多种核酸扩增技术研究及其在线粒体dna检测中的应用

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1、東兩大聲硕±学位论文多种核酸扩增技术研究及其在线粒体ＤＮＡ检测中的应用专业名砍；牛物民学工穂贝硏究生姓名：姚导师姓名：陆祖宏教授涂景讲师ＳＥＶＥＲＡＬＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮＴＥＣＨＮＯＬＯＧ巧ＳＲＥＳＥＡＲＣＨＡＮＤＴ肥化ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳＩＮＭＩＴＯＣＨＯＮＤＲＩＡＬＤＮＡＴＥＳＴＩＮＧＡＴｈｅｓｉｓＳｕｂｍｉｔｔｅｄ化ＳｏｕｔｈｅａｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＦｏｒ也ｅＡｃａｄｅ

2、ｍｉｃＤｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＢＹＹａｏＢｅｉＳｕｐｅｒｖｉｓｅｄｂｙＰｒｏｆＬＵＺｕｈｏｎ．ｇａｎｄＤｒ．ＴＵＪｉｎｇＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＭｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＳｏｕｔｈｅａｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭａｙ２０１５东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研充工作及取得的研究成果。尽我所论文中不包含其他人己经发表或撰

3、写过的研究成果，知，除了文中恃别加Ｗ标注和致谢的地方外，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研巧所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明井表示了谢意。：ｒ．ＪＴ研巧生签名；古於哭曰期ｏｏｉ．巧东南大学学位论文使用授权声明东南大學、国、中国科学技术信息研巧所家固书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档、，可Ｗ采用影印缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质晚文的内容相－致）。除在保密期内的保密论文外，允许论文

4、被查阅和借阅，可Ｗ公布（包括Ｗ电子信息形式刊登论文的全部内容或中。、英文摘要等部分内容论文的公布（包括Ｗ电子信息形式刊登）授权东南大学研巧生院办理。研究生签名、：义导师《名期；Ｗ矿ｇ该ｍ摘要论文巧目！多种核酸扩增技术研巧及其在线粒体ＤＮＡ检测中的应用作者巧名！姚贝导师姓名：陆祖宏（教授）、涂景（讲师）学校名称！东南大学一人类线粒体基因组ＤＮＡ分子为个１６５６弗的双链环状ＤＮＡ分子，该基因组与核基因沮相互Ｐ独立又互相依存，线粒体有１３个编码基因，２２个ｔＲＮＡ和２个ｒ

5、ＲＮＡ，许多疾病都与钱粒体基因组。相关线粒体又有独特的母系遗传特性．是研究生物起源和进化的重要材抖。Ｋ５６２细胞是人类慢性髓系白血病细胞，该细胞容易获取，。，具有各种分化特性是实验室研究的重要材料随着人类基因姐计划的完成，各种测序手段相继出现，人们在获取遗传序列信息方面更加方便，利用测序手段研究线粒体基因組，对其进行正确的拼接和后续的功能注释在诊断线粒体疾病Ｉ保护生物学和群体遗传学，Ｗ及确定线粒体在进化上的地位都有重要作用意义。本论文ＷＫ５６２细胞线粒体基因组为研一巧对象，通过实验的

6、方法设计了组对比实验，分別用基于ＰＣＲ的方法和基于多重置换扩增的全基一ｍ因沮等温扩増来获得线粒体基因组用Ｓａｎｅｒｉｎａ，然后利代ｇ测序方法和二代ｍｕ测序方法对我们获取的线粒体基因组进行测序，最终获得了Ｋ５６２细胞线粒体基因组序列信息。１、我们利用基于ＰＣＲ的扩増方法，通过文献综述和预实验最终确定了４５对线粒体扩增引物，一一对线粒体环状ＤＮＡ分子的全长进行无缝扩增（）ｂ，每个扩增片段长度不超过１０Ｋｐ，每个扩增片一一ｏｖｅｒ。段的上下游都有段的ｌａｐ然后对这些扩增片段利用ＡＢＩ的３

7、７３０测序仪进行测序，获取每一代测序下机数据，我们使用ＮＣＢｂｌａｓｔ个扩增片段的序巧信息。对于Ｉ数据库的在线比对工具将我们的每一人类线粒体标准参考基因组个扩増ｆｒａｍｅｎｔ与（ＮＣ０１２９２０．１）进行比对，然后手动对込ｇ＿些比对后的）进行手动拼接。ｔ段，最终获得了Ｋ５６２细胞线粒体的完整基因组２、我们利用基于多重置换扩増的线粒体基因组等盈扩增方法对我们的Ｋ５６２细胞线粒体基因组进斤扩増－。我们使用ＱＩＡＧＥＮ公司的趾ＰＬＩｇＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡｋｉｔ对我们的Ｋ５６２核酸

8、样本进行一扩増，般地线粒体ＤＮＡ在提取过程中往往与核ＤＮＡ很难分开，所我们选择对Ｋ５６２全基因沮中线粒体ＤＮＡ进行特异性扩增。实验过程中我们对样本进行了不同程度的捕释，发现将样本稀释到化．）１个核ＤＮＡ的单倍量级时（即３３ＡｉＬ，再进巧线粒体基因组扩增后１０组平行样本中只有３ｐｇ个样本扩増出。根据我们的全基因组稀释样本的测序致据发现．，在０１个ｇＤＮＡ单倍量级时，线粒体ＤＮＡ与Ｄ