核酸扩增技术在结核病诊断中的应用与进展

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1、核酸扩增技术在结核病诊断中的应用与进展近10余年来现代分子生物学的迅猛发展，为临床实验室诊断提供了较为可靠的核酸检测方法。经典聚合酶链反应(PCR)扩增技术已广泛应用于结核病的诊断；然而，由于污染问题严重，扩增抑制物的存在，试剂盒缺乏规范化、标准化，加之技术、条件、质控等方面因素影响，其敏感性、特异性差异颇大，人们对其可信度、可靠性产生了怀疑，给临床医生诊断结核病带来了一定的困惑。为此，国外学者开发出具有高度敏感性、特异性、标准化、商品化的PCR扩增试剂盒；继PCR之后，又发展了几种新的核酸体外扩增技术。现就其在结核病诊断方面的应用与进展作一介绍，供广大同道借鉴。　　一、

2、PCR为基础扩增反应即RocheAmplicor结核分支杆菌PCR试验(AmplicorpCR)　　AmplicorPCR系应用生物素标记位于结核分支杆菌16SrRNA基因中高度保守区域种特异性引物扩增结核分支杆菌复合群DNA中584bp序列；生物素标记的扩增子(amplicon)与种特异性DNA探针进行杂交后，应用标准酶联免疫技术进行比色鉴定，结果判断以450nm波长时吸光度(A450)＞0.350为阳性标准［1～3］。AmplicorpCR是由瑞士Roche公司开发研制的标准化、商品化试剂盒，该试剂盒有三个不同的小盒：标本处理盒、扩增盒和鉴定盒。为防止交叉污染，厂商推

3、荐试剂制备、标本处理、扩增与鉴定应三室分开，此外，应用尿嘧啶-N-糖基化酶控制扩增子携带污染。研究表明，AmplicorpCR可检出少至2～10个结核分支杆菌中DNA。与培养法相比，AmplicorpCR检测临床标本中结核分支杆菌DNA的敏感性为76.7%～97.8%，特异性达97.7%～99.3%，阳性预计值(PPV)66%～93%，阴性预计值(NPV)98%～98.6%［2～4，6］。若参考临床综合诊断，其敏感性、特异性、PPV、NPV分别为66.7%～85.4%、99.6%～100%、91.7%～100%、96.8%～98.6%，该方法至少与培养法一样敏感［1，4～

4、6］。对于涂阳标本，AmplicorpCR敏感性(97.6%～98%)显著高于涂阴标本(40%～53%)［4，6］。该方法还可对涂阳标本应用种特异性探针对结核分支杆菌和非结核分支杆菌(MOTT)早期进行菌种鉴定［2，4］。AmplicorpCR整个过程仅需7小时左右，用于检测BACTEC培养基中结核分支杆菌较核酸探针杂交试验提前4天以上［4］。法国学者Carpentier等［5］对AmplicorpCR进行多中心研究，结果显示，其检测肺外标本(尿、胸腹液、脑脊液等)、涂阳标本、涂阴标本及培阳标本的敏感性分别为83%、94.5%、74%、95%，特异性达98%。Amplic

5、orpCR不仅具有高度敏感性、特异性和可重复性，而且操作简单，无需昂贵设备，无放射性污染问题；然而，其灵敏度较经典PCR稍低，可能系标本量较少及存在抑制因子所致。AmplicorpCR在方法学上仍需进一步自动化以避免手工重复操作。　　二、转录介导扩增反应即基因探针扩增直接试验(AMTDT)　　AMTDT是由美国加州Gen-Probe公司发展起来的由DNA介导的等温rRNA扩增法，扩增子应用吖啶酯(acridinumester,AE)标记的化学发光探针(AE-DNA探针)进行核酸杂交保护实验(hybridizationprotectionassay,HPA)，通过照度计检测

6、杂交探针的相对发光值(ralativelightunits,RLU)，以RLU≥3×104判断为阳性。该rRNA序列在核酸中存在2×103拷贝数，应用AMTDT可使特异性靶rRNA序列扩增109倍，其检测低限为每ml10个［1～3］。由该公司生产的商品化试剂盒应用N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)和十二烷基硫酸钠(SDS)对标本进行消化与去污染处理，且该过程在单管中进行，这样也防止了标本间可能的交叉污染；该试剂盒能直接用于各种临床标本的检测，整个过程仅需5小时便可完成。与培养法相比，AMTDT检测临床标本敏感性为92.9%～100%，特异性为90.1%～98.7%；结合临

7、床综合判断，AMTDT敏感性、特异性、PPV、NPV分别达83.9%～100%、97.6%～100%、80.7%～100%、96.3%～99.3，其敏感性与培养法相等或稍高［1～3，7，9］。研究表明，AMTDT检测肺外标本(胸腹液，脑脊液)的敏感性和特异性与肺部标本大致相仿(P＞0.05)，并不低于培养法；把标本量从50μl增加到500μl，然后进行离心，可明显提高该试验结果的敏感性，而不影响其特异性［7，8］。日本学者Abe等［10］比较了经典PCR和AMTDT检测痰标本结果，发现AMTDT检测总阳性率达91.9%，高于经