菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞在同种异体移植鼠肝脏中的追踪观察

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1、菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞在同种异体移植鼠肝脏中的追踪观察作者：陈小伍，方驰华，刘胜军，崔冰，王岩，黄治荣【关键词】骨髓基质干细胞；菲立磁；磁共振成像；干细胞移植【Abstract】AIM：Tostudythemethodoftrackingofallogenicallygraftedratbonemarrocells（BMSCs）labeledinedbyPrussianbluestainingandelectronmicroscopy.SuccessfullylabeledBMSCs(2.0mL，1×109

2、/L)aandcaudalvEInoftheSDrats.Sixhoursbeforetransplantationand6h,1,3,and5agicresonanceimaging(MRI)examination(thesequencesusededthelabelingefficiencyissionelectronmicroscopyshoerousironparticlesinthecytoplasmofFeridexlabeledBMSCs.MRI(SET2SCscanbetrackedeffectiv

3、elyinratliverbyMRI.【Keyarrocells；Feridex；magicresonanceimaging；stemcelltransplantation【摘要】目的：研究菲立磁标记的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)在同种异体移植鼠肝脏中的追踪方法.方法：采用菲立磁（Feridex）对分离培养的BMSCs进行标记，Prussianblue染色和电镜观察对标记后的BMSCs进行鉴定；取鉴定后的BMSCs2mL（1×109/L）分别注射到SD异体大鼠的门静脉、肝局部实质、尾静脉内；采用磁共振成像(MR

4、I)技术（SET2SCs）在一定的条件下，可分化为有功能的肝细胞，且获取及体外培养容易，没有伦理道德的争议，可以作为种子细胞来治疗急慢性肝功能衰竭和修复肝脏损伤，具有极大的研究价值.但同种异体移植后BMSCs在活体肝内的定居、迁移和分化机制尚不清楚.我们利用直径为纳米级别的超顺磁性氧化铁粒子菲立磁（feridex）对大鼠BMSCs进行标记，并利用磁共振成像(magicresonanceimaging，MRI)技术对多种途径同种异体移植的BMSCs在大鼠肝内进行了定位与追踪.1材料和方法1.1材料SD清洁级大鼠（80

5、～100g，2只，供提取骨髓用；200～220g，雄性36只，供同种异体细胞移植用）购自广州军区广州总医院动物实验室.Feridex购自美国泛华医药公司.DMEM（低糖）培养基购自美国GIBCO公司；优质胎牛血清购自奥地利PAA公司；胰蛋白酶购自AMERSCO公司；其他化学试剂为国产分析纯.Olympus相差显微镜，HERAEUS超净台，FORUMCO2培养箱，东芝1.5T超导MRI机（型号Exelart/P3）.1.2方法1.2.1BMSCs分离、培养、鉴定及传代percoll梯度离心法(连续密度梯度离心分离法)

6、分离纯化大鼠BMSCs.采用密度为1.073kg/L的Percoll液分离骨髓液，离心后BMSCs将聚积在第二层.完整取大鼠双后肢股骨，DHanks液吹吸骨髓.抗凝骨髓经低糖的DMEM培养基稀释.将比重为1.073kg/L的Percoll置试管底部，按照1∶1的比例缓慢滴加稀释后的骨髓，900g/min离心30min.收获分离的单个核细胞，DMEM洗两次，接种于24孔板内，各孔内加入100mL/L胎牛血清，48h后除去非贴壁细胞，更换新鲜培养液，50mL/LCO2，37℃和饱和湿度的条件下培养，待细胞生长至瓶底90

7、%融合时，2.5g/L胰蛋白酶消化，传代培养.收集第4代BMSCs，流式细胞仪检测CD29，CD44，CD45等表面标志、成骨诱导后行细胞碱性磷酸酶染色.具体方法参照2.5组织学检查①门静脉组：实验组移植后肝门部可见聚积的呈蓝色染色的铁颗粒细胞，各时间点组织学改变基本与MRI影像对应（图3）.对照组未见蓝色染色的铁颗粒细胞.②肝内组：实验组移植后肝尾状叶下半部切片可见许多细胞质呈蓝色染色的铁颗粒细胞，各时间点组织学改变基本与MRI影像对应（图4）.对照组未见蓝色染色的铁颗粒细胞.③尾静脉组：实验组移植后各时间点与对

8、照组比较，肝内可见少量分散的呈蓝色染色的铁颗粒细胞.对照组未见蓝色染色的铁颗粒细胞.3讨论目前广泛应用的几种细胞标记技术，如BrdU法［4］,DAPI法［5］,PKH26法［6］,GFP法［7］,Y染色体标记法［8］等，各有其优缺点，但均需行组织切片，对实验对象有创伤性，多需处死实验对象.这些方法既不利于在同一个体内连续、动态的跟踪观察，也不可能应用于人体.