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1、干细胞移植延缓椎间盘退变及磁共振示踪研究作者：鲍军平，吴小涛，王运涛，张福勇，朱磊【摘要】目的：评价超顺磁性氧化铁纳米粒子标记的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)在椎间盘退变早期植入椎间盘后细胞外基质的表达情况，并用磁共振进行干细胞示踪。方法：采取体外细胞培养技术，体外纯化扩增兔BMMSCs，并用氧化铁纳米粒子进行标记，于退变手术当时植入手术节段椎间盘内。分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化，免疫组化法测定Ⅱ型胶原的含量变化，用磁共振扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪。所得数据进行统
2、计学处理。结果：8周内实验组髓核蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量明显较模型组高,差异有统计学意义，但与正常组比较差异无统计学意义。结论：兔BMMSCs移植可以延缓甚至阻止髓核退变。【关键词】椎间盘退变；髓核；骨髓间充质干细胞；干细胞移植；超顺磁性氧化铁椎间盘退变(intervertebraldiscdegeneration,IDD)是引起下腰痛的常见病因之一，严重影响人们的生活质量。IDD导致脊柱的生物力学功能紊乱，从而影响脊柱的功能。椎间盘突出症是骨科的常见病和多发病，是腰腿痛最常见的原因。一般认为腰椎间盘突出症是在I
3、DD的基础上发生的。但青少年椎间盘突出症患者可在无退变时因强大暴力引起纤维环破裂和髓核突出，该类患者随年龄的增长发生IDD的可能性增加。自提出骨髓间充质干细胞（bonemarroesenchymalstemcells，BMMSCs）概念以来，利用其修复组织损害和促进功能恢复作用的治疗方法成为目前医学领域中最引人关注的热点之一。已有的研究结果显示，移植BMMSCs可能成为治疗IDD的一种新方法［1］。本研究旨在探讨早期干细胞移植有无减缓甚至阻止髓核丢失造成IDD发生的可能性。1材料和方法1.1材料LG-DMEM培养
4、基(美国Gibco公司)，100%胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，Percoll液(美国Pharmacia公司,密度1.077g·L－1)，抗Ⅱ型胶原抗体(美国ADL公司)，7.0TMR仪（德国Bruker公司)，5%CO2细胞培养箱(德国Herabus公司)，数码照相机(日本Nikon公司),一次性培养瓶、培养板(Corning公司);新西兰大白兔由东南大学医学院动物中心提供。1.2方法1.2.1兔BMMSCs的分离培养方法取1月龄新西兰大白兔6只,雌雄不拘,平均体重1.2kg(1.
5、1～1.25kg)，3%戊巴比妥钠按1ml·kg－１的剂量施以全身麻醉；无菌操作下于双侧胫骨上端用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径2～3mm的孔通达髓腔；用18号骨穿针接注射器,内含3000U·ml-1的肝素0.1ml,沿骨皮质上的孔穿入髓腔抽出骨髓血约2ml；抽出的骨髓血用PBS洗涤2次后,800r·min-1离心5min；弃去上清液,沉淀用LG-DMEM培养液重新打匀，制成单细胞悬液；将单细胞悬液缓慢加入预先加有密度为1.077g·L-1的Percoll单核细胞分离液的离心管中,2000r·min-1离心20m
6、in,吸取中间的白膜层,用PBS冲洗2次后,800r·min-1离心5min，以2×105ml-1密度接种于20%胎牛血清的LG-DMEM培养基,置于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱。4～5d后首次换液,以后每3d换液1次,逐次递减血清浓度,直至为10%。倒置显微镜下逐日观察细胞形态并拍照记录。细胞生长融合达90%以上,以0.25%胰蛋白酶消化,按1传2比例分瓶接种传代培养。此为传一代,记为P1,以此类推,分别获取P2、P3、P4……P10代间充质干细胞。以P3代细胞作为注射用细胞。1.2.2超顺磁性氧化铁纳米
7、粒子(SPIO)标记细胞用SPIO进行标记，标记Fe浓度为25μg·ml-1,共同孵育24h。除去培养液后PBS反复漂洗，消化细胞，留取少量细胞爬片进行普鲁士蓝染色证实细胞内铁，其余制成单细胞悬液用于移植，细胞浓度为2×106ml-1。1.2.3分组及手术方法纯种成年新西兰大白兔24只,雌雄不限,平均体重2.5kg，随机分成对照组、实验组和模型组各8只。后两组全麻下采用腰椎侧前方倒八字手术入路,于腹膜外进入腰椎的侧前方,找到腰椎间盘,于L2,3、L3,4、L4,5,用21号针头针刺抽吸椎间盘，抽出组织湿重约5mg
8、。实验组在对应的椎间盘内注射干细胞悬液20μl，模型组注射磷酸缓冲液（PBS）20μl,在每个相应椎间盘旁的腰大肌处以黑色缝合线作标记,用于以后取样观察。然后冲洗、止血,依次逐层关闭切口。术后每日定期观察切口情况，肌肉注射抗生素预防感染。1.2.4髓核基质含量测定将实验组、模型组、对照组随机分为2、4、6、8周组4个亚组,每组2只兔;在相应时间于兔耳缘静脉注射空气10ml
