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分类号：R2031学校代码：10392学科专业代码：100602学号:2121006158硕士学位论文中青年高血压病痰湿壅盛证患者尿液样品代谢组学的检测分析MetabolomicsanalysisofUrinesamplesinyoungandmiddle–agedpatientswithHypertensionofphlegmdampnessretentionsyndrome学位类型：医学硕士所在学院：第一临床医学院申请人姓名：陈玲珊学科、专业：中西医结合临床（心血管病）导师：陈金水教授研究起止日期：2014年6月至2015年3月答辩委员会主席：刘建华教授答辩日期：2015年6月5日二○一五年六月 目录英文缩略词中英文对照表…………………………………………1中文摘要………………………………………………………………2英文摘要………………………………………………………………4前言……………………………………………………………………7材料和方法…………………………………...…………………....….91材料...........................................................................................91.1仪器........................................................................................91.2试剂........................................................................................92方法..........................................................................................92.1病例选择...............................................................................92.2观察指标..............................................................................102.3实验室检测..........................................................................11结果…………………………..………………………………………121代谢组学结果.........................................................................121.1痰湿壅盛组与对照组代谢组学的分析比较………..........121.2痰湿壅盛组与肝火亢盛组代谢组学的分析比较……......181.3痰湿壅盛组与阴虚阳亢组代谢组学的分析比较..............222一般情况及生化指标结果.........……………........................28讨论……………………………………………..……………………291尿液代谢组学生物标志物的内涵分析…………………....291.1代谢组学……………………………………………….….29 1.2代谢组学与中医证候的关联…………………………….291.3高血压病痰湿壅盛证代谢组学分析…………………….302高血压病痰湿壅盛证与危险因素的关系……………….…342.1体重、体重指数…………………………………….……342.2血脂………………………………………………….……342.3血尿酸……………………………………………….……352.4空腹胰岛素及C肽水平…………………………….……353问题与展望…………………………………………………36结论………………………………………………..…………………37参考文献……………………………………………..………………38综述……………………………………….………....………….……42致谢……………………………………………….…………….……50 英文缩略词中英文对照表缩略语英文全称中文全称EHessentialhypertension高血压病TCMtraditionalChinesemedicine中医BMIbodymassindex体重指数UAuricacid尿酸TCtotalcholesterol总胆固醇TGTriglyceride甘油三酯LDL-Clowdensitylipoprotein–cholesterol低密度脂蛋白胆固醇FINSfastinginsulin空腹胰岛素FCPfastingCPeptideC肽NMRNuclearMagneticResonance核磁共振PCAprincipalcomponentsanalysis主成分分析技术PLS-DApartialleastsquares-discriminateanalysis偏最小二乘法-判别分析FIDfreeinductiondecay自由感应衰减LC-MSliquidchromatography-massspectrometry液相色谱质谱联用技术GC-MSgaschromatography-massspectrometry气相色谱质谱联用技术CE-MScapillaryelectrophoresis-massspectrometry毛细管质谱联用技术D2ODeuteriumoxide重水1 福建医科大学硕士学位论文中青年高血压病痰湿壅盛证患者尿液样品代谢组学的检测分析中文摘要目的运用代谢组学技术对中青年高血压病患者痰湿壅盛证、肝火亢盛证、阴虚阳亢证及健康人群的尿液样品代谢组进行全谱分析，建立高血压病痰湿壅盛证代谢组学的诊断及判别模型，确定其相关的生物标志物（群）。并进一步分析体重指数、血脂、血尿酸、空腹胰岛素水平等指标与代谢物及中医证型的相关性，以期达到早期干预治疗以预防疾病进展的目的。内容11.尿液代谢组学检测：采用HNMR（NuclearMagneticResonance，核磁共振）结合PCA（principalcomponentsanalysis,主成分分析法）、PLS-DA(partialleastsquares-discriminateanalysis,偏最小二乘法-判别分析)对中青年原发性高血压三种常见证型患者及健康志愿者的尿液进行全谱分析。2.通过对中青年高血压病患者痰湿壅盛证、肝火亢盛证、阴虚阳亢证及健康人群的尿液代谢产物谱的分析，建立高血压病痰湿壅盛证代谢组学的诊断及判别模型，确定其相关的生物标志物（群），在代谢组学的水平上探讨高血压病痰湿壅盛证中医“证”的物质基础，从而达到区别于其他证型的目的。3.了解中青年高血压病痰湿壅盛证患者年龄、体重、体重指数、体脂肪含量、血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、血尿酸及空腹胰岛素、C肽水平，探讨肥胖、高血脂、高尿酸与空腹胰岛素水平增高等危险因素和代谢组学及中医证型的关系。方法选择福建医科大学附属第一医院18-59岁的原发性高血压患者34例，这些高血压病患者均没有服用任何降压药物或者已服用降压药物但是经过2周洗脱期，符合高血压I级和II级。参照中华人民共和国卫生部2002版《中药新药临床指导原则》中的《中药新药治疗高血压病的临床研究指导原则》，这些患者中痰湿壅盛证、肝火亢盛证、阴虚阳亢证分别为14例、14例、6例，2 福建医科大学硕士学位论文再随机选取我院健康志愿者15例，分成四组。留取受试者晨尿进行预处理后送至福州大学测试中心进行核磁共振谱检测，运用PCA、PLS-DA等方法，分析各组间的差异，进而筛选并且确定出能判别中青年高血压病患者痰湿壅盛证与肝火亢盛证、阴虚阳亢证及健康人尿液中的代谢物差异，并得出中青年高血压病痰湿壅盛证患者的“生物标记物群”。结果1.中青年高血压病痰湿壅盛组患者的体重、体重指数、甘油三酯、血尿酸、空腹胰岛素水平、空腹C肽明显高于对照组；痰湿壅盛组患者的血尿酸、空腹胰岛素水平明显高于肝火亢盛组；痰湿壅盛组患者的体重、尿酸、空腹胰岛素水平明显高于阴虚阳亢组。阴虚阳亢组患者与对照组对比，年龄、血清总胆固醇显著升高。（p＜0.05）2.中青年高血压病痰湿壅盛组与对照组有显著性差异的化合物：尿素、柠檬酸盐、乙醇胺、π-甲基组氨酸、谷氨酰胺、肌酸。中青年高血压病痰湿壅盛组与肝火亢盛组有显著性差异的化合物：尿素、肌酐、乙醇胺、肌酸、马尿酸、苯丙氨酸。中青年高血压病痰湿壅盛组与阴虚阳亢组有显著性差异的化合物：尿素、肌酐、乙醇胺、氧化三甲基、谷氨酰胺、肌酸。结论1.运用代谢组学方法可以区分中青年高血压病痰湿壅盛证和肝火亢盛证、阴虚阳亢证、健康人群。2.初步得出中青年高血压病痰湿壅盛证的代谢组学生物标志物群：尿素、柠檬酸盐、乙醇胺、π-甲基组氨酸、谷氨酰胺、肌酸。其主要与三大代谢及嘌呤代谢关系密切，可能与高脂饮食及高嘌呤饮食有关。3.通过对痰湿壅盛组与其他组别一般情况与生化指标的比较，得出血尿酸、空腹胰岛素水平在区分中青年高血压病痰湿壅盛组与其他组别时具有一定参考意义。关键词高血压病，痰湿壅盛证，中青年，代谢组学3 福建医科大学硕士学位论文MetabolomicsanalysisofUrinesamplesinyoungandmiddle–agedpatientswithHypertensionofphlegmdampnessretentionsyndromeAbstractObjectivesThefirstaimofthisstudyistoanalysistheurinesamplesofyoungandmiddle-agedpatientswithliver-firehyperactivitysyndrome,Yindeficiencyandyanghyperactivityandhealthypatientscomparedwithhypertensionofphlegmdampnessretentionsyndromebymeansofmetabonomicsandestablishdifferentialdiagnosismodelofhypertensionofphlegmdampnessretentionsyndromeinmetabonomicsandconfirmitsbiomarker.Anotherpurposeistofurtheranalysisthecorrelationbetweenbodymassindex,bloodlipids,blooduric,acidfastinginsulinandmetabolitebiomarkersandsyndrometypeofTCMforearlyinterventionandprecaution.Content1.Urinesamplesofyoungandmiddle-agedhyperpieticpatientswiththreecommonsyndromesandhealthyvolunteersweretestedtoanalysisinfullspectrum1byHNMR(NuclearMagneticResonance)combinedwithPCA(principalcomponentanalysis)andPLS-DA(partialleastsquares-discriminateanalysis).2.Differentialdiagnosismodelofhypertensionofphlegmdampnessretentionsyndromeinmetabonomicswasestablishedtoconfirmitsbiomarkerandinvestigatethematerialbasisofhypertensionofphlegmdampnessretentionsyndromeinmetabonomicslevelthroughanalysisurinemetabolicprofilesof.hypertensionofphlegmdampnessretentionsyndromeandliver-firehyperactivitysyndrome,Yindeficiencyandyanghyperactivitysyndromegrouppatients,healthyvolunteers.3.Understandingage,weight,bodymassindex,bodyfatcontent,serumtotalcholesterol,triglyceride,lowdensitylipoproteincholesterol,uricacid,fasting4 福建医科大学硕士学位论文insulinandfastingCpeptidelevelintheyoungandmiddle-agedhypertensiveofphlegmdampnessretentionsyndromeandinvestigatingtherelativitybetweenobesity,highbloodlipids,highuricacid,fastinginsulinlevelsandotherriskfactorsandmetabonomicsandTCMsyndrometype.Method34casesof18-59yearsoldEHpatientswereselectedfromFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,thehypertensionpatientswerenottakinganyantihypertensivedrugsortakingantihypertensivedrugsaftera2weekwashoutperiod,conformtoIlevelandIIlevelwithhypertension.AccordingtotheMinistryofhealthofthepeople'sRepublicofChinathe2002editionof《Chinesemedicineclinicalguidelines》inthe《traditionalChinesedrugtreatmentofhypertensionclinicalresearchguidingprinciple》,thesepatientsofphlegmdampnessretentionsyndrome,liver-firehyperactivitysyndrome,Yindeficiencyandyanghyperactivitysyndromewere14cases,14cases,6cases,thenselect15caseshealthyvolunteersinourhospital,asfourgroups.MorningurinesamplepretreatmentandsenttotestcenterofFuzhouUniversityfornuclearmagneticresonancespectrumdetection,usePCAandPLS-DAandothermethods,analysethedifferencesbetweeneverygroups,andthenscreenedandidentifiedthemetabolitedifferencesinurinethatcandistinguishbetweenyoungandmiddle-agedpatientswithhypertensionofphlegmdampnessretentionsyndrome,liver-firehyperactivitysyndrome,Yindeficiencyandyanghyperactivitysyndromeandhealthysubjects,andgetthe"biomarkergroup"ofyoungandmiddle-agedpatientswithhypertensionofphlegmdampnessretentionsyndrome.Result1.Theweight,bodymassindex,triglyceride,uricacid,fastinginsulin,fastingCpeptideinyoungandmiddle-agedpatientswithhypertensionofphlegmdampnessretentiongroupweresignificantlyhigherthanthatincontrolgroup;theweight,triglyceride,uricacid,fastinginsulinlevelsinphlegmdampnessretentiongroupweresignificantlyhigherinliver-firehyperactivitygroup;theweight,uricacidinphlegmdampnessretentiongroupweresignificantlyhigherthanYin5 福建医科大学硕士学位论文deficiencyandyanghyperactivitygroup.ThecontrolgroupwascomparedtoYindeficiencyandyanghyperactivitygroup,age,serumtotalcholesterolwassignificantlyincreased.(p<0.05)2.Thecompoundshavesignificantdifferencesbetweenyoungandmiddle-agedpatientswithhypertensionofphlegmdampnessretentiongroupandcontrolgroup:urea,citrate,ethanolamine,π-methylhistidine,glutamine,creatine,threonine.Significantdifferencesofthecompoundsbetweenhypertensionofphlegmdampnessretentiongroupandliver-firehyperactivitygroup:urea,creatinine,sarcosine,hippurate,phenylalanine,ethanolamine.Compoundshavesignificantdifferencesbetweenyoungandmiddle-agedpatientswithhypertensionofphlegmdampnessretentiongroupandYindeficiencyandyanghyperactivitygroup:urea,creatinine,trimethylamineN-oxide,glutamate,ethanolamine,creatine.Conclusion1.Metabonomicsmightprovideaclearphysicalbasisfordistinguishingyoungandmiddle-agedpatientswithhypertensionofphlegmdampnessretentionsyndromeandliver-firehyperactivitysyndrome,Yindeficiencyandyanghyperactivitysyndrome,healthypeople.2.Urea,citrate,ethanolamine,π-methylhistidine,glutamine,creatineandthreoninemightbemetabolomicbiomarkersofyoungandmiddle-agedpatientswithhypertensionofphlegmdampnessretention，thatismajorandcloselyrelatedtothreemetabolismandpurinemetabolism，maybeassociatedwithhighfatdietandhighpurinediet.3.Blooduricacid,fastinginsulinlevelsmightmakerolesindifferentialdiagnosisofyoungandmiddle-agedpatientswithhypertensionofphlegmdampnessretentionsyndromebasedonthecomparisonbetweenphlegmdampnessretentiongroupwithothergroupsingeneralandphysicochemicalindexes.Keywordshypertension,phlegmdampnessretentionsyndrome,youngandmiddle-ageadults，metabonomics6 福建医科大学硕士学位论文前言高血压病又称EH（essentialhypertension，原发性高血压），具有患病率高、病程长、并发症多等特点，它作为一种慢性的终身性疾病，常被人们称为“无声杀手”。相关资料显示，1980年至今，我国高血压患病率明显增高，患病人数逐渐增加。根据国家心血管病中心估计2013年全国高血压病患者已达2.7亿。虽然我国高血压患病率高，但是根据相关流行病学调查，知晓率、治疗率、控制率及达标率却未达到理想水平，因此高血压病的防治仍然任重道远。当今社会生活节奏快并且竞争激烈，加之现在中青年人群常因不良的生活习惯及不合理的膳食结构等因素致脾胃受损，脾失健运，分清泌浊功能衰退；脾喜燥恶湿，过食海鲜等寒凉之品，可致寒湿停滞于内，脾阳受损，水湿运化失常，此为一方面；另一方面，本实验纳入的患者多处在南方湿热的气候中，易灼湿为痰，痰湿郁久化热，故成为高血压病易患人群。中医学有“肥人多痰湿”这一观点。肥人大多为饮食偏嗜并且缺少运动引起，易致肥腻沉积，中焦运化失常，痰湿阻滞，故中青年高血压病患者以痰湿壅盛证为多见。有文献表明早期高血压病经积极治疗可痊愈，因早期属于可逆性阶段。但临床上早期高血压病患者常没有明显的临床症状，除非定期体检，否则不易被发现，且中青年人群大多自制能力较差，自恃年轻体壮，甚至诊断高血压也不以为然，常拒绝服药或不规律服药，最终导致病情发展。因此，能否及时准确的诊断、及时早期正确的干预、及时发现病情的变化、及时评估病变的程度，对于中青年高血压病的进展至关重要。代谢组学是用LC-MS（liquidchromatography-massspectrometry，液相色谱质谱联用技术）、GC-MS（gaschromatography-massspectrometry，气相色谱质谱联用技术）、CE-MS（capillaryelectrophoresis-massspectrometry，毛细管质谱联用技术）以及NMR等分析检测鉴定的一种手段。其综合运用多种化学信息学技术，研究内源性代谢产物，如血浆、尿液、组织液等生物体体液，通过对不同状态下生物体的代谢组的差异进行分析而获得相应的生物标志物群，揭示了在特定时间、环境下生物体的整体功能状态。中医学有“有诸内必形诸外”、“视其外应，以知其内脏，则知所病矣”、“整体观”等思维理念。其精髓7 福建医科大学硕士学位论文在于以整体的、动态的和辨证的观念去辨别和诊断人是否健康，而代谢组学的核心是研究外源性物质对生物体所产生的整体效应，故可得出中医学与代谢组学在某些方面上具有相似性。因此，将代谢组学理念与方法引入高血压病“证”的本质研究具有重要的现实意义。本项目基于核磁共振谱仪的代谢组学方法体现复杂条件下机体病理生理状态变化，对健康人群及中青年高血压病患者痰湿壅盛证型、肝火亢盛证型、阴虚阳亢证型尿液代谢组进行全谱分析，再运用PCA、PLS-DA等进行多元统计分析，分析各组间的差异，进而筛选并且确定出能判别中青年高血压病患者痰湿壅盛证与非痰湿壅盛证及健康人尿液中的代谢物差异，并得出中青年高血压病痰湿壅盛证患者的“生物标记物群”，为该类疾病的防治提供依据。8 福建医科大学硕士学位论文材料和方法1材料1.1仪器核磁共振波谱仪型号：AVANCEIII500MHz；产家：瑞士BRUKER核磁管（5mm）移液枪若干1.2试剂TSP：3-(三甲基甲硅烷基)丙酸-d4钠盐规格：1g98%；品牌：SIGMAD20（Deuteriumoxide，重水）品牌：MREDA缓冲液（PH7.4）2方法2.1病例选择2.1.1诊断标准西医诊断标准：参照中华人民共和国卫生部2010年颁布的《中国高血压防治指南》进行诊断。a要求受试者坐位安静休息5min后开始测量。选择定期校准的水银柱血压计，测量坐位时的上臂血压，上臂应置于心脏水平。首诊时要测量双上臂血压，以后通常测量较高读数一侧的上臂血压。b≥3次非同日、非药物干预下安静时收缩压≥140mmHg和（或）舒张压≥90mmHg的原发性高血压患者。c排除继发性高血压。收缩压140～159mmHg和（或）舒张压90～99mmHg诊断为高血压1级；收缩压160～179mmHg和（或）舒张压100～109mmHg诊断为高血压2级；收缩压≥180mmHg和（或）舒张压≥110mmHg诊断为高血压3级。中医证候诊断标准：参照中华人民共和国卫生部2002版《中药新药临床指导原则》中的《中药新药治疗高血压病的临床研究指导原则》，根据主要证候分别进行痰湿壅盛证、肝火亢盛证、阴虚阳亢证三种证型的诊断。a痰湿壅盛证：主症包括眩晕、头痛、头如裹、胸闷、呕吐痰涎；次症包9 福建医科大学硕士学位论文括心悸、失眠、口淡、食少、舌胖苔腻、脉滑。b阴虚阳亢证：主症包括眩晕、头痛、腰酸、膝软、五心烦热；次症包括心悸、失眠、耳鸣、健忘、舌红少苔、脉弦细而数。c肝火亢盛证：主症包括眩晕、头痛、急躁易怒；次症包括面红、目赤、口干、口苦、便秘、溲赤、舌红苔黄、脉弦数。2.1.2纳入标准a符合高血压病西医诊断标准和中医主要3种证候诊断标准。b年龄18-59岁人群。c属于I级和II级原发性高血压的患者，140mmHg<收缩压<180mmHg且90mmHg<舒张压<110mmHg。d未用药或已服用降血压药物但经2周洗脱期后血压达到上述标准。e知情同意并签署知情同意书。2.1.3排除标准a不符合上述纳入标准。b各种继发性高血压、严重心脑肝肾肺疾患者。c急慢性感染性疾病、糖尿病、恶性肿瘤、严重营养不良、免疫性疾病患者。d合并有精神病或者各种应激状况者。e孕妇、哺乳期妇女。2.1.4对照组选择标准年龄18-59岁，符合上述排除标准的血压正常者。2.1.5研究对象入选2014年8月-2015年1月就诊我院的18-59岁原发性高血压患者34例，按中医证型痰湿壅盛证、肝火亢盛证、阴虚阳亢证进行分组，均由副主任及以上级别医师辨证入组；其中，肝火亢盛组（B组）14人（41.2%），痰湿壅盛组（C组）14例（41.2%）、阴虚阳亢组（D组）6例（18.6%）。另选择同时期来我院体检的健康人群为对照组（A组），共15人。2.2观察指标2.2.1一般情况年龄、体重、BMI（bodymassindex,体重指数）、体脂肪含量。2.2.2生化指标TC（totalcholesterol，血清总胆固醇）、TG（triglyceride，甘油三酯）、LDL-C（lowdensitylipoprotein–cholesterol，低密度脂蛋白胆固醇）、UA（uricacid，血尿酸）、FINS（fastinginsulin，空腹胰岛素）及FCP（fastingCpeptide，C肽）水平。10 福建医科大学硕士学位论文上述指标均由福建医科大学附属第一医院医护人员在患者晨起空腹情况下严格按照统一标准进行采血，后送至福建医科大学附属第一医院检验科进行检测，得出结果并记录。2.2.3检测分析指标尿液代谢组。2.3实验室检测符合病例入选标准纳入原发性高血压痰湿壅盛证患者14例、肝火亢盛证患者14例、阴虚阳亢证患者6例；健康志愿者15例。四组患者分别进行尿液代谢组学检测分析。2.3.1标本的采集指导患者正确收集尿液标本，避免月经、粪便等物质污染，采用无菌干燥容器收集后统一置于标本框中。留取患者晨起第二次尿液的中段尿，立即将其于3000r/min高速离心10min，取上清液，保存在-80℃冰箱中，待处理。2.3.2尿液样品的预处理精密移取300μl尿液，加入缓冲液（PH7.4）200μl、含TSP的重水（TSP/D2O=1mg/1ml）100μl，混匀器混匀5min，4℃，12000r/min，高速离心5min，取上清液500ul，置于5mm核磁管中，制备供试样品，统一送至福州大学测试中心进行核磁共振图谱检测。2.3.3数据采集及处理在超导傅立叶变NMR谱仪上调用noesygppr1d脉冲序列,该序列可以较好地去除尿液中大分子的干扰。相关参数如下：谱宽6009.615Hz，采样时间12.0480s，将HNMRFID（freeinductiondecay,自由感应衰减)信号导入ChenomxNMRsuit(version8.0,Chenomx,Edmonton,Canada)软件，自动进行傅立叶转换，调整相位，校正基线，尿液以峰TSP（0.0ppm）作为全部谱图化学位移的标准。对0.1-10.0ppm范围内的谱峰进行分析，以0.04ppm单位的化学位移为分段积分单元。为了防止水的残留峰干扰，尿液样本除去4.65-4.90ppm（水峰）处的分段积分。然后将所有积分值的面积进行归一化处理，导出到EXCEL表格中，得到每个分段和对应的积分面积值的矩阵。最后把变量矩阵做为源数据进行后续的PCA和PLS-DA。11 福建医科大学硕士学位论文2.3.4数据分析将存储的数据文件经PCA及PLS-DA得到得分图和对应的载荷图等。根据得分图和载荷图的结果对尿液样品区分，根据相应的载荷图寻找对区分高血压病中医不同证型贡献较大的变量（化学位移），确定两组之间的共性代谢物和差异的生物标记物。后将有差异的代谢物输入KEGG数据库，得出每种代谢物涉及的代谢途径。2.3.5统计学处理本研究中，采用SPSS19.0版本对数据进行统计分析，组间差异显著性采2用x检验等方法，数据用x±s表示。代谢组学分析：通过SIMCAP11.5软件，进行PCA以及PLS-DA，由此寻找和发现痰湿壅盛组与其他三组尿液样品之间的代谢差异，找出特征差异代谢物。再采用SPSS19.0版本对两组间特征差异代谢物进行t检验，得出差异有统计学意义的代谢物。结果本实验共纳入49名研究对象。其中对照组（A组）15名，肝火亢盛组（B组）14名，痰湿壅盛组（C组）14名、阴虚阳亢组（D组）6名。表1四组性别构成比的比较2组别例数男女xp值A组156（40%）9（60%）B组145（35.7%）9（64.3%）C组148（57.1%）6（42.9%）2.9700.410D组61（16.7%）5(83.3%)合计4920（40.8%）29(59.2%)2注：x检验结果提示p＞0.052表1，通过对四组之间的性别构成比进行x检验，得出p值＞0.05，故尚不能认为四组男女构成比间存在统计学差异，各组之间具有一定的可比性。1代谢组学结果1.1痰湿壅盛组与对照组代谢组学的分析比较12 福建医科大学硕士学位论文图1.1痰湿壅盛组（C组）与对照组（A组）的模型图图1.1，R2Y：说明了隐变量所能反映因变量Y的变异百分比；反映主成分的解释度，说明主成分所能代表多少样本的信息量。Q2：通过交叉验证，PLS-DA的模型通过获得隐变量后，能预测的因变量Y的变异百分比；反映主成分的预测度。上图显示的是两组存在差异的两个主成分R2Y(绿色)以及Q2(蓝色)数据的直方图，第一主成分R2Y=0.64，Q2=0.54，两个主成分R2Y之和=0.83，Q2之和=0.49，可以看出本模型较理想，它对主成分的解释度较高，能解释较多的数据，但预测能力较一般。图1.2.1痰湿壅盛组（C组）与对照组（A组）的得分图（PCA）13 福建医科大学硕士学位论文图1.2.2痰湿壅盛组（C组）与对照组（A组）的得分图（PLS-DA）图1.2.1、图1.2.2中不同颜色代表不同的样本，每个点代表一个样本。样本的团聚和离散一方面表现了样本的重复性，另一方面也体现了样本组间的代谢轮廓相似性。散点距离越远代表两组间差异越大，反之说明差异越小。图1.2.1（PCA）中有一小部分样本有互相融入，但大体上有一定的区分。图1.2.2（PLS-DA）中虽然A8区别不太明显，但总体上A组与C组的界限明显，可以划分出一条明显的分界直线，两组之间存在较为显著的差别。图1.3.1痰湿壅盛组（C组）与对照组（A组）的载荷图（PCA）14 福建医科大学硕士学位论文图1.3.2痰湿壅盛组（C组）与对照组（A组）的载荷图（PLS-DA）上图1.3.1、图1.3.2显示的载荷图反映样本的差异化学位移点。载荷图中，差异化学位移点离中心点越远，那么对区分样本所做的贡献也越大。图1.4痰湿壅盛组（C组）与对照组（A组）的VIP图15 福建医科大学硕士学位论文VIP（VariableImportanceinProjection）图（图1.4）是用以提供最主要的变量以及它们在各组里面的重要程度。图中给出了VIP值排名的差异化学位点。VIP值越大说明它们在样本的区分中所作的贡献越大，一般默认VIP大于1的变量具有显著性差异。本实验中就取VIP大于1的值，运用t检验进行分析，得出统计学上有显著性差异的化合物。表2痰湿壅盛组（C组）与对照组（A组）之间有差异的化合物表序号英文名称中文名称差异化学位移p值变化趋势1Urea尿素5.78＜0.001↑5.74＜0.0015.82＜0.0015.7＜0.0015.86＜0.0015.62＜0.0012Citrate柠檬酸盐2.70.024↓2.540.0613Ethanolamine乙醇胺3.820.012↓4π-Methylhistidineπ-甲基组氨酸3.70.041↓7.060.0405Glutamine谷氨酰胺3.780.080↓2.140.0442.460.0786Creatine肌酸3.90.030↓表2得出两组之间有显著性差异的化合物：尿素、柠檬酸盐、乙醇胺、π-甲基组氨酸、谷氨酰胺、肌酸，均具有统计学上的意义。其中痰湿壅盛组尿素较对照组显著升高，柠檬酸盐、乙酸铵、π-甲基组氨酸、谷氨酰胺、肌酸均较对照组显著降低。根据图1.4与表2，我们可以看出仍有一部分的差异化学位移点目前无法被鉴定出，尚待日后进一步进行研究发现。这个结果说明中青年高血压病痰湿壅盛组与对照组之间确实存在基础代谢物的差异，可将两组明显。16 福建医科大学硕士学位论文表3C组与A组之间有显著性差异的化合物涉及到的代谢途径KEGG编号化合物代谢途径相关功能分类K01427尿素嘌呤代谢核酸代谢精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢K01647柠檬酸盐柠檬酸盐循环糖、脂类、氨基酸代谢乙醛酸盐代谢糖代谢2-氧代羧酸代谢糖代谢氨基酸的生物合成氨基酸代谢K00894乙醇胺甘油磷脂代谢脂代谢K01915谷氨酰胺丙氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸代谢氨基酸代谢精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢乙醛酸盐代谢糖代谢氮素代谢氨基酸代谢氨基酸的生物合成氨基酸代谢K00933肌酸精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢将有差异的化合物输入KEGG数据库，得出上表3，中青年高血压病痰湿壅盛组与对照组对比存在显著性差异的代谢物主要涉及到的代谢途径为氨基酸代谢、糖代谢、脂代谢、核酸代谢等。图1.6痰湿壅盛组（C组）与对照组（A组）的permutation检测图17 福建医科大学硕士学位论文上图1.6是排列检测检验的方法来评价PLS-DA模型的治疗，若蓝色与绿色两条线分的越开说明模型越好，蓝色的线的Y坐标是负值则就是说明实验模型是良好的。由此可以看出，痰湿壅盛组与对照组对比的模型建立在较好水平。1.2痰湿壅盛组与肝火亢盛组代谢组学的分析比较图2.1痰湿壅盛组（C组）与肝火亢盛组（B组）的模型图图2.1可以得出第一主成分R2Y=0.75，Q2=0.72，两个主成分R2Y之和=0.92，Q2之和=0.84，可以看出本模型理想，它对主成分的解释度高，能解释数据多，预测能力良好。图2.2.1痰湿壅盛组（C组）与肝火亢盛组（B组）的得分图（PCA）18 福建医科大学硕士学位论文图2.2.2痰湿壅盛组（C组）与肝火亢盛组（B组）的得分图（PLS-DA）从图2.2.1、图2.2.2中可以看出B组与C组之间界限明显，可以划分出一条明显的分界直线，说明中青年高血压病痰湿壅盛组与肝火亢盛组之间存在显著差别。图2.3.1痰湿壅盛组（C组）与肝火亢盛组（B组）的载荷图（PCA）19 福建医科大学硕士学位论文图2.3.2痰湿壅盛组（C组）与肝火亢盛组（B组）的载荷图（PLS-DA）从图2.3.1、图2.3.2显示的载荷图反映了导致C组与B组两组样本区分开来的差异化学位移点。载荷图中差异化学位移点离中心点越远对区分样本所做的贡献越大。20 福建医科大学硕士学位论文图2.4痰湿壅盛组（C组）与肝火亢盛组（B组）的VIP图图2.4中给出了VIP值排名前51名的差异化学位点，把VIP大于1的差异化学位点进行t检验，得出C组与B组之间统计学上有显著性差异的化合物。表4痰湿壅盛组（C组）与肝火亢盛组（B组）之间有差异的化合物表序号英文名称中文名称ppmp值变化趋势1Urea尿素5.78＜0.001↑5.74＜0.0015.82＜0.0015.7＜0.0015.86＜0.0012Creatinine肌酐4.10.050↓3Ethanolamine乙醇胺3.82＜0.001↓4Creatine肌酸3.9＜0.001↓5Hippurate马尿酸7.540.018↓6Phenylalanine苯丙氨酸7.340.042↓表4得出两组存在差异的化合物有：尿素、肌酐、乙醇胺、肌酸、马尿酸、苯丙氨酸，均有统计学意义。其中肌酐处在有统计学意义边缘，待今后开展大样本研究后进一步证明。其中痰湿壅盛组尿素高于肝火亢盛组，肌酐、乙醇胺、肌酸、马尿酸、苯丙氨酸均低于肝火亢盛组。据图2.4与表4，看出有部分的21 福建医科大学硕士学位论文差异化学位移点未被鉴定出是何化合物，尚待进一步研究。此结果说明中青年高血压病痰湿壅盛证与肝火亢盛证之间确实存在代谢物的差异。表5C组与B组之间有显著性差异的化合物涉及到的代谢途径KEGG编号化合物代谢途径相关功能分类K01427尿素嘌呤代谢核酸代谢精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢K01470肌酐精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢K00894乙醇胺甘油磷脂代谢脂代谢K00933肌酸精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢K01451马尿酸苯丙氨酸代谢氨基酸代谢K00270苯丙氨酸酪氨酸代谢氨基酸代谢苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸的生物合成氨基酸代谢从表5可以看出，中青年高血压病痰湿壅盛证与肝火亢盛证之间存在有显著性差异的代谢物主要涉及到的代谢途径包括氨基酸代谢、脂代谢、核酸代谢等。图2.6痰湿壅盛组（C组）与肝火亢盛证组（B组）的permutation检测图图2.6可以看出痰湿壅盛组与肝火亢盛组对比的模型水平尚可。1.3痰湿壅盛组与阴虚阳亢组代谢组学的分析比较22 福建医科大学硕士学位论文图3.1痰湿壅盛组（C组）与阴虚阳亢组（D组）的模型图图3.1可以得出第一主成分R2Y=0.95，Q2=0.93，两个主成分R2Y之和=0.98，Q2之和=0.92，可以看出本模型很理想，它对主成分的解释度很高，能解释数据很多，且其预测能力也比较强。图3.2.1痰湿壅盛组（C组）与阴虚阳亢组（D组）的得分图（PCA）23 福建医科大学硕士学位论文图3.2.2痰湿壅盛组（C组）与阴虚阳亢组（D组）的得分图（PLS-DA）从图3.2.1、图3.2.2中可以看出D组有一样本D1溢出椭圆，异常，予以排除。图中可以看出D组与C组能够明显区分开，说明两组之间存在明显差异。图3.3.1痰湿壅盛组（C组）与阴虚阳亢组（D组）的载荷图（PCA）24 福建医科大学硕士学位论文图3.3.2痰湿壅盛组（C组）与阴虚阳亢组（D组）的载荷图（PLS-DA）从图3.3.1、图3.3.2显示的载荷图反映了导致痰湿壅盛组与阴虚阳亢组两组样本区分开来的差异化学位移点。图中的差异化学位移点离中心点越远对区分样本所做的贡献越大。25 福建医科大学硕士学位论文图3.4痰湿壅盛组（C组）与阴虚阳亢组（D组）的VIP图图3.4可看出痰湿壅盛组与阴虚阳亢组之间有一部分代谢物发生变化。表6痰湿壅盛组（C组）与阴虚阳亢组（D组）之间有差异的化合物表序号英文名称中文名称差异化学位移p值变化趋势1Urea尿素5.78＜0.001↑5.74＜0.0015.82＜0.0015.7＜0.0015.86＜0.0012Creatinine肌酐4.10.008↓4.06＜0.0013Ethanolamine乙醇胺3.820.001↓4TrimethylamineN-oxide氧化三甲基3.260.008↑5Glutamine谷氨酰胺3.780.010↓2.460.0236Creatine肌酸3.9＜0.001↓表6，两组间存在变量，根据差异化学位移及差异峰指认，两组之间存在显著性差异的化合物有：尿素、肌酐、乙醇胺、氧化三甲基、谷氨酰胺、肌酸6种，差异有统计学意义。其中痰湿壅盛组尿素、氧化三甲基较阴虚阳亢组升高，肌酐、乙醇胺、谷氨酰胺、肌酸较阴虚阳亢组降低。据图3.4与表6，有26 福建医科大学硕士学位论文部分的差异化学位移点目前未被鉴定出，尚待日后进一步研究。结果说明中青年高血压病痰湿壅盛证与阴虚阳亢证之间确实存在基础代谢物的差异。表7C组与D组之间有显著性差异的化合物涉及到的代谢途径KEGG编号化合物代谢途径相关功能分类K01427尿素嘌呤代谢核酸代谢精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢K01470肌酐精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢K00894乙醇胺甘油磷脂代谢脂代谢K03532氧化三甲基二组分系统K01915谷氨酰胺丙氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸代谢氨基酸代谢精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢乙醛酸盐代谢糖代谢氮素代谢氨基酸代谢氨基酸的生物合成氨基酸代谢K00933肌酸精氨酸和脯氨酸代谢氨基酸代谢表7，得出中青年高血压病痰湿壅盛证与阴虚阳亢证之间显著性差异的代谢物主要涉及到的代谢途径为氨基酸代谢、糖代谢、脂代谢、核酸代谢等。图3.6痰湿壅盛组（C组）与阴虚阳亢组（D组）的permutation检测图图3.6可以得出中青年高血压病痰湿壅盛组与阴虚阳亢组对比的模型水平尚可。27 福建医科大学硕士学位论文2一般情况及生化指标结果表8四组一般情况的比较项目A组（n=15）B组（n=14）C组（n=14）D组（n=6）*年龄（岁）47.07±9.2253.64±5.5749.00±8.2056.00±3.35****体重（Kg）59.27±10.1262.18±7.9968.86±8.3457.67±7.452**BMI（kg/m）21.52±2.9223.02±2.8824.86±2.9922.30±1.75体脂肪含量（%）26.93±7.3530.89±7.1929.70±6.7132.79±4.34***注：与对照组相比，p＜0.05；与痰湿壅盛组相比，p＜0.05。表8显示,痰湿壅盛组（C组）与对照组（A组）、阴虚阳亢组（D组）相比，体重有显著性差异（p＜0.05），显示痰湿壅盛组患者体重比健康志愿者组、阴虚阳亢组高。痰湿壅盛组（C组）与对照组（A组）相比，BMI有显著性差异（p＜0.05），显示痰湿壅盛组患者BMI较对照组高，并得出中青年高血压病痰湿壅盛组患者BMI均值已达到亚洲超重标准，并趋于肥胖。对照组（A组）与阴虚阳亢组（D组）相比，年龄有显著性差异（p＜0.05），显示阴虚阳亢组患者年龄较对照组大。体脂肪含量在四组之间未见显著性差异。表9四组生化指标的比较项目A组（n=15）B组（n=14）C组（n=14）D组（n=6）*TC（mmol/L）4.81±O.695.64±0.775.09±0.935.98±1.56*TG（mmol/L）1.01±0.611.23±0.452.03±1.051.80±1.14LDL-C(mmol/L)2.87±0.713.71±0.953.25±0.703.63±1.19******UA（umol/L）313.76±77.89292.24±54.56400.99±97.97279.23±59.54******FINS（pmol/L）48.07±15.4749.80±17.5177.83±24.4055.02±17.69*FCP（nmol/L）0.54±0.110.71±0.350.90±0.180.72±0.22***注：与对照组相比，p<0.05；与痰湿壅盛组相比，p<0.05。表9显示对照组（A组）与痰湿壅盛组（C组）相比，TG、UA、FINS、FCP均有显著性差异（p＜0.05）。痰湿壅盛组（C组）与肝火亢盛组（B组）、阴虚阳亢组（D组）相比，UA、FINS均有显著性差异（p＜0.05）。对照组（A组）与阴虚阳亢组（D组）相比，TC有显著性差异（p＜0.05）。LDL-C在四28 福建医科大学硕士学位论文组之间未见明显差异。表9提示在四组中，存在血尿酸代谢障碍和空腹胰岛素水平异常以痰湿壅盛组为主。讨论1尿液代谢组学生物标志物的内涵分析1.1代谢组学代谢组学是综合运用多种化学信息学技术来分析研究内源性代谢产物，如血浆、尿液、组织液等生物体体液，它是可以应用LC-MS、GC-MS、CE-MS以及NMR等现代仪器分析检测鉴定的一种手段。当机体在内外环境中发生变化时，其代谢物水平通常会做出相应的应答，故可通过对其代谢组的差异进行分析从而获得相应的生物标志物群，以此来揭示在特定时间、空间下生物体的整体功能状态。代谢组学相较于其他方法而言，在样品制备上更具简便性，在后期数据分析上更具全面性。因此，常常作为一些复杂疾病、重大疾病病因病机等方面的研究手段，目前已经应用于糖尿病、糖尿病肾病、心血管疾病的机制以及标志物等的研究。1.2代谢组学与中医证候的关联中医学有“有诸内必形诸外”、“整体观”等思维理念，中医学可以通过外在的证候表现来对处在某一特定阶段的机体进行诊断分析，以明确机体整体的病理生理状态。而代谢组学的核心是研究生物体对内外源性物质所产生的整体效应，可以通过对其代谢物的检测分析来实时体现生物体现阶段的整体功能状态，从此方面来看，两者具有明显一致性。另一方面，中医学运用“望、闻、问、切”四诊的方法来进行诊断，这种“视其外应，以知其内脏，则知所病矣”的方法就类似于“黑箱理论”，而代谢组学所检测分析的代谢物，也是生物体对于内外环境影响后导致的最终结果，也是从最终的结果来推测机体的功能状态，两者都只能关注到黑箱外侧显露出来的表象，而不能通过这种表象来清晰地推测黑箱子里面发生的各种变化。从这些方面综合来看，运用代谢组学的理念与方法来进行中医“证”本质的研究具有可行性，是“四诊”范围的延伸，具有重要的现实意义。早在两千多年前，《黄帝内经》就提出：“上医治未病，中医治欲病，下医29 福建医科大学硕士学位论文治已病”，这就警戒后人医术最高明的医生是能够预防疾病的人，而不是擅长治病的人。目前对于高血压病的发病机制尚缺乏有效的检测分析手段，对于高血压病患者机体的代谢过程尚不明了，所以目前治疗高血压病尚停留在治标阶段，未能达到“上医治未病”的境界。基于代谢组学这门新兴技术，分析高血压病患者机体内部的异常代谢变化，以及不同中医证型之间的代谢物标志的区别。BrindleJT等发现临界的高血压（140mmHg＞收缩压＞130mmHg）患者与高血压病患者都可能是先出现机体代谢紊乱，后引起血压升高。所以如若我们可在机体出现代谢紊乱时早期进行干预，可达到“中医治欲病”的效果，甚至可达到“上医治未病”的功效。1.3高血压病痰湿壅盛证代谢组学分析1根据本实验运用HNMR来检测痰湿壅盛组、阴虚阳亢组、肝火亢盛组及对照组四组的代谢物所得出的结果，我们可以建立中青年高血压病痰湿壅盛证的生物标志物群：尿素、柠檬酸盐、乙醇胺、谷氨酰胺、π-甲基组氨酸、肌酸。其中痰湿壅盛证尿素较对照组升高，柠檬酸盐、乙醇铵、谷氨酰胺、π-甲基组氨酸、肌酸均较对照组降低。中青年高血压病痰湿壅盛证与肝火亢盛证有显著性差异的化合物：尿素、肌酐、乙醇胺、肌酸、马尿酸、苯丙氨酸。其中痰湿壅盛证尿素高于肝火亢盛证，肌酐、乙醇胺、肌酸、马尿酸、苯丙氨酸均低于肝火亢盛证。中青年高血压病痰湿壅盛证与阴虚阳亢证有显著性差异的化合物：尿素、肌酐、乙醇胺、氧化三甲胺、谷氨酰胺、肌酸。其中痰湿壅盛证尿素、氧化三甲胺较阴虚阳亢证升高，肌酐、乙醇胺、谷氨酰胺、肌酸较阴虚阳亢证降低。氨基酸、糖类、脂类三大代谢及嘌呤代谢等途径的异常可使机体内源性成分改变，我们可以通过分析其内源性代谢物甚至其代谢物含量的变化，来进一步研究高血压病痰湿壅盛证的生物学本质。早期就有文献提出高血压病可能是一种遗传性氨基酸代谢异常的疾患。本实验结果中发现中青年高血压病痰湿壅盛证与对照组确实存在许多氨基酸代谢途径的异常，如精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸等。也有文献得出中青年高血压病患者较健康人群容易出现糖代谢异常。血压的异常与血脂代谢的紊乱之间存在密切的关系。其研究结果与本实验也大致相一致。痰湿壅盛证患者大多喜食酒肉肥甘等高脂高嘌呤饮食，长期摄入高30 福建医科大学硕士学位论文脂饮食可导致体内代谢紊乱，出现明显胰岛素抵抗及脂代谢紊乱，诱发高脂血症、肥胖、高血压等疾病；高嘌呤饮食易引起高尿酸血症，血尿酸水平与代谢综合征及其各组分(肥胖、血脂异常、高血压、血糖异常)之间关系密切。尿素的代谢途径包括精氨酸和脯氨酸的代谢，尿素是机体内部氨基酸代谢分解的主要含氮终产物，其过程为氨基酸的分解代谢过程，即脱氨基作用，该过程生成含氮化合物和不含氮部分，前者转化为尿素，后者转化为糖类或脂肪；尿素的代谢途径也包括嘌呤代谢途径。本实验结果得出病痰湿壅盛组与其余三组对比，尿素显著增高，说明痰湿壅盛证患者氨基酸和（或）嘌呤代谢等途径其间必然有一环节存在异常，其结果与本实验生化指标比较中尿酸均较其他组显著增高相一致。考虑其原因可能与当代中青年大多喜饮酒、吃肉等高嘌呤、高蛋白食物有关，当机体出现嘌呤或氨基酸代谢异常时，可引起尿素堆积，而过食肥甘厚腻，易致机体内生痰湿，导致痰湿阻滞，故痰湿壅盛证患者尿素显著高于其他三组。目前我们尚不能明确高血压病痰湿壅盛证其尿素代谢异常的具体过程，尚待以后进一步研究证明。柠檬酸盐是柠檬酸与水中碳酸盐作用生成。三羧酸循环是糖类、脂类、氨基酸的最终代谢通路及互相联系的枢纽，机体主要通过该循环来获得能量。而柠檬酸是该循环中主要的中间代谢物。柠檬酸盐还涉及到乙醛酸循环，乙醛酸循环和三羧酸循环中存在着某些相同的酶类和中间产物，其中乙酰CoA占重要位置，而乙酰CoA是经过脂肪酸氧化分解的产物，故可以推测脂肪酸代谢异常可能是血压升高的一个重要点，这与国外学者得出的结果一致，今后我们可以针对脂肪酸代谢进行深入研究。本实验结果与健康人相比,中青年高血压痰湿壅盛证尿液中柠檬酸盐含量相对较低，可能体内乙醛酸循环和三羧酸循环中间的环节出现障碍，机体内能量代谢紊乱有关，当大量脂肪酸氧化分解时,可能导致体内酸性物质沉积，体内酸中毒可导致柠檬酸盐的重吸收增加,使尿中的柠檬酸盐排出减少；酸性物质沉积还可抑制氧化酶类的活性,导致中间产物柠檬酸等在体内堆积,使其在尿液中的水平降低。Akira、Fujiwara等也都提出高血压大鼠尿样中柠檬酸盐水平显著较低。与本结果相类似。脂肪酸氧化分解后产生乙酰CoA，乙酰CoA一方面可参与三羧酸循环的氧化供能，另一方面还可作为一些脂类的原料。其与本实验得出的高血压31 福建医科大学硕士学位论文病痰湿壅盛证血脂较对照组高这一结果相一致。乙醇胺与甘油磷脂代谢相关，其可与磷脂酸合成磷脂酰乙醇胺，俗称脑磷脂，在体内肝脏中，通过腺苷蛋氨酸提供甲基，磷脂酰乙醇胺可转变为磷脂酰胆碱，在血液中，胆固醇和脂肪酸可被磷脂酰胆碱化为极细的颗粒，继而从血管中排出，使血管中血流通畅，血管弹性恢复，故磷脂酰胆碱被誉为“血管清道夫”；乙醇胺还为合成扩张血管和降压药物的原料，故我们可以推测若机体内乙醇胺降低，可间接导致血液中的胆固醇和脂肪酸沉积，血管阻力增高，最终引起血压升高。其可能是本实验得出高血压病痰湿壅盛证乙醇胺低于对照组的原因。本实验还得出痰湿壅盛证组乙醇胺较肝火亢盛组及阴虚阳亢组显著降低，乙醇胺与脂类代谢相关，说明痰湿壅盛证患者普遍存在脂类代谢显著异常，此与国内部分学者得出的结果相类似，故我们可以推测“痰浊”之邪对脂类代谢影响大。谷氨酰胺可由谷氨酸、缬氨酸、异亮氨酸合成，属于非必需氨基酸。经过KEGG数据库分析得出谷氨酰胺还与丙氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸和脯氨酸等氨基酸代谢有关，故中青年高血压病痰湿壅盛组较对照组及阴虚阳亢组谷氨酰胺均降低与其氨基酸代谢异常密不可分。痰湿壅盛证患者常常高脂高糖饮食，近年来已有不少国内外医家均提出高脂饮食会引起氨基酸代谢异常，故痰湿壅盛证患者易出现氨基酸代谢异常。谷氨酰胺有控制食欲，减少脂肪，改善身体比例的作用，痰湿壅盛证患者有可能因为谷氨酰胺的减少，导致机体食欲过胜，合成脂肪增加，造成肥胖，此结果也与本实验一般情况比较中痰湿壅盛证体重较对照组及阴虚阳亢组显著增高相符合。π-甲基组氨酸大量存在肌肉中，甲基组氨酸上的甲基是由S-腺苷酰甲硫氨酸提供的。运动后尿中的甲基组氨酸增加，本实验结果中高血压病痰湿壅盛证组π-甲基组氨酸较对照组明显降低，其原因可能与中青年高血压病痰湿壅盛证组患者缺乏运动有关，尚待进一步研究。肌酸主要存在部位为体内的骨骼肌与心肌。人体的主要能量代谢依靠ATP，即三磷酸腺苷。当人体在运动时，ATP消耗迅速，此时肌酸可迅速转化成ATP提供能量。痰湿壅盛证患者肌酸均较其他三组显著降低，推测其中一方面原因可能为中青年高血压病痰湿壅盛证患者不良生活习惯有关，其常常缺乏32 福建医科大学硕士学位论文运动，久而久之，能量代谢异常；另一方面可能与氨基酸代谢异常有关，精氨酸、甘氨酸及甲硫氨酸在体内可以共同合成肌酸，其中甲硫氨酸又称蛋氨酸，是机体必需氨基酸，需由外部获得，蛋氨酸含量较丰富的食物有：酵母、海藻类、叶类蔬菜、芝麻、葵花子、乳制品等。痰湿壅盛病人常喜食肥甘厚腻，饮食结构中上述成分比例低，故可能造成体内蛋氨酸的缺乏，精氨酸及甘氨酸为非必须氨基酸，机内氨基酸代谢紊乱可能导致其生成异常，从而在来源上减少肌酸的生成。肌酐是肌肉代谢的产物，本实验结果得出中青年高血压病痰湿壅盛证患者肌酐与对照组不存在显著差异，但显著低于肝火亢盛证与阴虚阳亢证，其可能原因为肝火亢盛证与阴虚阳亢证均存在“热”的表现，以热为主，可能引起尿中的肌酐较痰湿壅盛证高。马尿酸、苯丙氨酸等通过KEGG数据库查阅，均涉及到氨基酸代谢。正常情况下，人类尿液中会含有少量的马尿酸，马尿酸为消化道微生物的腐败产物。苯丙氨酸是存在所有蛋白质中的天然必需成分，属于必需氨基酸，需要通过食物补充，否则人体机能就不能正常运转。故可以推测痰湿壅盛证组马尿酸、苯丙氨酸较肝火亢盛证组低可能与饮食有关，尚待进一步研究。氧化三甲胺是反映肾脏问题的一种生物标志物，本实验得出中青年高血压病痰湿壅盛组氧化三甲胺较阴虚阳亢组高，考虑到本次纳入的49例患者均生活在福建省，福建属于沿海地区，大部分人群常进食鱼类等海产品，而氧化三甲胺广泛分布于海产鱼类的肌肉中，故可导致机体尿液中氧化三甲胺的增高，加之阴虚阳亢证纳入病人较少，可能存在抽样误差，可待今后进行大样本研究。代谢组学使我们更深入了解和认识到中青年高血压病的代谢物变化，为我们进行高血压病早期干预提供了证据，使之更有说服力，提高中青年高血压病患病群体的警惕性，警示中青年高血压病患者应合理膳食结构，改变不良生活习惯，加强对高血压病防治的重视。本实验在中青年高血压病痰湿壅盛证与肝火亢盛证、阴虚阳亢证之间对比得出显著性差异的代谢物的代谢途径以三大代谢及嘌呤代谢途径为主，虽然目前尚缺乏三大代谢及嘌呤代谢途径与高血压病不同中医证型的相关性研究，但其也为中青年高血压病痰湿壅盛证的标准化研究提出了明确的方向，未来可以进一步朝这个方向做深入研究。33 福建医科大学硕士学位论文2高血压病痰湿壅盛证与危险因素的关系2.1体重、体重指数从上述表8中可以看出，中青年高血压病痰湿壅盛组患者体重、BMI均较对照组显著升高（p＜0.05），并且痰湿壅盛组患者BMI均值已达到亚洲超重标准，并趋于肥胖。此结果与之前查阅的其他高血压病医家的研究结果大致一致。当前社会经济发展迅速，社会竞争激烈，大部分中青年人群处于这样的生活环境中，加之其不良的生活及饮食习惯与运动量的缺乏，常常使他们成为高血压病的易患人群。流行病学调查显示近年来中青年高血压病患者存在逐年增多的趋势。有文献得出中心性肥胖、BMI增高是原发性高血压主要的危险因素（p＜0.01）。此与本研究结果也较一致。中国古代历代医家也均在其著作上明确指出肥胖与痰湿之间的密切关系。元代朱丹溪最先提出“肥白人多痰湿”的观点。众所周知，南宋医家杨仁斋在《仁斋直指方》中提出：“肥人气虚生寒，寒生湿，湿生痰⋯⋯故肥人多寒湿”。这就说明肥胖人多痰湿的根本原因是“气虚生寒”。清代《张聿青医案》明确指出：“形体丰者多湿多痰”。诸如此类的古代医学论述均为各大医家的临床实践的宝贵经验得出。高血压病在中医中属于“眩晕”、“头痛”等范畴，元代朱丹溪在《丹溪心法》中记录：“无痰不作眩”，指出无火不生痰，痰随火上，故曰无痰不作眩。2.2血脂从上述表9提示，中青年高血压病痰湿壅盛证甘油三酯较对照组显著增高（p＜0.05）。众所周知，高血压与高血脂共同属于心脑血管疾病的“三高”危险因素之列，两病的病因具有相同点，不良的生活方式，过食肥甘厚腻等原因均可使之发病风险升高；当血液中的血脂升高时，易沉积在血管壁，可引起血液粘稠度增高和血流阻力增加，这些因素综合导致动脉粥样硬化，进而引起血压增高。张彬等提出高血压与高血脂患病呈显著相关性。早期国外就有学者表明有高甘油三酯水平的个体收缩压与舒张压有着显著增高。后国内医家也提出高甘油三酯血症者更易患高血压，且随着甘油三酯水平升高，高血压病的发生率呈增高趋势。与本研究结果存在相似性。古代中医早已对高脂血症有一定的认识，如《素问·通评虚实论》曰：“凡治消瘅仆击,偏枯痿厥,34 福建医科大学硕士学位论文气满发逆,甘肥贵人,则膏粱之疾也。”中医上认为高脂血症的病机为本虚标实，本虚主要为肝肾阴虚、脾肾阳虚及气阴两虚；标实主要为痰浊、瘀血。病位在肝、脾、肾。痰湿壅盛证患者大部分喜食膏粱厚味，脾胃受损，脾失健运，分清泌浊的功能衰退，水湿运化失常，停留为饮，凝聚为痰，痰湿积聚于内酿为脂膏，进入脉管中，引起高脂血症，进而引起血压升高，故痰湿壅盛证、高脂血症及高血压病有密切的联系。2.3血尿酸从上述表9可得出，痰湿壅盛组血尿酸水平较其他三组显著增高（p＜0.05）。当机体内核酸氧化分解产生嘌呤后，在肝脏中嘌呤氧化成尿酸，为2，6，8--三氧嘌呤，其中的嘌呤环没有被解开。2/3的尿酸是经肾脏通过尿液排出体外，1/3是随着粪便和汗液排出。当尿酸生成增多或排出减少时，血液中尿酸含量升高，尿酸结晶析出，沉积在血管壁上，损伤血管内膜，引起动脉硬化，其还可通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统的异常激活等方面来升高血压。然而目前高尿酸血症与高血压病的关系有待进一步证实，各大医家根据多年的临床经验与科研钻研均得出可信度较高的结论。牟建军总结了各大医家的学术探讨：迟相林从病理生理学及代谢综合征等角度来看提出高尿酸血症和高血压是互为危险因素；吴寿岭等通过分析国内外流行病学资料和临床研究得出高尿酸血症为原发性高血压独立危险因素。从中医学角度分析，现今中青年高血压病痰湿壅盛证患者大多偏向于嗜食酒肉肥甘等高嘌呤饮食，一方面易致机体内生痰湿，痰湿阻滞；另一方面痰湿郁久可化热，考虑血尿酸水平升高的机制可能与痰湿阻滞等有关。国内一些医家也明确提出尿酸水平确与中医分型存在内在联系。湿热质、痰湿质是原发性高尿酸血症人群的主要偏颇体质类型。徐邦杰等发现原发性高血压痰湿壅盛证患者血尿酸高于阴虚阳亢证及肝火亢盛证。与本实验结果一致。2.4空腹胰岛素及C肽水平从上述表9中可以看出中青年高血压病痰湿壅盛证空腹胰岛素水平较其他三组显著增高（p＜0.05），痰湿壅盛证组C肽均比对照组显著增高（p＜0.05）。从本实验结果中还可以看出，甘油三酯与胰岛素水平在高血压病痰湿壅盛证组与对照组对比中均显著增高。机体周围组织中胰岛素不敏感会引起肌35 福建医科大学硕士学位论文肉中胰岛素效应减弱，抑制脂肪组织的脂解。当脂肪组织中的胰岛素抵抗时，血液中甘油三酯和游离脂肪酸浓度增高，可引起相关代谢途径异常，发生代谢物的变化。高胰岛素血症会引起血管内皮细胞的损害，造成血小板的聚集，使血液容易凝集；还可使交感神经系统被过度激活，血管痉挛，增加血管阻力，使原发性高血压发生率大大提高。有研究结果显示血压值与FINS呈正相关（p＜0.05）。叶德寿等研究显示，高血压病患者的FINS水平明显高于对照组，并得出“胰岛素抵抗是高血压病的重要危险因素”这个结论。在中医方面，古代有《素问·通评虚实论》曰：“消瘅、仆击、偏枯⋯⋯肥贵人，则膏粱之疾也”，《素问·奇病论》曰：“此肥美之所发也。此人必数食甘美而多肥，肥者令人内热，甘者令人中满⋯⋯转为消渴”等论述。其揭示了痰湿壅盛证与高胰岛素血症的关系。痰湿壅盛证患者常长期过食肥甘，醇酒厚味，饮食失节，导致脾胃受损，脾胃运化失司，积热内蕴，津液耗损，可导致胰岛素水平增高。现代医家经过实验提出空腹胰岛素水平在痰湿壅盛证较其他非痰湿壅盛证型高，痰湿体质潜在的病理机制可能为胰岛素抵抗。3问题与展望本文仅初步探讨了中青年高血压病痰湿壅盛证的代谢组学研究,及其中医证候与临床指标之间的关系。虽然得到一定的进展,但仍存在不少困难与问题：由于时间的限制，收集到的病例数较少，特别是高血压病阴虚阳亢证，使其存在抽样误差，导致结果重复性欠佳；还有一方面是主观性问题，高血压病中医分型虽由副主任及其以上级别的医师进行判定，但仍然无法避免存在主观性问题，其也可能致实验的重复性欠佳。故在今后的实验工作中我们应开展前瞻性、系统性、深层次的大样本研究，运用中医证候积分量表来较客观的判别中医证型，使辩证量化，减少主观性因素造成的偏差，确立高血压病痰湿壅盛证的客观化动态诊断指标，用以指导临床。中医药是中华民族具有几千年历史的瑰宝。代谢组学作为一门新兴的技术，由于其与中医药学在学术内涵上具有相通性,故可用于高血压病中医“证”的研究，为高血压病的中西医结合诊治提供一个良好的平台。我们，作为新一代的中医科研工作者,应该更深入地思考未来中医事业的发展,力争让更多人群更深层次地认识中医学,让中医学更好地为人类的健康作出贡献。36 福建医科大学硕士学位论文结论1.运用代谢组学方法可以区分中青年高血压病痰湿壅盛证和肝火亢盛证、阴虚阳亢证、健康人群。2.初步得出中青年高血压病痰湿壅盛证的代谢组学生物标志物群：尿素、柠檬酸盐、乙醇胺、π-甲基组氨酸、谷氨酰胺、肌酸。其主要与三大代谢及嘌呤代谢关系密切，可能与高脂饮食及高嘌呤饮食有关。3.通过对痰湿壅盛组与其他组别一般情况与生化指标的比较，得出血尿酸、空腹胰岛素水平在区分中青年高血压病痰湿壅盛组与其他组别时具有一定参考意义。37 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福建医科大学硕士学位论文基于代谢组学高血压病“证”的本质研究陈玲珊（综述），陈金水（审校）摘要高血压病是临床常见病、多发病，近年来患病率逐渐上升。“证”是对疾病过程中所处的一定（当前）阶段病位、病性等病理本质所作的概括。代谢组学通过代谢物的变化实时表达外源性扰动带来的功能变化，其整体性及动态的功能性与中医证候对病理状态的表达理念相吻合，可应用于分析中医证候的内源性代谢产物，阐明高血压病“证”的本质。本文综述了近年来基于代谢组学高血压病不同证型的比较研究，并对前景进行展望。关键词高血压，代谢组学，中医证候AbstractHypertensionisacommonclinicaldisease,prevalencerateincreasedgraduallyinrecentyears."Syndrome"isthesummarythatistheprocessofcertaindiseasesinthe(current)stageofdiseaselocation,diseaseofpathologicalnature.Metabonomicchangesthroughrealtimeexpressionofexogenousdisturbancebringsfeaturesmetabolitechanges,expressionofideasoffunctionalandTCMsyndromesinitsentiretyanddynamicstateofpathologyisconsistent,endogenousmetabolitescanbeappliedtotheanalysisofsyndromesoftraditionalChineseMedicine,clarifiestheessenceofhypertensivedisease's"syndrome".Thispassagereviewscomparativestudiesofdifferentsyndromesofhypertensionbasedonmetabonomicinrecentyears,andmakesaprospect.KeyWordshypertension,metabonomic,TCMsyndrome高血压病又称原发性高血压，是临床常见病、多发病,是心脑血管事件的主要促危因素,是致残与死亡的重要诱因，它具有发病率高、并发症多等特点，严重危害患者健康，已引起广泛的重视。有关研究证实在高血压患者中普遍存在体内代谢紊乱，故代谢组学可成为揭示高血压病“证”本质的强有力手段。1.高血压病1.1流行病学研究资料显示，从1980-1991年的10年间，我国人群高血压患病率上升了4.15％，绝对值增长了54.00％，而且这种快速增长的趋势还在继续。文献报道，近50年来，我国高血压的患病率一直在呈明显的上升趋势，42 福建医科大学硕士学位论文根据2002年中国居民营养及健康状况的报告调查数据，我国18岁以上成人高血压患病率为18.8%，估计全国患病人数约1.6亿，与1991年相比较，患病率上升了31%，患病人数增加了约7000多万人。根据国家心血管病中心估计现全国高血压病患者已达2.7亿。目前我国高血压患病率为29.6％，所有高血压患者中，知晓率、治疗率和控制率分别为42.6％、34.1％和9.3％，达标率为27.4％；并且得出高血压患病率与多种生活方式有关，包括饮酒、较高体重指数等。因此可看出高血压病的防治仍然任重道远。1.2高血压病中医证型2002年卫生部颁布的《中药新药高血压病临床研究指导原则》中将高血压分为肝火亢盛、阴虚阳亢、痰湿壅盛和阴阳两虚四种证型。目前，众医家对于高血压病中医分型不一，谷万里等采用多中心、大样本的临床流行病学调查方法，选取中国北、中、南3个地区的原发性高血压患者，通过运用聚类分析方法，得出各证型的分布情况为痰湿壅盛（27.1％），肝阳上亢（24.1％），心肾气虚（10.1％），阴阳两虚（8.4％），瘀血阻络（9.0％）。唐兴荣等通过对广东省江门市2050位高血压病人群进行流行病学研究，得出中医证型中痰湿壅盛型＞肝阳上亢型＞阴虚阳亢型＞阴阳两虚型＞脾肾阳虚型。张荣珍等将安徽省3578例原发性高血压患者辨证分为：肝火亢盛型965例（27％），阴虚阳亢型795例（22％），阴阳两虚型535例（15％），痰湿壅盛型932例（26％），未定型351例（10％）。而陈广垠等根据《中药新药临床研究指导原则(试行)》对260例原发性高血压患者进行辨证分型，得出肝火亢盛证56例（21.5％），阴虚阳亢证77例（29.6％），痰湿壅盛证73例（28.1％），阴阳两虚证54例（20.8％）。2.代谢组学12.1定义代谢组学是应用LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS以及HNMR等分析检测鉴定的一种手段。其综合运用多种化学信息学技术，研究内源性代谢产物，如血浆、尿液、组织液等生物体体液，通过对不同状态下生物体的代谢组的差异进行分析而获得相应的生物标志物群，揭示了生物体在特定时间、环境下的整体功能状态。代谢物是生命活动的最终产物，代谢物的水平可以被看作是基因或环境发生变化时生物体作出的最终的应答，代谢组学作为系统生物学的终点，其精髓就是以整体论方法研究生物体系中的构件分子族之间以及机体与环43 福建医科大学硕士学位论文境之间的相互作用网络。2.2代谢组学与中医证候2.2.1中医证候当代中医学对于“证”的定义：证是对疾病过程中所处的一定（当前）阶段病位、病性等病理本质所作的概括。证是对致病因素与机体反应两方面情况的综合，是对疾病中机体整体动态反应状态所作的结论。“证”实际包括证名、证候、证型等概念。而临床上有时又将证称为“证候”，即证为症候的简称。但严格地说，证候为证的外候。证候包括了病因、病性、病位及正邪盛衰关系，反映出疾病发展过程中一定阶段的病理变化本质，因此证比症状能更全面、更深刻，更准确地揭示出疾病的本质。2.2.2代谢组学与中医证候的关联中医学有“有诸内必形诸外”、“视其外应，以知其内脏，则知所病矣”、“整体观”等思维理念。其精髓在于以整体的、动态的和辨证的观念去辨别和诊断人是否健康，而代谢组学的核心是研究外源性物质对生物体所产生的整体效应，从这个意义上来看，两者是相一致的。代谢组学作为系统生物的组成部分，能够多层次、多靶点、动态性地研究和表达集体的功能状态，可以通过代谢物的变化实时表达外源性扰动带来的功能变化，其整体性及动态的功能性与中医证候对病理状态的表达理念相吻合。因此，将代谢组学理念与方法引入中医证本质研究具有重要的现实意义。罗和古等基于代谢组学的理念，提出“证是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反应的一种功能状态，其外候表现为一组有相互关联的症状和体征群，其本质是机体失衡而致的代谢或其网路的改变”。代谢组学与中医药相结合是使中医现代化的新途径和新方法。总而言之，随着代谢组学分析技术的进一步发展，特别是多分析技术方法，我们可以热切期待着代谢组学将极大促进中医药研究，并建立国际标准，为中医药实现现代化创造有利条件。3．代谢组学对高血压病“证”本质的研究3.1代谢组学对高血压证型的研究3.1.1肝阳上亢证蒋海强等通过对高血压病肝阳上亢证患者和健康志1愿者尿液和血液样本进行HNMR分析发现，前者机体相关代谢发生显著变化，1体内氨基酸、葡萄糖代谢明显异于后者，并得出结论，HNMR结合PCA模式识别的代谢组学方法具有研究复杂条件下机体病理生理变化的优势，为理解高血压44 福建医科大学硕士学位论文病肝阳上亢证的症候本质和诊断提供了科学依据。3.1.2痰湿壅盛证董海琪通过对15例高血压病痰湿壅盛证患者和20例对照组血液样本进行MS测定，初步得出高血压病痰湿壅盛组的代谢组学生物标志物群即:尿素氮，肌酐，尿酸，谷氨酸，缬氨酸，γ-生育酚，单十六醛丙三醇，β-右旋-6吡喃(型)葡萄糖。说明高血压病痰湿壅盛证与健康人之间的确存在物质基础的差异，运用代谢组学的研究方法可以成功区分高血压病痰湿壅盛组和正常对照组。3.1.3阴虚阳亢证朱嘉等通过对17例高血压病阴虚阳亢证患者和21例健康志愿者血液样本进行MS测定，提示两组之间存在有显著性差异的化合物，其中能鉴定出的化合物有：草酸、丁酸、缬氨酸、尿素、磷酸盐、苏氨酸、天冬氨酸、肌酸酐、鸟氨酸、硬脂酸、十六烷酸、单软脂酸甘油酯、γ-生育酚、胆固醇。并得出结论：代谢组学方法能将高血压病阴虚阳亢证患者与健康人群区分开来，能够找寻到诊断高血压病阴虚阳亢证的生物标志物并形成生物标志物群。3.2代谢组学对高血压不同证型的比较研究3.2.1肝阳上亢证与阴阳两虚证杨传华等通过对26例高血压病患者（肝阳上亢证12例，阴阳两虚证14例），14名健康志愿者的血液样本进行液质联用技术分析，发现两种证型的代谢存在较大差异，能够很好地区分高血压病肝阳上亢证和阴阳两虚证的代谢模式。在两种证候中代谢趋势不同的雌二醇、白三烯、葡萄糖神经酰胺、神经酰胺、甘油三酯及甘油二酯或能成为两种高血压病证候的鉴别点。3.2.2阴虚阳亢证与痰湿壅盛证朱海鹏通过对32例高血压病患者（阴虚阳亢证20例、痰湿壅盛证12例），22例健康人血液样本进行MS测定，得出高血压病阴虚阳亢组与痰湿壅盛组的代谢产物主成分存在差异，有差异的化合物为果糖、柠檬酸盐盐、乳酸盐、乙醇胺，虽尚不足以用于两证型的鉴别，但可得出代谢组学有望为诊断及辨别高血压病中医证型提供明确的物质依据。3.2.3肝火亢盛证与阴虚阳亢证陈艺等运用GC/TOF-MS技术对血清代谢组学分析，发现高血压病肝火亢盛证组与病阴虚阳亢组在主成分得分三维图上有一定差异，能鉴定出的差异化合物有：柠檬酸盐盐、草酸盐、二氧化庚酸、45 福建医科大学硕士学位论文甘油酸盐、软酸盐、门冬氨酸、苏丁糖酸、软脂酸。得出代谢组学能区分高血压病肝火亢盛证组与阴虚阳亢证组，两证型间确实存在生物标志物的差异，有望为高血压病的中医辩证分型提供一定得客观依据。3.2.4肝火亢盛证、痰湿壅盛证及阴虚阳亢证黄丹通过用代谢组学的方法对同样的血样进行检测、分析、比较，初步得出脯氨酸、焦谷氨酸、丁胺等19种化合物为高血压病肝火亢盛证的潜在生物标志物；尿酸、赤藓醇、1-单油酰基甘油酯等22种化合物为痰湿壅盛证的潜在生物标志物；苏糖、甲基葡萄糖苷、氨基丁酸等23种化合物为阴虚阳亢证的潜在生物标志物。发现柠檬酸盐、a-酮戊二酸、丙氨酸等27种化合物可作为鉴别正常人与高血压患者的潜在生物标志物群。并得出代谢组学能很好的区分高血压病肝火亢盛证、痰湿壅盛证及阴虚阳亢证。陆益红等对33例原发性高血压患者（肝火亢盛证17例、痰湿雍盛证8例及阴虚阳亢证8例）及32例健康人的血清内源性代谢物进行GC/MS测定，也得出高血压病患者与健康人的血清代谢物谱具有明显差异，能够被分开，进一步采用马氏距离分析法不仅可清晰区分3种不同证型的高血压，同时还显示高血压的发展过程。4.展望高血压病是一种多基因、多因素、异质性的复杂疾病，至今病因及机制仍不十分明确。代谢组学作为一种较为全面系统的研究技术，在方法学上具有融整体、动态、综合、分析于一体的特点，符合中医整体性原则。中医病证引起代谢物组的共性分析和生物标记物的发现，可促进“证”本质的研究、中医辨证的科学化和定量化。故可将代谢组学广泛运用于探讨高血压“证”的研1究中，采用临床和实验研究结合等方式，运用HNMR分析、色谱与质谱联用等方法来分析样品的代谢物，应该可以更清晰准确地描述高血压病相关中医证型“证”的本质。在代谢组学对高血压病领域的研究方面，今后应多开展大样本、多中心的研究，从而为高血压病的中医临床防治和中西医结合研究工作提供进一步的理论证据。相信在不久的将来，代谢组学将推动中医学的发展，使其不断完善，为人类健康事业做出伟大贡献。46 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