同种异体移植的骨髓基质干细胞对肝损伤的修复作用及示踪的研究

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1、第一军医大学博士学位论文同种异体移植的骨髓基质干细胞对肝损伤的修复作用及示踪的研究姓名：陈小伍申请学位级别：博士专业：外科学普通外科学指导教师：方驰华20060420中文摘要且上述实验方法因需处死动物获取肝脏组织标本等而不能应用于人体研究。因此，若能用一种标记物标记BMSCs，并用简单的方法对同种异体移植的BMSCs进行追踪，将对研究BMSCs移植入体内后的定居、迁移、分化及对肝病的治疗作用大有帮助，并为追踪其他细胞在体内的类似作用建立一个良好的标记方法和技术平台。最近出现的一种新的标记技术就是对细胞进行磁性标记，并利用磁共振成像(MRI)技术追踪其在体内的定居、迁移

2、及分化等信息。其中应用最广泛的是菲立磁(Feridex)。国内外众多科学家已应用此方法追踪同种异体移植的Feridex标记的细胞在脑内的定位和迁移等。至于采用Feridex标记BMSCs，进行大鼠同种异体移植，并使用MRI追踪其在大鼠肝脏的定位及对肝损伤的修复作用，目前未见报道。目的使用Feridex标记SD大鼠BMSCs，研究标记后细胞的存活、增殖及向肝细胞分化能力的变化，建立不影响BMSCs增殖及向肝细胞分化能力的最佳标记方案；通过门静脉、肝局部实质、尾静脉3种途径同种异体移植Feridex标记的BMSCs，采用MRI技术在移植后不同时间分别对sD大鼠肝脏进行扫描

3、，探索对机体无毒、无害且能在肝内有效追踪的最佳移植方案和追踪方案；用CCl。制成急性化学性肝损伤模型，同种异体移植Feridex标记的BMSCs，利用MRI技术进行追踪，并结合血清学、肝脏组织病理学和细胞凋亡等相关指标，研究移植细胞在肝损伤环境下的定居、移行及对肝损伤的修复作用，最终为Feridex标记的BMSCs在大鼠肝内的追踪提供可行性报告，并为同种异体移植BMSCs为基础的肝损伤治疗提供理论依据。方法1．采用percoll梯度离心法获取BMSCs，体外传代、培养、纯化并通过流式细胞术检测CD29、CD44、CD45和体外诱导成骨细胞、碱性磷酸酶底物直接染色法鉴定

4、。Ⅱ‘t●，■博士学位论文2．比较用含不同浓度血清(分别为20％血清、50％血清、90％血清)的冻存液冻存不同时间(2周、4周、8周)的BMSCs复苏后的存活率(胎盘蓝排除实验)与贴壁率(细胞计数法)、增殖(噻唑蓝(MTT)法)、向肝细胞分化能力(在BMSCs与肝细胞共培养的第8d和第16d以免疫细胞化学法分别检测AFP、白蛋白的表达)，探讨不同冻存条件对BMSCs复苏后存活、增殖及向肝细胞分化能力的影响。气．3．使用Feridex标记sD大鼠BMSCs，采用普鲁士兰染色、电镜、胎盘蓝排除实验、噻唑蓝(MTT)法绘制生长曲线等鉴定Feridex标记BMSCs的效率、标

5、记后细胞的存活、增殖能力。检测标记后BMSCs的诱导分化率评估其向肝细胞分化能力，建立不影响其增殖及肝向分化能力的最佳标记方案。4．通过门静脉、肝局部实质、尾静脉等途径将Feridex标记的BMSCs同种异体移植至IJSD大鼠体内，采用MRI技术(三种序列：SE—T2WI、FSE—T2WI、GRE—T2WI序列)对移植前6h、移植后6h、1wk、3wk、5Wk时的大鼠肝脏进行扫描并比较分析，探索能在肝内有效追踪的最佳移植方案和追踪方案。5．利用CCl4制作SD大鼠急性化学性肝损伤模型，通过MRI技术追踪肝实质局部同种异体移植入SD大鼠肝内的Feridex标记的BMSC

6、s的定位、迁移，并检测大鼠血清ALT、AST、TG、A／G、Bil、SOD、MI)A、AKP、Hyp、Fe“和组织SOD、MDA、GSH-PX、Hyp水平，结合肝脏组织病理学和细胞凋亡等相关指标，研究BMSCs在肝损伤大鼠的定位、迁移及对大鼠肝损伤的修复作用。结果：1．用血清浓度为90％的冻存液经不同时间冻存后的BMSCs复苏后的存活率、贴壁率最高，且其增殖及向肝细胞的分化能力与正常对照组差异无统计学意义；而血清浓度为50％及20％时，冻存的BMSCs复苏后的存活率、贴壁率、增殖及向肝细胞的分化能力低于正常对照组，差异有统计学意义。2．标记培养基qbFe3+浓度为11

7、．2、16．8ug／ml时，90％以上的细胞普鲁士兰染色呈阳性，透射电镜可见铁颗粒位于BMSCs胞浆中；标记后的BMSCs生长、增Ⅲ中文摘要殖及向肝细胞分化的能力与未标记的BMSCs差异无统计学意义。Fe“浓度为5．6ug／ml时，普鲁士兰染色阳性率<60％；Fe”浓度为22．4ug／ml时培养基中死细胞增多，且诱导分化后AFP与白蛋白阳性率低于对照组，差异有统计学意义。3．MRI扫描正常大鼠肝脏时，以GRE—T2WI序列扫描的图像非常模糊，重影明显。以FSE—T2WI序列扫描的图像较GRE—T2WI图像较清晰，但重影仍明显。上述两序列均不能清晰显示