核酸扩增技术(nat)在血液hbv dna筛查中的应用研究

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1、核酸扩增技术(NAT)在血液HBVDNA筛查中的应用研究【关键词】核酸扩增技术(NAT)血液HBVDNA筛查输血相关传染病的预防和控制已成为全社会关注的焦点，随着检测技术的不断进步，输血传播相关病毒的危险性大大降低，目前酶免疫检测(ELTSA)技术已经广泛应用于血液筛查，但每年仍有少量新发输血后肝火病例报道，如美国无偿献血者每单位供血传播HBV的危险性为1／6.3万。这些危险主要来自病毒感染者“窗口期”献血、病毒变异、低病毒载量感染及人工操作失误等，其中“窗口期”漏检是影响血液安全性的主要问题。核酸扩增技术(NAT)可直接检测病毒核酸，大大缩短病毒ELISA

2、检测的窗口期及检出变异株，发达国家已陆续将其纳入献血者的常规筛查项目，并取得一定的成效。但由于进口NAT试剂成本很高，取制了该技术在我国血液常规筛查中的推广应用。为了进一步提高血液的安全性，降低血液核酸筛查的成本，笔者尝试将国产NAT试剂应用到血液HBVDNA筛查中，并对在献血者HBVDNA检测中建立一套适合中国国情的筛查检测体系的可行性进行了探讨。1材料和方法1.1材料RSP-200(瑞士TECAN)及STAR2000全自动上海加样仪(瑞士HAMILTON)，MicrolabFAME(瑞士HAMILTON)和DADEBehring全自动酶免分析仪(德国DA

3、DE)，KHB-DP1000磁珠分离仪(上海科华)，MJOpficon2核酸扩增检测仪(美国Biorad)，专用耗材-96Plate，专用耗材-96Tipb，核酸提取试剂盒(上海的华)，HBV检测试剂盒，HBVDNA国家标准品(卫生部临检中心，浓度3600IU／ml)，HBsAgELISA国产试剂(上海科华)和进口试剂(美国Abbott)，乙肝两对半试剂(厦门新创)。1.2检测对象2008年8月～2009年12月无偿献血者标本共9239份。NAT筛查的标本用真空EDTA抗凝留取血样5ml，于8h内分离血清。1.3血液的ELISA常规检测所有标本均经乙肝金标试

4、纸条和ALT试纸条筛查合格后，再进行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV国产和进口试剂两遍ELISA筛查及梅毒、ALT检测。1.4标本的汇集将采集的5mlEDTA抗凝的全血室温离心3min(3600g)，保存2～4℃冰箱中，待血液标本ELISA常规筛查合格后，应用STAR2000，启动全自动汇集程序，按试剂盒要求进行8人份标本汇集，将每个汇集池的标本知码文件储存并输出以备追溯和确认使用。若汇集样经检检测为阳性，进行单个标本检测，以最终确认阳性标本。1.5标本的浓缩往每个汇集池中加入浓缩液40μl和促沉剂50μl，充分混匀后在Eppendort离心机以4℃离心1

5、小时(25000～26000g)，留底部110μl左右样震荡混匀备用。1.6核酸的提取采用核酸提取试剂盒，在标本处理区按试剂盒要求准备六块板①～⑥，板①加去抑制剂20μl、浓缩样100μl、裂解液100μl及专用耗材-96Tipb，板②加磁珠溶液100μl，板③～⑤分别加洗涤液A、B、C200μl，板⑥加洗况液80μl，然后在KHB-DP1000磁珠分离仪上按程序说明逐步完成核酸提取。1.7核酸扩增及检测用全自动核酸扩增仪检测，按检测试剂盒要求准备PCR反应液(HBVPCR反应液A：HBVPCR反应液B：HBVPCR反诮液C：内标=8：6：1：0.2)，往反

6、应管中加15μlPCR反应液及15μl已提取的核酸,置入核酸扩增检测仪上，按程序操作。内标阳性，样本阳性者报阳性。2结果2.1灵敏度考评将已知浓度的标准品用阴性血清于不同时间配制成不同拷贝数的应用标准液，进行重复核酸提取、扩增及检测，结果见表1。应用Probit概率统计(SAS9.0)计算95％检测限量及可信限范围。本方法检测HBVDNA95％检测限量为98.0IU／ml，可信限范围为[55.8，548]。2.2已知HBVDNA阳性标本检测结果对7份已知HBVDNA阳性的保存标本(经Roche试剂检测阳性)分别取样1200μl离心浓缩后进行核酸提取扩增检测和

7、100μl直接进行核酸提取扩增检测，结果分别检也HBVDNA阳性6例和5例，检出率分别为85.7％、72.4％。采用随机双盲法混合了7份阳性血清(经单人份检测阴性)，进行混样检没，7例混样中共检出HBVDNA阳性2例，检出为28.6％，见表2。阳性、定量测定无结果2.3检测系统的精密性对68次扩增实验的质控的CT值进行统计分析：计算前20个质控点：均值x-=30.081，SD=1.051，CV=3.49％。除了一次实验失控，CT值．CT值过高可能是质控样提取的核酸不足，导致扩增循环次数增加所致，其他实验质控艾在x-±2S范围内，见图1。2.4质量控制为监控实

8、验进行，对整个实验进行有效控制，在每次检测过程依靠阴