatgaccactcccgtgttcggcaaggacgtcgtctatgactgccccaacgccaagctgatcyp51-1-PMY30GGAGCAAAAGAAGTTTATGAAGATCGCCCTCACCACCGAGGCCTTCCGTTCTTACGTTCCTATCATTGCCGACGAGGTTTGGAGCAAAAGAAGTTTATGAAGATCGCCCTCACCACCGAGGCCTTCCGTTCTTACGTTCCTATCATTGCCGACGAGGTTT640cyp51-1-PMY30-1GGAGCAAAAGAAGTTTATGAAGATCGCCCTCACCACCGAGGCCTTCCGTTCTTACGTTCCTATCATTGCCGACGAGGTTTGGAGCAAAAGAAGTTTATGAAGATCGCCCTCACCACCGAGGCCTTCCGTTCTTACGTTCCTATCATTGCCGACGAGGTTT640cyp51-1-PWS2GGAGCAAAAGAAGTTTATGAAGATCGCCCTCACCACCGAGGCCTTCCGTTCTTACGTTCCTATCATTGCCGACGAGGTTTGGAGCAAAAGAAGTTTATGAAGATCGCCCTCACCACCGAGGCCTTCCGTTCTTACGTTCCTATCATTGCCGACGAGGTTT640cyp51-1-PWS2-1GGAGCAAAAGAAGTTTATGAAGATCGCCCTCACCACCGAGGCCTTCCGTTCTTACGTTCCTATCATTGCCGACGAGGTTTGGAGCAAAAGAAGTTTATGAAGATCGCCCTCACCACCGAGGCCTTCCGTTCTTACGTTCCTATCATTGCCGACGAGGTTT640Consensusggagcaaaagaagtttatgaagatcgccctcaccaccgaggccttccgttcttacgttcctatcattgccgacgaggtttcyp51-1-PMY30CGAGCTACCTGAAGCGGACCCCCGCCTTCAAGGGCCCGTCGGGCGTCGTCAACATCCCGCCCAAGATGGCCGAGATTACCCGAGCTACCTGAAGCGGACCCCCGCCTTCAAGGGCCCGTCGGGCGTCGTCAACATCCCGCCCAAGATGGCCGAGATTACC720cyp51-1-PMY30-1CGAGCTACCTGAAGCGGACCCCCGCCTTCAAGGGCCCGTCGGGCGTCGTCAACATCCCGCCCAAGATGGCCGAGATTACCCGAGCTACCTGAAGCGGACCCCCGCCTTCAAGGGCCCGTCGGGCGTCGTCAACATCCCGCCCAAGATGGCCGAGATTACC720cyp51-1-PWS2CGAGCTACCTGAAGCGGACCCCCGCCTTCAAGGGCCCGTCGGGCGTCGTCAACATCCCGCCCAAGATGGCCGAGATTACCCGAGCTACCTGAAGCGGACCCCCGCCTTCAAGGGCCCGTCGGGCGTCGTCAACATCCCGCCCAAGATGGCCGAGATTACC720cyp51-1-PWS2-1CGAGCTACCTGAAGCGGACCCCCGCCTTCAAGGGCCCGTCGGGCGTCGTCAACATCCCGCCCAAGATGGCCGAGATTACCCGAGCTACCTGAAGCGGACCCCCGCCTTCAAGGGCCCGTCGGGCGTCGTCAACATCCCGCCCAAGATGGCCGAGATTACC720Consensuscgagctacctgaagcggacccccgccttcaagggcccgtcgggcgtcgtcaacatcccgcccaagatggccgagattacccyp51-1-PMY30ATCTTCACCGCCTCGCACGCCCTCCAGGGTAAGGAGATCCGCGACCAGTTCGACGAGACCCTGGCCGATTTGTACCACGAATCTTCACCGCCTCGCACGCCCTCCAGGGTAAGGAGATCCGCGACCAGTTCGACGAGACCCTGGCCGATTTGTACCACGA800cyp51-1-PMY30-1ATCTTCACCGCCTCGCACGCCCTCCAGGGTAAGGAGATCCGCGACCAGTTCGACGAGACCCTGGCCGATTTGTACCACGAATCTTCACCGCCTCGCACGCCCTCCAGGGTAAGGAGATCCGCGACCAGTTCGACGAGACCCTGGCCGATTTGTACCACGA800cyp51-1-PWS2ATCTTCACCGCCTCGCACGCCCTCCAGGGTAAGGAGATCCGCGACCAGTTCGACGAGACCCTGGCCGATTTGTACCACGAATCTTCACCGCCTCGCACGCCCTCCAGGGTAAGGAGATCCGCGACCAGTTCGACGAGACCCTGGCCGATTTGTACCACGA800cyp51-1-PWS2-1ATCTTCACCGCCTCGCACGCCCTCCAGGGTAAGGAGATCCGCGACCAGTTCGACGAGACCCTGGCCGATTTGTACCACGAATCTTCACCGCCTCGCACGCCCTCCAGGGTAAGGAGATCCGCGACCAGTTCGACGAGACCCTGGCCGATTTGTACCACGA800Consensusatcttcaccgcctcgcacgccctccagggtaaggagatccgcgaccagttcgacgagaccctggccgatttgtaccacgacyp51-1-PMY30CCTCGACATGGGCTTCCACCCGGTCAACTTCAAGCTTCACTGGCTACCCCTCCCCCGCAACATCCGCCGCGACAAGGCACCCTCGACATGGGCTTCCACCCGGTCAACTTCAAGCTTCACTGGCTACCCCTCCCCCGCAACATCCGCCGCGACAAGGCAC880cyp51-1-PMY30-1CCTCGACATGGGCTTCCACCCGGTCAACTTCAAGCTTCACTGGCTACCCCTCCCCCGCAACATCCGCCGCGACAAGGCACCCTCGACATGGGCTTCCACCCGGTCAACTTCAAGCTTCACTGGCTACCCCTCCCCCGCAACATCCGCCGCGACAAGGCAC880cyp51-1-PWS2CCTCGACATGGGCTTCCACCCGGTCAACTTCAAGCTTCACTGGCTACCCCTCCCCCGCAACATCCGCCGCGACAAGGCACCCTCGACATGGGCTTCCACCCGGTCAACTTCAAGCTTCACTGGCTACCCCTCCCCCGCAACATCCGCCGCGACAAGGCAC880cyp51-1-PWS2-1CCTCGACATGGGCTTCCACCCGGTCAACTTCAAGCTTCACTGGCTACCCCTCCCCCGCAACATCCGCCGCGACAAGGCACCCTCGACATGGGCTTCCACCCGGTCAACTTCAAGCTTCACTGGCTACCCCTCCCCCGCAACATCCGCCGCGACAAGGCAC880Consensuscctcgacatgggcttccacccggtcaacttcaagcttcactggctacccctcccccgcaacatccgccgcgacaaggcac64 附录cyp51-1-PMY30AAAAGACCATCGCCAAGATCTACATGGACACCATCCAGCGCCGCCGTGCGAAGGGTAAGGACTCCGAGGCCAAGGATATGAAAAGACCATCGCCAAGATCTACATGGACACCATCCAGCGCCGCCGTGCGAAGGGTAAGGACTCCGAGGCCAAGGATATG960cyp51-1-PMY30-1AAAAGACCATCGCCAAGATCTACATGGACACCATCCAGCGCCGCCGTGCGAAGGGTAAGGACTCCGAGGCCAAGGATATGAAAAGACCATCGCCAAGATCTACATGGACACCATCCAGCGCCGCCGTGCGAAGGGTAAGGACTCCGAGGCCAAGGATATG960cyp51-1-PWS2AAAAGACCATCGCCAAGATCTACATGGACACCATCCAGCGCCGCCGTGCGAAGGGTAAGGACTCCGAGGCCAAGGATATGAAAAGACCATCGCCAAGATCTACATGGACACCATCCAGCGCCGCCGTGCGAAGGGTAAGGACTCCGAGGCCAAGGATATG960cyp51-1-PWS2-1AAAAGACCATCGCCAAGATCTACATGGACACCATCCAGCGCCGCCGTGCGAAGGGTAAGGACTCCGAGGCCAAGGATATGAAAAGACCATCGCCAAGATCTACATGGACACCATCCAGCGCCGCCGTGCGAAGGGTAAGGACTCCGAGGCCAAGGATATG960Consensusaaaagaccatcgccaagatctacatggacaccatccagcgccgccgtgcgaagggtaaggactccgaggccaaggatatgcyp51-1-PMY30ATGTACCACCTTATGAACTCGACCTACAAAAATGGCACCCCCGTCCCTGACCACGAGATCGCCCACATGATGATCGCTCTATGTACCACCTTATGAACTCGACCTACAAAAATGGCACCCCCGTCCCTGACCACGAGATCGCCCACATGATGATCGCTCT1040cyp51-1-PMY30-1ATGTACCACCTTATGAACTCGACCTACAAAAATGGCACCCCCGTCCCTGACCACGAGATCGCCCACATGATGATCGCTCTATGTACCACCTTATGAACTCGACCTACAAAAATGGCACCCCCGTCCCTGACCACGAGATCGCCCACATGATGATCGCTCT1040cyp51-1-PWS2ATGTACCACCTTATGAACTCGACCTACAAAAATGGCACCCCCGTCCCTGACCACGAGATCGCCCACATGATGATCGCTCTATGTACCACCTTATGAACTCGACCTACAAAAATGGCACCCCCGTCCCTGACCACGAGATCGCCCACATGATGATCGCTCT1040cyp51-1-PWS2-1ATGTACCACCTTATGAACTCGACCTACAAAAATGGCACCCCCGTCCCTGACCACGAGATCGCCCACATGATGATCGCTCTATGTACCACCTTATGAACTCGACCTACAAAAATGGCACCCCCGTCCCTGACCACGAGATCGCCCACATGATGATCGCTCT1040Consensusatgtaccaccttatgaactcgacctacaaaaatggcacccccgtccctgaccacgagatcgcccacatgatgatcgctctcyp51-1-PMY30CCTGATGGCCGGACAGCACTCGTCGTCGTCCACCAGCTCCTGGATCATGCTCCGCCTCGCCAGCCGCCCGGATATTATGGCCTGATGGCCGGACAGCACTCGTCGTCGTCCACCAGCTCCTGGATCATGCTCCGCCTCGCCAGCCGCCCGGATATTATGG1120cyp51-1-PMY30-1CCTGATGGCCGGACAGCACTCGTCGTCGTCCACCAGCTCCTGGATCATGCTCCGCCTCGCCAGCCGCCCGGATATTATGGCCTGATGGCCGGACAGCACTCGTCGTCGTCCACCAGCTCCTGGATCATGCTCCGCCTCGCCAGCCGCCCGGATATTATGG1120cyp51-1-PWS2CCTGATGGCCGGACAGCACTCGTCGTCGTCCACCAGCTCCTGGATCATGCTCCGCCTCGCCAGCCGCCCGGATATTATGGCCTGATGGCCGGACAGCACTCGTCGTCGTCCACCAGCTCCTGGATCATGCTCCGCCTCGCCAGCCGCCCGGATATTATGG1120cyp51-1-PWS2-1CCTGATGGCCGGACAGCACTCGTCGTCGTCCACCAGCTCCTGGATCATGCTCCGCCTCGCCAGCCGCCCGGATATTATGGCCTGATGGCCGGACAGCACTCGTCGTCGTCCACCAGCTCCTGGATCATGCTCCGCCTCGCCAGCCGCCCGGATATTATGG1120Consensuscctgatggccggacagcactcgtcgtcgtccaccagctcctggatcatgctccgcctcgccagccgcccggatattatggcyp51-1-PMY30AGGAACTGTACCAGGAGCAGGTCCGCGCGCTGGGTGCCGACTTGCCCCCTCTCCGCTACGAGGACCTCGCCAATCTGCCTAGGAACTGTACCAGGAGCAGGTCCGCGCGCTGGGTGCCGACTTGCCCCCTCTCCGCTACGAGGACCTCGCCAATCTGCCT1200cyp51-1-PMY30-1AGGAACTGTACCAGGAGCAGGTCCGCGCGCTGGGTGCCGACTTGCCCCCTCTCCGCTACGAGGACCTCGCCAATCTGCCTAGGAACTGTACCAGGAGCAGGTCCGCGCGCTGGGTGCCGACTTGCCCCCTCTCCGCTACGAGGACCTCGCCAATCTGCCT1200cyp51-1-PWS2AGGAACTGTACCAGGAGCAGGTCCGCGCGCTGGGTGCCGACTTGCCCCCTCTCCGCTACGAGGACCTCGCCAATCTGCCTAGGAACTGTACCAGGAGCAGGTCCGCGCGCTGGGTGCCGACTTGCCCCCTCTCCGCTACGAGGACCTCGCCAATCTGCCT1200cyp51-1-PWS2-1AGGAACTGTACCAGGAGCAGGTCCGCGCGCTGGGTGCCGACTTGCCCCCTCTCCGCTACGAGGACCTCGCCAATCTGCCTAGGAACTGTACCAGGAGCAGGTCCGCGCGCTGGGTGCCGACTTGCCCCCTCTCCGCTACGAGGACCTCGCCAATCTGCCT1200Consensusaggaactgtaccaggagcaggtccgcgcgctgggtgccgacttgccccctctccgctacgaggacctcgccaatctgcctcyp51-1-PMY30CTCCACCTCGCCGTCATCAAGGAGACTCTCCGCCTCCACGCTCCGATCAACTCCATTCTCCGCGCCGTGAAGCAGGACCTCTCCACCTCGCCGTCATCAAGGAGACTCTCCGCCTCCACGCTCCGATCAACTCCATTCTCCGCGCCGTGAAGCAGGACCT1280cyp51-1-PMY30-1CTCCACCTCGCCGTCATCAAGGAGACTCTCCGCCTCCACGCTCCGATCAACTCCATTCTCCGCGCCGTGAAGCAGGACCTCTCCACCTCGCCGTCATCAAGGAGACTCTCCGCCTCCACGCTCCGATCAACTCCATTCTCCGCGCCGTGAAGCAGGACCT1280cyp51-1-PWS2CTCCACCTCGCCGTCATCAAGGAGACTCTCCGCCTCCACGCTCCGATCAACTCCATTCTCCGCGCCGTGAAGCAGGACCTCTCCACCTCGCCGTCATCAAGGAGACTCTCCGCCTCCACGCTCCGATCAACTCCATTCTCCGCGCCGTGAAGCAGGACCT1280cyp51-1-PWS2-1CTCCACCTCGCCGTCATCAAGGAGACTCTCCGCCTCCACGCTCCGATCAACTCCATTCTCCGCGCCGTGAAGCAGGACCTCTCCACCTCGCCGTCATCAAGGAGACTCTCCGCCTCCACGCTCCGATCAACTCCATTCTCCGCGCCGTGAAGCAGGACCT1280Consensusctccacctcgccgtcatcaaggagactctccgcctccacgctccgatcaactccattctccgcgccgtgaagcaggacctcyp51-1-PMY30CCCCGTTCCGGGTACCAACTACGTCATCGCCAAGGACACCACCGTCCTCGCCGCCCCCGGATACTCGGCCGGTGACCCCACCCCGTTCCGGGTACCAACTACGTCATCGCCAAGGACACCACCGTCCTCGCCGCCCCCGGATACTCGGCCGGTGACCCCA1360cyp51-1-PMY30-1CCCCGTTCCGGGTACCAACTACGTCATCGCCAAGGACACCACCGTCCTCGCCGCCCCCGGATACTCGGCCGGTGACCCCACCCCGTTCCGGGTACCAACTACGTCATCGCCAAGGACACCACCGTCCTCGCCGCCCCCGGATACTCGGCCGGTGACCCCA1360cyp51-1-PWS2CCCCGTTCCGGGTACCAACTACGTCATCGCCAAGGACACCACCGTCCTCGCCGCCCCCGGATACTCGGCCGGTGACCCCACCCCGTTCCGGGTACCAACTACGTCATCGCCAAGGACACCACCGTCCTCGCCGCCCCCGGATACTCGGCCGGTGACCCCA1360cyp51-1-PWS2-1CCCCGTTCCGGGTACCAACTACGTCATCGCCAAGGACACCACCGTCCTCGCCGCCCCCGGATACTCGGCCGGTGACCCCACCCCGTTCCGGGTACCAACTACGTCATCGCCAAGGACACCACCGTCCTCGCCGCCCCCGGATACTCGGCCGGTGACCCCA1360Consensusccccgttccgggtaccaactacgtcatcgccaaggacaccaccgtcctcgccgcccccggatactcggccggtgaccccacyp51-1-PMY30ACCACTTCCCTGAGCCGGAACTTTGGGAGCCGCACCGTTGGGAGGCCGACTCGCGCCTGGCTCCACGCATCTCGATGAGCACCACTTCCCTGAGCCGGAACTTTGGGAGCCGCACCGTTGGGAGGCCGACTCGCGCCTGGCTCCACGCATCTCGATGAGC1440cyp51-1-PMY30-1ACCACTTCCCTGAGCC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西南大学硕士学位论文cyp51-2-PMY30CTACGCAGTCTTCGGGCTGCGTCGCTCCCACCTCACCGTCGCAGGCTGCATAGGCCGAGAGAACATAGAAGTGTAATCAGCTACGCAGTCTTCGGGCTGCGTCGCTCCCACCTCACCGTCGCAGGCTGCATAGGCCGAGAGAACATAGAAGTGTAATCAG80cyp51-2-PMY30-1CTACGCAGTCTTCGGGCTGCGTCGCTCCCACCTCACCGTCGCAGGCTGCATAGGCCGAGAGAACATAGAAGTGTAATCAGCTACGCAGTCTTCGGGCTGCGTCGCTCCCACCTCACCGTCGCAGGCTGCATAGGCCGAGAGAACATAGAAGTGTAATCAG80cyp51-2-PWS2CTACGCAGTCTTCGGGCTGCGTCGCTCCCACCTCACCGTCGCAGGCTGCATAGGCCGAGAGAACATAGAAGTGTAATCAGCTACGCAGTCTTCGGGCTGCGTCGCTCCCACCTCACCGTCGCAGGCTGCATAGGCCGAGAGAACATAGAAGTGTAATCAG80cyp51-2-PWS2-1CTACGCAGTCTTCGGGCTGCGTCGCTCCCACCTCACCGTCGCAGGCTGCATAGGCCGAGAGAACATAGAAGTGTAATCAGCTACGCAGTCTTCGGGCTGCGTCGCTCCCACCTCACCGTCGCAGGCTGCATAGGCCGAGAGAACATAGAAGTGTAATCAG80Consensusctacgcagtcttcgggctgcgtcgctcccacctcaccgtcgcaggctgcataggccgagagaacatagaagtgtaatcagcyp51-2-PMY30TGGGCGGCACGGTGGCCTTGCCATCCAGCGTGGAGAACTTGAAGTTCCGGACCAAGGTGCTGACGATGGCCGCCAGGTTGTGGGCGGCACGGTGGCCTTGCCATCCAGCGTGGAGAACTTGAAGTTCCGGACCAAGGTGCTGACGATGGCCGCCAGGTTG160cyp51-2-PMY30-1TGGGCGGCACGGTGGCCTTGCCATCCAGCGTGGAGAACTTGAAGTTCCGGACCAAGGTGCTGACGATGGCCGCCAGGTTGTGGGCGGCACGGTGGCCTTGCCATCCAGCGTGGAGAACTTGAAGTTCCGGACCAAGGTGCTGACGATGGCCGCCAGGTTG160cyp51-2-PWS2TGGGCGGCACGGTGGCCTTGCCATCCAGCGTGGAGAACTTGAAGTTCCGGACCAAGGTGCTGACGATGGCCGCCAGGTTGTGGGCGGCACGGTGGCCTTGCCATCCAGCGTGGAGAACTTGAAGTTCCGGACCAAGGTGCTGACGATGGCCGCCAGGTTG160cyp51-2-PWS2-1TGGGCGGCACGGTGGCCTTGCCATCCAGCGTGGAGAACTTGAAGTTCCGGACCAAGGTGCTGACGATGGCCGCCAGGTTGTGGGCGGCACGGTGGCCTTGCCATCCAGCGTGGAGAACTTGAAGTTCCGGACCAAGGTGCTGACGATGGCCGCCAGGTTG160Consensustgggcggcacggtggccttgccatccagcgtggagaacttgaagttccggaccaaggtgctgacgatggccgccaggttgcyp51-2-PMY30AGATAGGCAAACTTTTCACCGATGCAGCGATGCCGACCGGCGCCAAAGGGCAGGTAAGGACTCTTGGTGCCCTTGGACGTAGATAGGCAAACTTTTCACCGATGCAGCGATGCCGACCGGCGCCAAAGGGCAGGTAAGGACTCTTGGTGCCCTTGGACGT240cyp51-2-PMY30-1AGATAGGCAAACTTTTCACCGATGCAGCGATGCCGACCGGCGCCAAAGGGCAGGTAAGGACTCTTGGTGCCCTTGGACGTAGATAGGCAAACTTTTCACCGATGCAGCGATGCCGACCGGCGCCAAAGGGCAGGTAAGGACTCTTGGTGCCCTTGGACGT240cyp51-2-PWS2AGATAGGCAAACTTTTCACCGATGCAGCGATGCCGACCGGCGCCAAAGGGCAGGTAAGGACTCTTGGTGCCCTTGGACGTAGATAGGCAAACTTTTCACCGATGCAGCGATGCCGACCGGCGCCAAAGGGCAGGTAAGGACTCTTGGTGCCCTTGGACGT240cyp51-2-PWS2-1AGATAGGCAAACTTTTCACCGATGCAGCGATGCCGACCGGCGCCAAAGGGCAGGTAAGGACTCTTGGTGCCCTTGGACGTAGATAGGCAAACTTTTCACCGATGCAGCGATGCCGACCGGCGCCAAAGGGCAGGTAAGGACTCTTGGTGCCCTTGGACGT240Consensusagataggcaaacttttcaccgatgcagcgatgccgaccggcgccaaagggcaggtaaggactcttggtgcccttggacgtcyp51-2-PMY30GGCCCCGTAGCCGTAATCGACAATCTCGTCGTCCTGGGCGTCGACGGCGTCATCCCACCGATGCGGCTCCCAAGCCCGCGGGCCCCGTAGCCGTAATCGACAATCTCGTCGTCCTGGGCGTCGACGGCGTCATCCCACCGATGCGGCTCCCAAGCCCGCG320cyp51-2-PMY30-1GGCCCCGTAGCCGTAATCGACAATCTCGTCGTCCTGGGCGTCGACGGCGTCATCCCACCGATGCGGCTCCCAAGCCCGCGGGCCCCGTAGCCGTAATCGACAATCTCGTCGTCCTGGGCGTCGACGGCGTCATCCCACCGATGCGGCTCCCAAGCCCGCG320cyp51-2-PWS2GGCCCCGTAGCCGTAATCGACAATCTCGTCGTCCTGGGCGTCGACGGCGTCATCCCACCGATGCGGCTCCCAAGCCCGCGGGCCCCGTAGCCGTAATCGACAATCTCGTCGTCCTGGGCGTCGACGGCGTCATCCCACCGATGCGGCTCCCAAGCCCGCG320cyp51-2-PWS2-1GGCCCCGTAGCCGTAATCGACAATCTCGTCGTCCTGGGCGTCGACGGCGTCATCCCACCGATGCGGCTCCCAAGCCCGCGGGCCCCGTAGCCGTAATCGACAATCTCGTCGTCCTGGGCGTCGACGGCGTCATCCCACCGATGCGGCTCCCAAGCCCGCG320Consensusggccccgtagccgtaatcgacaatctcgtcgtcctgggcgtcgacggcgtcatcccaccgatgcggctcccaagcccgcgcyp51-2-PMY30CGTCGCGGAAGTGCTCCTCGTCCAGGTGCGTCATGATGGGCGCGGACACGAGCACCTTGCCCGGGGTGACGACGTAGTCGCGTCGCGGAAGTGCTCCTCGTCCAGGTGCGTCATGATGGGCGCGGACACGAGCACCTTGCCCGGGGTGACGACGTAGTCG400cyp51-2-PMY30-1CGTCGCGGAAGTGCTCCTCGTCCAGGTGCGTCATGATGGGCGCGGACACGAGCACCTTGCCCGGGGTGACGACGTAGTCGCGTCGCGGAAGTGCTCCTCGTCCAGGTGCGTCATGATGGGCGCGGACACGAGCACCTTGCCCGGGGTGACGACGTAGTCG400cyp51-2-PWS2CGTCGCGGAAGTGCTCCTCGTCCAGGTGCGTCATGATGGGCGCGGACACGAGCACCTTGCCCGGGGTGACGACGTAGTCGCGTCGCGGAAGTGCTCCTCGTCCAGGTGCGTCATGATGGGCGCGGACACGAGCACCTTGCCCGGGGTGACGACGTAGTCG400cyp51-2-PWS2-1CGTCGCGGAAGTGCTCCTCGTCCAGGTGCGTCATGATGGGCGCGGACACGAGCACCTTGCCCGGGGTGACGACGTAGTCGCGTCGCGGAAGTGCTCCTCGTCCAGGTGCGTCATGATGGGCGCGGACACGAGCACCTTGCCCGGGGTGACGACGTAGTCG400Consensuscgtcgcggaagtgctcctcgtccaggtgcgtcatgatgggcgcggacacgagcaccttgcccggggtgacgacgtagtcgcyp51-2-PMY30CTGCCCGGAATCCGCATCGGCCGCTTCACCTTGCGCATGATGGAGTGGATGGACGAGTGCACCCGCAGCGTCTCCTTGACCTGCCCGGAATCCGCATCGGCCGCTTCACCTTGCGCATGATGGAGTGGATGGACGAGTGCACCCGCAGCGTCTCCTTGAC480cyp51-2-PMY30-1CTGCCCGGAATCCGCATCGGCCGCTTCACCTTGCGCATGATGGAGTGGATGGACGAGTGCACCCGCAGCGTCTCCTTGACCTGCCCGGAATCCGCATCGGCCGCTTCACCTTGCGCATGATGGAGTGGATGGACGAGTGCACCCGCAGCGTCTCCTTGAC480cyp51-2-PWS2CTGCCCGGAATCCGCATCGGCCGCTTCACCTTGCGCATGATGGAGTGGATGGACGAGTGCACCCGCAGCGTCTCCTTGACCTGCCCGGAATCCGCATCGGCCGCTTCACCTTGCGCATGATGGAGTGGATGGACGAGTGCACCCGCAGCGTCTCCTTGAC480cyp51-2-PWS2-1CTGCCCGGAATCCGCATCGGCCGCTTCACCTTGCGCATGATGGAGTGGATGGACGAGTGCACCCGCAGCGTCTCCTTGACCTGCCCGGAATCCGCATCGGCCGCTTCACCTTGCGCATGATGGAGTGGATGGACGAGTGCACCCGCAGCGTCTCCTTGAC480Consensusctgcccggaatccgcatcggccgcttcaccttgcgcatgatggagtggatggacgagtgcacccgcagcgtctccttgaccyp51-2-PMY30CACGTTTGCGAGCAGCGGCAGCTTGTCGAGGTCCGAGTGCTGCAGGGATGCGTGCCCGAGCCGCTGCACTTCTTGGTACACACGTTTGCGAGCAGCGGCAGCTTGTCGAGGTCCGAGTGCTGCAGGGATGCGTGCCCGAGCCGCTGCACTTCTTGGTACA560cyp51-2-PMY30-1CACGTTTGCGAGCAGCGGCAGCTTGTCGAGGTC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附录cyp51-2-PMY30AGTTGATGGGGCGGAAACCCAGGTCCAAGTCGTGATAGAGTCGTGCGAATTCTCCAGTCAGCTTCTTCCTGACCTCGGGGAGTTGATGGGGCGGAAACCCAGGTCCAAGTCGTGATAGAGTCGTGCGAATTCTCCAGTCAGCTTCTTCCTGACCTCGGGG959cyp51-2-PMY30-1AGTTGATGGGGCGGAAACCCAGGTCCAAGTCGTGATAGAGTCGTGCGAATTCTCCAGTCAGCTTCTTCCTGACCTCGGGGAGTTGATGGGGCGGAAACCCAGGTCCAAGTCGTGATAGAGTCGTGCGAATTCTCCAGTCAGCTTCTTCCTGACCTCGGGG959cyp51-2-PWS2AGTTGATGGGGCGGAAACCCAGGTCCAAGTCGTGATAGAGTCGTGCGAATTCTCCAGTCAGCTTCTTCCTGACCTCGGGGAGTTGATGGGGCGGAAACCCAGGTCCAAGTCGTGATAGAGTCGTGCGAATTCTCCAGTCAGCTTCTTCCTGACCTCGGGG960cyp51-2-PWS2-1AGTTGATGGGGCGGAAACCCAGGTCCAAGTCGTGATAGAGTCGTGCGAATTCTCCAGTCAGCTTCTTCCTGACCTCGGGGAGTTGATGGGGCGGAAACCCAGGTCCAAGTCGTGATAGAGTCGTGCGAATTCTCCAGTCAGCTTCTTCCTGACCTCGGGG960Consensusagttgatggggcggaaacccaggtccaagtcgtgatagagtcgtgcgaattctccagtcagcttcttcctgacctcggggcyp51-2-PMY30CCTTGCAAGGTACGACTGGCTGTGAAAATGGTTATCTCGGCCATCATGCTGGGAATGTCTACGATACCGTGGTTGTCGGCCCTTGCAAGGTACGACTGGCTGTGAAAATGGTTATCTCGGCCATCATGCTGGGAATGTCTACGATACCGTGGTTGCGGC1039cyp51-2-PMY30-1CCTTGCAAGGTACGACTGGCTGTGAAAATGGTTATCTCGGCCATCATGCTGGGAATGTCTACGATACCGTGGTTGTCGGCCCTTGCAAGGTACGACTGGCTGTGAAAATGGTTATCTCGGCCATCATGCTGGGAATGTCTACGATACCGTGGTTGCGGC1039cyp51-2-PWS2CCTTGCAAGGTACGACTGGCTGTGAAAATGGTTATCTCGGCCATCATGCTGGGAATGTCTACGATGCCGTGGTTGCCGGCCCTTGCAAGGTACGACTGGCTGTGAAAATGGTTATCTCGGCCATCATGCTGGGAATGTCTACGATCCGTGGTTGCCGGC1040cyp51-2-PWS2-1CCTTGCAAGGTACGACTGGCTGTGAAAATGGTTATCTCGGCCATCATGCTGGGAATGTCTACGATGCCGTGGTTGCCGGCCCTTGCAAGGTACGACTGGCTGTGAAAATGGTTATCTCGGCCATCATGCTGGGAATGTCTACGATCCGTGGTTGCCGGC1040Consensusccttgcaaggtacgactggctgtgaaaatggttatctcggccatcatgctgggaatgtctacgatccgtggttgcggccyp51-2-PMY30TTGGAAGACGGGTGAGGACTCTATGTAGTCGAGGACCTCCCTCTCGATCAGGGGGACGTAGGAATCCAGAGCCTTTTGCGTTGGAAGACGGGTGAGGACTCTATGTAGTCGAGGACCTCCCTCTCGATCAGGGGGACGTAGGAATCCAGAGCCTTTTGCG1119cyp51-2-PMY30-1TTGGAAGACGGGTGAGGACTCTATGTAGTCGAGGACCTCCCTCTCGATCAGGGGGACGTAGGAATCCAGAGCCTTTTGCGTTGGAAGACGGGTGAGGACTCTATGTAGTCGAGGACCTCCCTCTCGATCAGGGGGACGTAGGAATCCAGAGCCTTTTGCG1119cyp51-2-PWS2TTGGAAGACGGGTGAGGACTCTATGTAGTCGAGGACCTCCCTCTCGATCAGGGGGACGTAGGAATCCAGAGCCTTTTGCGTTGGAAGACGGGTGAGGACTCTATGTAGTCGAGGACCTCCCTCTCGATCAGGGGGACGTAGGAATCCAGAGCCTTTTGCG1120cyp51-2-PWS2-1TTGGAAGACGGGTGAGGACTCTATGTAGTCGAGGACCTCCCTCTCGATCAGGGGGACGTAGGAATCCAGAGCCTTTTGCGTTGGAAGACGGGTGAGGACTCTATGTAGTCGAGGACCTCCCTCTCGATCAGGGGGACGTAGGAATCCAGAGCCTTTTGCG1120Consensusttggaagacgggtgaggactctatgtagtcgaggacctccctctcgatcagggggacgtaggaatccagagccttttgcgcyp51-2-PMY30TCAGGCCAAACTTGACAAACTTCTTTTGCTCCATGAGTTTGGAGTTGGGGCAGTCGTAGATAATATCACTTCCGAAAACTTCAGGCCAAACTTGACAAACTTCTTTTGCTCCATGAGTTTGGAGTTGGGGCAGTCGTAGATAATATCACTTCCGAAAACT1199cyp51-2-PMY30-1TCAGGCCAAACTTGACAAACTTCTTTTGCTCCATGAGTTTGGAGTTGGGGCAGTCGTAGATAATATCACTTCCGAAAACTTCAGGCCAAACTTGACAAACTTCTTTTGCTCCATGAGTTTGGAGTTGGGGCAGTCGTAGATAATATCACTTCCGAAAACT1199cyp51-2-PWS2TCAGGCCAAACTTGACAAACTTCTTTTGCTCCATGAGTTTGGAGTTGGGGCAGTCGTAGATAATATCACTTCCGAAAACTTCAGGCCAAACTTGACAAACTTCTTTTGCTCCATGAGTTTGGAGTTGGGGCAGTCGTAGATAATATCACTTCCGAAAACT1200cyp51-2-PWS2-1TCAGGCCAAACTTGACAAACTTCTTTTGCTCCATGAGTTTGGAGTTGGGGCAGTCGTAGATAATATCACTTCCGAAAACTTCAGGCCAAACTTGACAAACTTCTTTTGCTCCATGAGTTTGGAGTTGGGGCAGTCGTAGATAATATCACTTCCGAAAACT1200Consensustcaggccaaacttgacaaacttcttttgctccatgagtttggagttggggcagtcgtagataatatcacttccgaaaactcyp51-2-PMY30GGTGTGGTGAGAGGGCTGTATATCTCCTCAGCATTGAGGTCCTGCAGCTTGCCGTTCAGGATGAAGTCGTTGCCCTGGACGGTGTGGTGAGAGGGCTGTATATCTCCTCAGCATTGAGGTCCTGCAGCTTGCCGTTCAGGATGAAGTCGTTGCCCTGGAC1279cyp51-2-PMY30-1GGTGTGGTGAGAGGGCTGTATATCTCCTCAGCATTGAGGTCCTGCAGCTTGCCGTTCAGGATGAAGTCGTTGCCCTGGACGGTGTGGTGAGAGGGCTGTATATCTCCTCAGCATTGAGGTCCTGCAGCTTGCCGTTCAGGATGAAGTCGTTGCCCTGGAC1279cyp51-2-PWS2GGTGTGGTGAGAGGGCTGTATATCTCCTCAGCATTGAGGTCCTGCAGCTTGCCGTTCAGGATGAAGTCGTTGCCCTGGACGGTGTGGTGAGAGGGCTGTATATCTCCTCAGCATTGAGGTCCTGCAGCTTGCCGTTCAGGATGAAGTCGTTGCCCTGGAC1280cyp51-2-PWS2-1GGTGTGGTGAGAGGGCTGTATATCTCCTCAGCATTGAGGTCCTGCAGCTTGCCGTTCAGGATGAAGTCGTTGCCCTGGACGGTGTGGTGAGAGGGCTGTATATCTCCTCAGCATTGAGGTCCTGCAGCTTGCCGTTCAGGATGAAGTCGTTGCCCTGGAC1280Consensusggtgtggtgagagggctgtatatctcctcagcattgaggtcctgcagcttgccgttcaggatgaagtcgttgccctggaccyp51-2-PMY30GCCTAAGAAGACGGTCATGCGCCTGCCGAACAAGACAAACGTAAAGACATCGCCGTGCTTTTCCCGGCATTGAGAGTAGAGCCTAAGAAGACGGTCATGCGCCTGCCGAACAAGACAAACGTAAAGACATCGCCGTGCTTTTCCCGGCATTGAGAGTAGA1359cyp51-2-PMY30-1GCCTAAGAAGACGGTCATGCGCCTGCCGAACAAGACAAACGTAAAGACATCGCCGTGCTTTTCCCGGCATTGAGAGTAGAGCCTAAGAAGACGGTCATGCGCCTGCCGAACAAGACAAACGTAAAGACATCGCCGTGCTTTTCCCGGCATTGAGAGTAGA1359cyp51-2-PWS2GCCTAAGAAGACGGTCATGCGCCTGCCGAACAAGACAAACGTAAAGACATCGCCGTGCTTTTCCCGGCATTGAGAGTAGAGCCTAAGAAGACGGTCATGCGCCTGCCGAACAAGACAAACGTAAAGACATCGCCGTGCTTTTCCCGGCATTGAGAGTAGA1360cyp51-2-PWS2-1GCCTAAGAAGACGGTCATGCGCCTGCCGAACAAGACAAACGTAAAGACATCGCCGTGTTTTTCCCGGCATTGAGAGTAGAGCCTAAGAAGACGGTCATGCGCCTGCCGAACAAGACAAACGTAAAGACATCGCCGTGTTTTCCCGGCATTGAGAGTAGA1360Consensusgcctaagaagacggtcatgcgcctgccgaacaagacaaacgtaaagacatcgccgtgttttcccggcattgagagtagacyp51-2-PMY30AGCGGTAGGGGTCCATGCCGTAGGAGACGGCGTTGCCGATGAAGGGCAACCAGTGGAAAACCAGCGGTGGTTCCGATTTGAGCGGTAGGGGTCCATGCCGTAGGAGACGGCGTTGCCGATGAAGGGCAACCAGTGGAAAACCAGCGGTGGTTCCGATTTG1439cyp51-2-PMY30-1AGCGGTAGGGGTCCATGCCGTAGG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西南大学硕士学位论文68 致谢致谢四运的蓝花楹灿烂地绽放着，又到了毕业的时候了，只不过今年我也成为了离别的主角之一。看着周围的景致，听着熟悉的喧哗，情绪不受控制的回想起在学校的岁月。带着母校传递给我的文化底蕴，珍藏着点点滴滴的美好回忆，我将踏上新的旅途。母校的人和事教会我要勇于面对挫折，学会在逆境中成长，在他们的帮助下，我变得更加自信、成熟和坚强，在此毕业之际，向他们致以衷心的感谢！谢谢您们！首先，我要真诚的感谢我的导师毕朝位老师，在研究生的学习期间给了我细心的指导和关怀，无微不至的关心和照顾，在毕业论文的选题、实验设计和开展以及论文撰写的整个过程倾注了大量的汗水和心血。他一丝不苟的工作作风、乐观向上的生活态度、严谨求实的科研精神，给我留下了深刻的印象，我将终生受益。在毕业之际，谨向恩师致以诚挚的敬意和由衷的感谢，祝愿恩师身体健康，天天开心！其次，要特别感谢本实验室的谭万忠老师，余洋老师和杨宇衡老师。三位老师无论在学习还是生活上都给了我很多的帮助，在我的研究有瓶颈的时候，帮助我进行分析，找到正确的方法，教会我更多的实验方法，给我加油鼓劲，让我能够有面对挫折的勇气，加强了我的实验技能，谢谢您们！同时，还要感谢西南大学植物保护学院的其他老师们，王进军老师、肖崇刚老师、青玲老师、丁伟老师、刘怀老师、孙现超老师、陈国康老师等等，您们在研究生课堂，以及其他时候的淳谆教导，在我实验需要的时候提供的帮助是我铭记的感动。此外，还要感谢刘秋艳老师、胡伟伟老师等行政老师，正是有了老师您们的热心关怀和帮助，我的学习和生活才更美好，感谢您们，祝您们工作顺利、健康快乐！除此之外，还要感谢师兄师姐罗华东、严加林、乔昕、陆慧慧、苏正川、陈杰、廖重宇、李石力等，同窗好友肖继芬、刘顺涛等，师妹李雨、王少秋、谭蕊、裴丽丽等，感谢您们在我生活和学习上的鼓励和帮助！感谢我亲爱的小伙伴们王丹、田亚、刘晓姣、张青、李盼盼、张淑婷、刘颖、程承、邵诗桓、陈彦绫等等，谢谢你们在我困难和欢乐的时候都陪在我的身边，给了我勇气和安全感，陪伴我度过人生最美好的青春时光，愿我们能够一直这样好下去！本研究还得到了南充市植保站、西充县植保站、阆中县植保站，仪陇植保站等等各位老师的大力支持和帮助，感谢您们在百忙之中带我去采样，对您们致以衷心的感谢！最后，我要在此特别的感谢我的父母和家人，感谢您们多年来对我无私的付出和悉心的照顾，感谢您们对我学业的支持和鼓励，您们勤劳善良的品质和积极向上的生活态度是我终生享之不尽的宝贵财富！再次感谢帮助和支持过我的老师、同学、朋友及家人，祝您们在以后的人生道路上一帆风顺！心想事成！鲜菲2016年4月7日69 西南大学硕士学位论文70 学习期间发表的论文及参加的课题学习期间发表的论文及参加的课题发表论文：[1]鲜菲,刘顺涛,李雨,陈杰,裴丽丽,余洋,杨宇衡,毕朝位.西南地区稻瘟病菌对戊唑醇的敏感性基线建立及抗性监测[J].农药学学报,2015,17(6):753-756.[2]刘顺涛,李雨,鲜菲,肖继芬,余洋,杨宇衡,毕朝位.西瓜蔓枯病菌对苯醚甲环唑的敏感性基线及抗性监测[C].植物病理学研究进展-中国植物病理学会第十二届青年学术研讨会论文选编,2015:97.[3]陆慧慧,林志强,谭万忠,罗华东,鲜菲,毕朝位,余洋,杨宇衡.苏云金芽孢杆菌CPB012菌株的杀虫功能基因鉴定及其对害虫的控制作用[J].中国农业科学,2015,48(6):1112-1121.参加的课题：公益性行业（农业）科研专项“农作物重要病原菌抗药性监测及治理技术研究与示范”（编号：201303023）71