分子诊断技术在结核病诊治中的应用

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1、分子诊断技术在结核病诊治中的应用武汉大学人民医院检验医学中心李艳全球结核病流行状况WHOreport，2013全球结核病流行状况全球结核感染人数2004年后处于下降趋势HIV患者并发结核病数量处于平稳阶段中国结核感染人数全球排名第二WHOreport，2013全球结核病流行状况WHOreport，2013全球结核病流行状况全球结核死亡人数处于下降趋势斯威士兰结核病感染率最高WHOreport，2013全球结核病流行状况Globally,anestimated3.6%ofnewcasesand20.2%ofprevi

2、ouslytreatedcaseshaveMDR-TBTherewereanestimated450,000newcasesofMDR-TBworldwidein2012Onaverage,anestimated9.6%ofMDR-TBcaseshaveXDR-TBWHOreport，2013全球结核病流行状况2012年全球新发结核病例为860万人，中国占总数的12%在860万新病例中约110万人（13%）为HIV阳性，这些病例的75%在非洲每年约有130万人死于结核病，我国为25万结核病每24秒钟就杀死1人预计未

3、来20年还将有3600万人死于结核病。全球每年有45万新发MDR-TB，大约4.3万为XDR-TB流行现状感染人数多死亡人数多耐药患者多潜伏感染多“4多”WHOreport，2013结核病诊治中存在的问题预防问题诊断问题治疗问题医疗问题检验人员最关心的问题根据不同分子水平及技术特点来选择诊断检测体系细菌载体疫苗DNA疫苗灵敏度特异性标本类型目的用途费用实验平台检测时间方法选择方法选择的影响因素Sputum涂片MTB培养—孵育4-8周（阳性）药敏试验—观察孵育4周观察生长情况涂片（阳性）分子诊断技术液体培养及药敏试验

4、平均时间2-3个月平均时间20天只需2小时-2天涂阳=60-98%有结核分枝杆菌，因此涂阳后最好用分子生物学方法进行快速鉴定IGRAs、TST等RNA水平DNA水平蛋白质水平恒温扩增变温扩增鉴定鉴定+耐药结核病分子诊断扩增杂交LAMP、SDA芯片、RT-PCRSAT、TMAFISH、Probe分子诊断适宜技术的选择T-SPOT.TB与QFT-GI为IGRAs实验潜伏性结核（LTBI）结核菌素试验（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TBGoldin-tube(QFT-GI)蛋白质水平全血IFN-γ释放

5、分析技术(IGRA)结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中γ-干扰素释放实验酶联免疫斑点技术培养滤液蛋白10（CFP10）早期抗原靶6（ESAT-6）一、T-S

6、POT技术基础T-SPOT由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区结核杆菌特异抗原ESAT-6与CFP10抗原PlamaPBMCsGelBarrierErythrocytes检测过程分离PBMCs加入PBMCs与结核特异抗原37℃孵育16-20小时PBMCs特异抗原Γ-干扰素抗体加入标记二抗，孵育1小时加入显色液，终止反应观察结果：1个斑点=1个效应T细胞结果判断图阴性结果阳性结果空白对照抗原AESAT-6抗原BCFP10阳性对照（P

7、HA）潜伏性结核（LTBI）诊断技术比较IGRAs与TST相比，具有更高的灵敏度和特异性IGRAs与BCG,NTM无交叉反应，TST有交叉反应难以从感染者中鉴别出活动性肺结核患者小于5岁儿童、免疫力低下患者不适合采用IGRAs检测试剂成本非常高costs（费用）availabilityforcliniciansandotherhealthworkers（医疗水平）patientacceptability（患者是否接受）easeofdistributionandstorage（实验平台）核酸扩增技术核酸扩增技术反应条

8、件扩增产物检测方法代表公司RT-PCR热循环DNA实时RocheRT-LAMP恒温DNAEikenGenoType®MTBDRplus热循环DNAHainLifescienceCPA恒温DNA优思达NASBA恒温RNAbioMerieuxTMA恒温RNA终点Gen-ProbeSAT恒温RNA实时仁度SAT：SimultaneousAmplificationa