核酸外切酶辅助的信号放大策略在生化分析中的应用进展.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)特约来稿第11期2015年11月ChineseJournalofAnalyticalChemist~1620～1628DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150565核酸外切酶辅助的信号放大策略在生化分析中的应用进展文立徐凤州何晓晓王柯敏何定庚卿太平邹振(化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南大学生物学院，湖南大学化学化工学院，生物纳米与分子工程湖南省重点实验室，410082长沙)摘要作为工具酶重要成员之一的核酸外切酶是一类无严格碱基序列依赖性的水解酶。近年来

2、，通过利用核酸外切酶水解方式的差异性与纳米技术、酶切循环效应、核酸适配体技术、金属离子稳定的非沃森．克里克碱基配对系统、核酸荧光染料探针技术、电化学方法等相结合，发展了一系列核酸外切酶辅助的信号放大技术，对于提高生化分析检测方法与技术的灵敏度起到了非常关键的作用，已广泛应用于核酸、蛋白质、离子和小分子等物质的高灵敏检测。为了更好地理解和应用核酸外切酶辅助的信号放大策略，本文对核酸外切酶发展的信号放大策略在生化分析中的应用进展进行了综述。关键词分析检测；32具酶；信号放大；核酸外切酶；评述1引言快速、准确、灵敏地检测生化样品中的

3、离子、分子、核酸、蛋白等对疾病的预防诊断、环境监测、食品监控等具有十分重要的意义。通常，实际生化分析样品中仅存在痕量靶物质，因此高灵敏度和高准确性一直是分析检测方法的改进目标。针对这一需求，除了直接发展高灵敏的方法外，放大检测法能降低分析方法或传感器的设计难度以及对专业大型仪器的依赖。根据放大的对象，放大检测法可以简单分为三类：靶标放大策略、探针放大策略和信号放大策略J。靶标放大策略通常是通过一定的手段特异性复制靶标，使其达到常规方法可以检测的水平。如经典的靶标放大策略——聚合酶链式反应(Polymer—asechainrea

4、ction，PCR)可以实现10～l0倍的靶标放大；探针放大策略，靶标的量不变，探针序列被不断放大，如滚环放大技术(Rollingcircleamplification，RCA)，它可以实现10一10倍左右的信号增强。相对于靶标放大策略和探针放大策略，信号放大策略有更多的可选性，如近年来发展的通过杂交链式反应、工具酶、酶联催化反应、纳米材料等生物及化学方法放大分析与传感器界面的响应信号，可特异性地提高检测信号，降低背景及噪音信号，对于提高生化分析检测方法与技术的灵敏度起到了非常关键的作用。在这些信号放大策略中，基于工具酶(如聚

5、合酶、连接酶、限制性内切酶、切割内切酶、核酸外切酶、核糖核酸酶等)辅助的信号放大技术，由于具有操作简便、灵敏度和特异性高、反应条件温和、反应时间相对较短等优点，近年来在生化分析方面的得到了迅速发展。尤其是利用核酸酶水解方式的差异性与纳米技术、酶切循环效应、核酸适配体技术、金属离子稳定的非沃森．克里克碱基配对系统、核酸荧光染料探针技术、电化学方法等相结合发展的一系列核酸酶辅助的信号放大技术，已广泛应用于核酸、蛋白质、离子和小分子等物质的检测J。基于核酸酶辅助的信号放大策略主要有两大类，一是序列依赖性的限制性内切酶或切割内切酶辅助

6、的信号放大策略，另一类是无序列依赖性的核酸外切辅助的信号放大策略。从核酸酶辅助的信号放大策略的通用性来讲，没有序列依赖性的核酸外切酶在探针设计和靶标分析方面更加简便易行，因而显示了更广的应用前景¨。本文即在简单概括核酸外切酶的分类以及基本特性的基础上，着重介绍核酸外切酶辅助的信号放大策略在核酸、蛋白质、小分子及离子分析检测中的研究进展，并展望其发展趋势。2015-07—15收稿；2015-09-26接受本文系国家自然科学基金项目(Nos．21322509，21305035，21305038，21190044)资助E—mail：

7、kmwang@hnu．edu．el第11期文立等：核酸外切酶辅助的信号放大策略在生化分析中的应用进展2核酸外切酶的分类及其基本特性核酸外切酶简称外切酶(Exonuclease)，是一类从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3，5一磷酸二酯键，获得单个的核苷酸为最终产物(DNA为dNMP，RNA为NMP)的酶。根据其作用底物的特异性可将核酸外切酶分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶，如大肠杆菌核酸外切酶I(ExoI)和核酸外切酶VII(ExoVII)属于单链的核酸外切酶，而双链的核酸外切酶则包括了大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ(Exo11)

8、、A噬菌体核酸外切酶(Aexo)以及T7核酸外切酶(T7exo)等。尽管不像核酸内切酶那样具有对催化水解底物存在较强的碱基序列依赖性，不同的核酸外切酶存在不同的水解条件，可以区别出从分子链的3末端或5末端开始切断和对单链DNA或双链DNA具有特异性作用。为了更好地理解和应用核