骨髓基质干细胞移植修复椎间盘退变的实验研究

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1、中国医科大学硕士学位论文骨髓基质干细胞移植修复椎间盘退变的实验研究姓名：高锦申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：常楚20070801·英文缩略语·6中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意．申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作

2、者签名／缢日期：坦z竺：』中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学．学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅．学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名指导教师签名簪．，壤毽，、日期：盈9：垒!』·中文论著摘要·骨髓基质干细

3、胞移植修复椎间盘退变的实验研究目的椎间盘退变性疾病是腰背痛的主要原因，也是骨科最常见多发病。椎间盘发生退变后，间盘内最重要的变化是髓核内的胶原减少和蛋白多糖浓度的降低。目前针对此类疾病的治疗方法有保守治疗和外科手术治疗等，但都有一定缺陷。而利用人自体椎间盘细胞、软骨细胞或干细胞移植到椎间盘，移植后能产生新的细胞外基质，以此来逆转椎间盘退变的过程是新的研究方向。随着对干细胞的研究逐渐深入，我们认识到骨髓基质干细胞具有多向分化的潜能。本课题通过培养骨髓基质干细胞，验证了其来源充足，取材方便，扩增能力确切的各项优点。为此，我们采用纤维环穿刺法制造大鼠尾椎

4、间盘退变模型的方法，然后将干细胞注入退变椎间盘中，通过实验对照，观察骨髓基质干细胞移植到大鼠退变的椎间盘后阻逆或修复椎间盘退变的效果。方法本实验利用体外细胞培养技术，将大鼠骨髓基质干细胞白骨髓血中分离、纯化和培养，先选用2周龄大鼠断颈处死，取其胫骨、股骨，并去除两干骺端，PBS冲洗髓腔，收集冲洗液，放入等体积的淋巴细胞分离液，吸取中间乳白色层面细胞悬液，与5倍体积的PBS混合后，离心，获取2×106／ml，放于20％DMEM培养液中，置入37℃、饱和湿度、596C02培养箱培养，24h后换液，72h后细胞铺满培养基(细胞生长融合达到8096～909

5、6)，每3天换液，i传4分瓶，此为传一代，取第3～4代作为注射用。并制成单细胞悬液，进行干细胞的贴壁率检测。从中选取3代生长状态良好的细胞，进行骨髓基质干细胞的形态学观察和生物学性能鉴定。将wistar大鼠随机分成四组：正常组(A组)、模型组(B组)、模型组+干细胞／藻酸盐组(C组)、模型组+藻酸盐组(D组)。每组九只大鼠，每组分二周组、四周组、八周组三个亚组，平均每亚组三只大鼠。制造大鼠尾的椎间盘退变模型(B组)：显微镜下用21号针头穿刺破坏纤维环并抽吸髓核组织。c组：在椎问盘穿刺抽吸髓核组织后立即注入干细胞／藻酸盐复合物，细胞浓度为1x106／

6、ml。D组：在椎间盘穿刺抽吸髓核组织后立即注入单纯等量的藻酸盐作为C组的对照。观察骨髓基质干细胞在植入椎间盘后是否能够延缓或修复椎间盘退变。分别于2、4、8周观察大鼠尾椎间盘组织形态学变化，免疫组化法测定纤维环组织中I型胶原的变化。结果1、原代培养及传代培养显示大鼠骨髓基质干细胞具有活跃的增殖倍增能力。2、组织学检测显示A组椎间盘结构形态正常：椎间盘高度正常，纤维环排列整齐，髓核结构正常；B组椎间盘退变模型组显示椎间盘结构破坏明显：椎间盘高度下降，纤维环排列紊乱，髓核基质含量减少；c组注入干细胞组显示椎间盘整体结构较B组明显恢复：椎间高度较B组好转

7、，纤维环排列较整齐，髓核基质成分增多；D组形态学改变与B组相似。3、纤维环中I型胶原免疫组织化学分析：A组为正常，显示纤维环排列整齐，纤维环中I型胶原表达较多。B组纤维环结构破坏明显，序列紊乱，I型胶原表达减少。C组早期纤维环结构破坏明显，序列紊乱，I型胶原表达减少，2周后逐渐好转：纤维环组织形态学排列逐渐整齐，I型胶原表达逐渐增多，纤维环结构得到修复，说明植入干细胞对纤维环具有生物学修复作用。D组纤维环形态和I型胶原表达与B组基本一致，说明藻酸盐只是干细胞的载体，对椎间盘无修复作用。结论骨髓基质干细胞因其来源丰富、取材简便、容易分离纯化培养、扩增

8、迅速、是较理想的组织工程种子细胞。将大鼠骨髓基质干细胞移植到退变的椎间盘后可以在一定的时间内延缓或修复椎间盘退变。关键词骨