血清蛋白质组HPLC指纹图谱快速检测方法的建立及其临床应用

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1、学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。学位论文作者签名：嘬藏淑Et期：矽t；．j．哆学位论文使用授权声明研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属南京师范大学。学校有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以采用影印、复印等手段保存、汇编本学位论文。学校可以向国家有关机关或

2、机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。(保密论文在解密后遵守此规定)保密论文注释：本学位论文属于保密论文，密级：——保密期限为——年。学位论文作者签名：榷瓤日期：矽成s．哆?燧詈声良日期：97,o、3．S．易摘要由于目前临床上常用的肿瘤标志物(tumormarker，TM)其特异性和敏感度并不理想，因此学者开始采用血清蛋白质组学技术来寻找肿瘤特异的血清蛋白质标志物，希望为疾病的诊断或治疗提供新的依据，该技术在筛选不同癌症的血清TM研究中已取得了一些成果，是具有研究价值和应用前景的一项技术。本课题旨在以肺癌患者为研究对象，利用高效液相色谱(highperf

3、ormanceliquidchromatography，HPLC)技术建立一个HPLC指纹图谱快速检测方法，用于前期大规模的处理分析血清样品，寻找到肺癌患者与健康体检者之间存在的差异蛋白峰，快速筛选出疑似肺癌患者，然后针对疑似病例做进一步差异蛋白质定量分析、临床病理学、医学影像学等相关检测分析，并最终确诊。本实验通过研究HPLC分离条件，比较在不同固定相和流动相条件下获得的蛋白质图谱，最终确定了分离条件为色谱柱：LichrospherA85-3(300nmx4．6nnlI．D．：7p．m)；流动相洗脱条件：0—30min，5-80％B、30—35min，80-95％B

4、、35-45min，95．95％B线性梯度洗脱；流动相组成：A相为含0．1％磷酸和0．05％三氟乙酸(trifluoroaceticacid，TFA)的水溶液、B相为含0．05％磷酸和O．05％TFA的乙腈溶液；检测波长：214nln：流速：1ml／min；色谱分离温度：22oC；定量管体积：20p1。该条件下获得的蛋白质图谱中蛋白峰可以完全分离，图谱所含数量信息较多，检测灵敏度较高，用时适中且基线也较为水平。另外实验还建立了去除人血清中清蛋白等高丰度蛋白质(highabundanceproteins，HAP)的甲醇沉淀法，相关研究尚未见报道。实验结果表明，血清：甲醇

5、为l：2(v／v)时，应用十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS．PAGE)验证清蛋白的去除效果和重复性较好。统计学分析结果表明经本法去除后，血清中清蛋白浓度显著降低，由(47．65士0．35)g／L下降为(1．16+0．08)g／L，去除率达97％以上，占血清总蛋白的比例由65．4％下降为49．3％，去除前后有明显差异(P<0．001)。实验进一步建立了HPLC指纹图谱快速检测方法，在健康体检者的蛋白图谱的基础上确定了内标物并筛选出12个共有峰，以相对保留时

6、间和相对峰面积作为参数分析该方法的精密度、重现性和稳定性，其相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)分别

7、l9)和癌胚抗原(carcino．embryonicantigen，CEA)这4种肺癌常用的TM指标进行相关性分析，结果显示峰5分别与SCC．Ag和NSE呈正相关性，峰8、峰9与Cyfral9均呈负相关性。通过ROC曲线分析，证明峰5是区分肺部疾病患者和健康体检者最理想的差异蛋白峰，其敏感度和特异性分别为86％和98％。最后以峰5、峰8和峰9这3个蛋白峰为基准，建立一个肺癌分析树诊断模型，以峰5为母节点，相对峰面积s2．22时则为健康人，而>2．22时则为肺癌患者或者肺部疾病患者；若峰5的相对峰而积在2．23～3．96时，或者当峰5的相对峰而积>3．