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1、示踪法自体骨髓干细胞移植实验探究[摘要]目的:研究大鼠骨髓干细胞移植后的定位与分化状态。方法:以荧光染料DiI为示踪剂对移植的骨髓干细胞进行标记,并通过门静脉移植入大鼠肝脏,分别于7、14、21、28d采集移植鼠的肝组织进行荧光检测。结果:荧光剂DiI标记的干细胞在移植鼠肝组织中定位,并且分化增殖。其亮红色荧光随时间的推移略有减弱,但并不消失。结论:DiI荧光剂为可靠的干细胞示踪剂,可应用于移植细胞的标记,骨髓干细胞可在受损肝组织中定位并分化增殖。[关键词]示踪法;骨髓干细胞;移植;实验研究[中
2、图分类号]R-332[文献标识码]A[文章编号]1674-4721(2010)05(c)-013-02ExperimentalresearchonautologousbonemarrowstemcelltransplantationwithtracermethodJINChunying,QUNaifang,ZHANGPu(InfectiousDiseaseHospitalofHarbinCity,HeilongjiangProvince,Harbin150030,China)[Abstract]
3、Objective:Toresearchthelocationanddifferentiationofratsbonemarrowstemcellsaftertransplantation.Methods:LabeledratsbonemarrowstemcellswithfluorochromeDiI,7transplantedthelabeledcellsintotheratliversviaportalvein,collectedanddetectedthehepatictissuesfr
4、omthetransplantationratsafter7,14,21,28daysrespectively.Results:ThestemcellslabeledbyfluorochromeDiIlocated,proliferatedanddifferentiatedintheliversofthetransplantationrats.Theredfluorescencedeclinedovertime,butitdidn’tdisappear.Conclusion:DiIisareli
5、ablestemcelltracerandcanbeusedtolabeltransplantedcells.Bonemarrowcellscanbelocatedproliferatedanddifferentiatedindamagedhepatictissue.[Keywords]Tracermethod;Bonemarrowcells;Transplant;Experimentalresearch目前,骨髓干细胞移植作为一种新的治疗手段,在各系统疾病中有被广泛应用的趋势,但其效果也只能从
6、各项生化、生理指标的变化来判定,很难做到直观判别移植的干细胞是否定位于靶位,分化与增殖而发挥作用。为探求了解移植干细胞在病变部位的状态,笔者用荧光剂DiI作为示踪剂对移植的骨髓干细胞进行标记、检测分析,现将结果报道如下:1材料与方法1.1实验动物7雄性SD大鼠10只,体重(200±20)g,清洁级,购自哈尔滨兽医研究所动物室。1.2试剂与仪器D-氨基半乳糖购自重庆医科大学试剂中心,亚硫酸钠、内毒素、DiI购自Sigma公司,淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物有限公司,rhG-CSF为山东齐鲁制药有限
7、公司生产,荧光显微镜为德国莱卡480型,温控离心机为美国贝克曼产品。1.3实验方法1.3.1动物模型制备与干细胞标记10%D-氨基半乳糖溶液(以0.9%NaCl溶液配制,以0.1mol/LNaOH调PH至7.4)按10mg/kg体重,内毒素20μg/kg体重一次性对模型鼠进行腹腔注射制备大鼠肝衰竭模型。对照组以0.9%NaCl溶液用同样方法制备。诱导肝衰竭后正常饮食,并于次日起以10μg/kg体重rhG-CSF对模型鼠行皮下注射,每天1次,共计4次,于第5天从模型鼠舌下以肝素抗凝采血1ml,给予
8、混后的等量磷酸盐缓冲液(PBS)混匀,轻轻叠于1.083Ficoll-Hypaque上(比例为3∶2),25℃2000r/min离心20min,吸出单个核细胞层,加入2mlPBS(PH7.4,0.01mol/L)中洗涤3次,每次以1500r/min离心5min,弃上清后取少量细胞进行曲利苯兰活性率检测,确定细胞活率。再以1mlPBS对细胞进行悬浮混匀。在悬浮细胞中加入以无水乙醇配制的(浓度为1mmol/L)CM-DiI荧光剂57ml,混匀后避光放入37℃水溶液20min进行标记,再以PBS洗涤3
