α-硫辛酸对帕金森病模型大鼠黑质铁沉积的干预机制研究

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慕:中图分类号：R741单位代码：10660UDC：616.8学号：10660S120365学科专业代码：100204密级：公开贵阳医学院2015届硕士学位论文(科学学位）a-硫辛酸对帕金森病模型大鼠黑质铁沉积的干预机制研究MechanismofalphalipoicacidinterveningonirondepositioninthesubstantianigraofParkinson’sdiseasemodelrat研究生:徐利导师:焦玲教授年级:2012级专业:神经病学 贵阳医学院学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。除与外单位合作项目将予以明确方式规定外，本研究己发表与未发表成果的知识产权均归属贵阳医学院。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名（手写)：导师签名（手写）：(4—^rf)曰—^年A月v1b学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权贵阳医学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于（请在以下相应方框内打“V”：1、保密□，在年解密后适用本授权书。2、不保密作者签名（手写）：导师签名（手写）：——^4^—年V月7"7曰年v月"7日 中图分类号：R741单位代码：10660UDC：616.8学号：10660S120365学科专业代码：100204密级：公开贵阳医学院2015届硕士学位论文（科学学位）α-硫辛酸对帕金森病模型大鼠黑质铁沉积的干预机制研究MechanismofalphalipoicacidinterveningonirondepositioninthesubstantianigraofParkinson'sdiseasemodelrat论文作者：徐利指导教师：焦玲教授申请学位：医学硕士培养单位：临床医学院学科专业：神经病学研究方向：帕金森病研究起止日期：2014年04月至2015年04月论文评阅人：盲评答辩委员会主席：徐平教授论文答辩日期：2015年05月27日二〇一五年五月 α-硫辛酸对帕金森病模型大鼠黑质铁沉积的干预机制研究专业：神经病学硕士研究生：徐利导师：焦玲【摘要】目的：通过检测α-硫辛酸（LA）对6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的帕金森病（PD）模型大鼠中脑黑质（SN）二价金属离子转运蛋白1（DMT1）、细胞膜铁转运蛋白1（FP1）、铁蛋白（Ferritin）表达的影响，探索LA清除帕金森病模型大鼠中脑SN铁沉积的分子机制。方法:130只雄性SD大鼠随机分为对照组（颅内注射生理盐水）30只、模型组（颅内注射6-OHDA）100只。30只对照组大鼠术后4周再随机取20只作为假手术组；100只模型组大鼠4周后随机取80只成功模型再随机分为PD模型组和LA干预低、中、高剂量组，每组20只。模型组采用立体定位仪定向注射6-OHDA，对照组定向注射等体积的生理盐水。于PD模型大鼠成功术后4周，对LA低、中、高剂量组分别腹腔注射LA25mg/kg/d、50mg/kg/d、100mg/kg/d连续14d，PD模型组不给予干预。干预结束后取各组大鼠右侧中脑SN采用Western-Blot方法检测DMT1、FPl、Ferritin的表达情况，采用普鲁士蓝铁染色方法检测SN内铁阳性细胞数量的变化，利用原子吸收分光光度计检测SN内铁含量的变化。结果：（1）与假手术组比较，PD模型组、LA低、中、高剂量组SN内DMT1表达均明显增加（P＜0.05），FP1、Ferritin的表达水平均明显减少（P＜0.05）；PD模型组、LA低、中、高剂量组SN铁含量、铁阳性细胞数量均明显增加（P＜0.05）。（2）与PD模型组比较，LA低、中、高剂量组SN内DMT1表达均显著下调（P＜0.05），FP1表达均显著上调（P＜0.05），LA中、高剂量组Ferritin表达显著上调（P＜0.05），LA低剂量组Ferritin表达无统计学差异（P＞0.05）；LA低、中、高剂量组SN铁含量及铁细胞数量明显减少（P＜0.05）。（3）与LA低剂量组比较，LA中、高剂量组SN内FP1、Ferritin表达均显著上调（P＜0.05），DMT1表达显著下调（P＜0.05）；LA中、高剂量组SN铁含量、铁细胞数量明显减少（P＜0.05）。（4）与LA中剂量组比较，LA高剂量组SN内FP1、Ferritin均明显上调（P＜0.05），LA高剂量组SN铁阳性细胞数量明显减少（P＜0.05）；而LA中、高剂量组之间DMT1的表达水平、铁含量均无统计学差异（P＞0.05）。结论：（1）LA可以有效清除6-OHDA诱导的帕金森模型大鼠中脑黑质铁的沉积；（2）LA清除PD模型大鼠中脑SN过量铁沉积的分子机制是通过使II DMT1的表达明显下调，使Ferritin、FP1的表达明显上调，减少中脑神经细胞的铁的摄取，增加铁储存和加大铁的出胞作用，维持铁平衡的稳态。【关键词】帕金森病；α-硫辛酸；二价金属离子转运蛋白1；细胞膜铁转运蛋白1；铁蛋白III MechanismofalphalipoicacidinterveningonirondepositioninthesubstantianigraofParkinson'sdiseasemodelratMajor:NeurologyPostgraduate:XuLiSupervisor:JiaoLing[Abstract]Objective:Toexplorethemolecularmechanismofα-lipoicacid(LA)scavengingthemidbrainSNironaccumulation,throughobservingtheexpressionsofdivalentmetaltransport1(DMT1),Ferroportin1(FP1),andFerritininthemidbrainSNofthemodelratswith6-OHDAinducedParkinson'sdisease.Methods:130maleSDratswererandomlydividedinto5groups:ControlGroupof30rats(withintracranialinjectionofsalinesolution),then20ratsoutoftheControlGroupwereselectedrandomlyasShamoperatedGroupafterfourweeks;ModelGroupof100rats(withintracranialinjectionof6-OHDA),fourweekslater80ratsoutofModelGroupwererandomlydividedinto4groups:thePDModelGroup(20rats,injectionofnothing)andLowAgentGroup(20rats,injectionofLA),MediumAgentGroup(20rats,injectionofLA),andHighAgentGroup(20rats,injectionofLA).Unilateralintrastriatal6-OHDAinjection(rightside)wasperformedonanesthetizedratsusingstereotaxicapparatus.ControlGroupreceivedasingleinjectionof0.9%saline.LowAgentGroupreceivedasingleinjectionof25mg/kg/dofLA,MediumAgentGroupwasinjected50mg/kg/dofLA,andHighAgentGroupswasinjected100mg/kg/dofLAfor14consecutivedays.Afterthetreatment,therightmidbrainSNoftheratsinallgroupsweretakenfortheexaminationtotheexpressionlevelsofDMT1,FPl,andFerritinbyWestern-Blot.ThenumberoftheironpositivecellswithinSNwerecountedbythePrussianblueironstainmethod.Inaddition,theironcontentsofSNwasperformedusingtheatomicabsorptionspectrophotometer.Results:(1)ComparedtotheShamoperatedGroup,theexpressionlevelsofDMT1withinSNinthePDModelGroup,LowAgentGroup,MediumAgentGroup,andHighAgentGroupwereallsignificantlyincreased(P＜0.05),whiletheexpressionlevelsofFP1andFerritinwerebothreduced(P＜0.05);ThecontentofironandtheamountoftheironpositivecellsinSNofthePDModelIV Group,ofLowAgentGroup,ofMediumAgentGroup,ofHighAgentGroupwereallsignificantlyincreased(P＜0.05).(2)ComparedtothePDModelGroup,theexpressionlevelsofDMT1withinSNintheLowAgentGroup,MediumAgentGroup,andHighAgentGroupwereallsignificantlyreduced(P＜0.05),buttheexpressionsofFP1wereallsignificantlyraised(P＜0.05),theexpressionsofFerritinintheMediumAgentGroupandHighAgentGroupweresignificantlyupgraded(P＜0.05),whiletheexpressionsofFerritinwasnostatisticaldifferencesonintheLowAgentGroup(P＞0.05).ThecontentofironandthenumberofironcellsinSNoftheLowAgentGroup,MediumAgentGroup,andHighAgentGroupwereallsignificantlyreduced(P＜0.05).(3)ComparedtotheLowAgentGroup,theexpressionsofFP1andFerritinofSNintheMediumAgentGroup,andHighAgentGroupwerebothsignificantlyraised(P＜0.05),whiletheexpressionsofDMT1hadbeensignificantlyreduced.ThecontentsofironandthenumbersofironpositivecellsinSNintheMediumAgentGroup,andHighAgentGroupweresignificantlyreducedcomparedwithLowAgentGroup(P＜0.05).(4)ComparedbetweentheMediumAgentGroupandHighAgentGroup,theFP1andFerritininSNoftheHighAgentGroupweresignificantlyraised(P＜0.05),thenumberoftheironpositivecellsinSNoftheHighAgentGroupwassignificantlyreduced(P＜0.05),buttherewerenostatisticaldifferencesintheexpressionlevelsofDMT1orthecontentofironinSNoftheHighAgentGroup(P＞0.05).Conclusion:(1)LAcouldscavengthemidbrainSNironaccumulationby6-OHDAinducedParkinson'sdiseasemodelrats.(2)ThemolecularmechanismofLAscavengingthemidbrainSNironaccumulationarethroughthedown-regulationexpressionsofDMT1,andtheup-regulationexpressionsofFerroportin1(FP1),andFerritintosuppresstheoxidativestressresponseandmaintainthestablestatusofironbalance.[KeyWords]Parkinson'sdisease,α-lipoicacid,divalentmetaltransporter1,ferroportin1,FerritinV 目录原创性声明和版权使用授权书⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅰ中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅱ英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅳ目录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅵ略缩词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅷ引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯01第一部分α-硫辛酸对帕金森病模型大鼠黑质内铁含量及铁代谢相关蛋白的影响材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯04结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25第二部分α-硫辛酸对帕金森病模型大鼠黑质内神经胶质细胞及炎性因子的影响材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯44综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47VII 作者简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯62学位论文数据集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63VIII 英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称APOApomorphine阿扑吗啡APammoniumpersulfate过硫酸铵ADAlzheimer'sdisease阿尔兹海默病BBBBlood-brainbarrier血脑屏障CPceruloplasmin铜蓝蛋白DMT1divalentmetaltransporter1二价金属离子转运体1DAdopamine多巴胺DABdiaminobenzidin二氨基联苯氨DepDesipramine地西帕明DFODefetoxamine甲磺酸去铁胺FP1ferroportin1细胞膜铁转运蛋白1FerritinFerritin铁蛋白GSHglutathione谷胱甘肽GSH-PXglutathioneperoxidase谷胱甘肽过氧化物酶H2O2hydrogenperoxide过氧化氢HRPHorseradishPeroxidase辣根过氧化物酶HPhephaestin膜铁转运辅助蛋白LAα-lipoicacidα-硫辛酸LBLewy’sbody路易小体Lflactoferrin乳铁蛋白LPSliPoPolysacharid脂多糖MAO-BMonoamineoxidaseB单胺氧化酶BMDAMalondialdehyde丙二醛MPP+1-methyl-4-phenylpyridiniumion1-甲基-4-苯基吡啶离子MPTP1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶IX One-wayANOVAOne-wayAnalysisofvariance单因素方差分析OSOxidativestress氧化应激OH·hydroxylfreeradical羟自由基PDParkinson'sdisease帕金森病ROSreactiveoxygenspecies活性氧SNpc/SNcsubstantianigraparscompacta中脑黑质致密带SDS-PAGESDS-polyacrylamidegelelectrophoresisSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SODsuperoxidedismutase超氧化物歧化酶SNsubstantianigra黑质TfRtransferrinreceptor转铁蛋白受体Tftransferrin转铁蛋白THtyrosinehydroxylase酪氨酸羟化酶TNF-αTumornecrosisfactor-alpha肿瘤坏死因子-αTristrihydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷WBWesternBlot蛋白质印迹法6-OHDA6-hydroxydopamine6-羟基多巴胺X 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文0引言帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）是中老年常见的神经系统变性疾病，以中脑黑质致密部（substantianigraparscompacta，SNpc）多巴胺能神经元进行性变性缺失、纹状体多巴胺能水平下降为主要病变特征[1]。临床主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态异常等运动症状。迄今为止，其病因及发病机制尚未明确，也无较为显著的治疗方法。目前，PD发病机制尚不清楚，普遍认为其是多种因素共同导致，涉及家族遗传、环境毒物、氧化应激、神经免疫炎症、神经兴奋性毒性、凋亡、异常蛋白的集聚和能量代谢异常等因素[2]。越来越多的研究提示铁沉积与帕金森病发生密切相关。早在1924年，Lehermitt[3]首先发现PD患者黑质(substantianigra，SN)中铁含量明显高于正常人。1989年YoudimMB[4]等提出黑质部位的铁沉积是PD的病因之一的假说。尸检结果[5]提示帕金森病患者脑内有大量铁沉积，沉积的主要部位是黑质和苍白球。Oakley等[6]对PD运用电子探针X线显微分析技术检测也证明了SN神经元内铁含量出现了异常的沉积，且残存神经元的数目与铁的含量并无关系，说明了铁的异常沉积并非是神经元凋亡后的继发改变；同时也证实了SN神经元内铁的异常沉积是PD患者的特异性改变。舒红格等[7]应用核磁共振（MRI）对铁进行了定量研究，得出结论：PD的发病与脑局部铁含量的增加有关；PD铁异常沉积主要分布于壳核、黑质、苍白球、红核。PuYM等[8]也发现，在含低浓度铁的培养基中神经细胞可正常生长，而在含高浓度铁的培养基中，数日以后就出现大量的死亡，这些细胞的死亡原因是由于铁浓度的增高诱发的氧化应激反应所致。最近研究还发现在PD患者SN中超负荷铁离子的细胞毒性，以及过量铁诱导氧化应激反应促使自由基的产生可能是PD较为重要的病理机制[9]。一系列实验结果均表明，铁直接参与PD的神经变性改变。近年来关于脑内铁含量的增高以及与铁代谢相关蛋白的基因突变的研究发现，中枢神经系统铁代谢障碍所导致的铁水平的升高与多种神经退行变性疾病有关，包括在PD、阿尔兹海默病(AD)、多发性硬化（MS）、亨廷顿病（HD）等患者脑部特定的区域有明显的铁沉积[10,11]。铁代谢紊乱可能发生在铁代谢的各个阶段，包括铁的摄取、储存、释放、细胞代谢以及调节，而铁代谢的平衡有赖于各种相关蛋白的调节。在PD病人中，发现许多与铁代谢有关的蛋白质表达异1 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文常，如转铁蛋白（Tf）、转铁蛋白受体（transferrinreceptor，TfR）、二价金属离子转运蛋白1（divalentmetaltransporter1，DMT1）、细胞膜铁转运蛋白1（ferroportin1，FP1）、铁蛋白（Ferritin）等。这些蛋白的异常表达可能是PD黑质内铁增高的直接原因[12-14]。转铁蛋白（Tf）是脑内的主要铁运输蛋白。血液中的铁不能直接透过血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB)进入脑组织。血浆铁主要以Fe-Tf复合物的形式存在，但是转铁蛋白只能与Fe3+结合,因此由细胞中释放的Fe2+需要氧化为Fe3+才能与血浆中的Tf结合。体内的大多数细胞以内吞的方式通过膜表面的转铁蛋白受体(transferrinreceptor,TfR)将血液中的Fe-Tf摄入细胞内。DMT1和FP1分别对铁的转入和释放起着重要的作用，前者的主要功能是铁的摄取与转运，而后者是一种跨膜的铁转出蛋白；而Ferritin是脑内铁的结合蛋白，生理条件下，铁主要与它结合成Fe-Ferritin复合物，它可以降低脑组织中游离铁的浓度，脑组织中铁浓度升高会加速Ferritin的合成,以去除铁的毒性[15]。据文献报道[16]，在PD病人中脑黑质中，DMT1高表达，而FP1和Ferritin的表达降低。它们的共同作用导致铁代谢的紊乱，导致细胞内铁的积聚。铁对中枢神经系统的毒性作用主要表现为铁参与了氧化应激反应,并因此导致了细胞的损伤甚至死亡，而自由基的产生一直被认为是导致PD黑质多巴胺能神经元死亡的一个主要原因之一。大量研究显示PD的很多病理过程都有氧化应激的参与，其2++H-3+中铁作为电子供体，主要通过芬顿（Fenton）反应：（Fe2O2→OH·+OH+Fe）催化产生具有高度细胞毒性物质的OH·，它作用于蛋白质核酸和细胞膜，造成细胞损伤甚至死亡。然而在黑质内有恰好高浓度的抗坏血酸盐，能够将Fe3+还原为Fe2+，从而加重芬顿反应的发生，导致细胞的死亡[17]。迄今为止，帕金森病的治疗仍然是以多巴胺替代治疗为主，但药物治疗只能改善症状，不能阻止病情发展，需要终生服药[18-24]。其中以“美多芭”为主，该药在服用3-5年的“蜜月期”后会出现严重的副作用（异动症、开关现象、剂末现象、便秘等）以及疗效明显下降，而其他治疗方法，例如转基因、细胞移植、手术等，仍不成熟。因此，寻求新的治疗策略是帕金森病的研究热点。α-硫辛酸(Alpha-LipoicAcid，LA)，其化学名称为1，2-二硫戊环-3-戊酸，分子式为C[25]从猪肝中分离提取得到。研8H14O2S2，最初在1950年由Reed等究发现它具备抗氧化应激、螯合金属离子、抗炎、保护神经细胞等作用[26-30]，并2 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文同时具备脂溶性和水溶性、可通过血脑屏障、治疗剂量几乎无毒副作用的优势。前人在LA对于PD的作用机制方面进行了大量的动物模型及细胞模型的研究。Karunakaran[31]等研究表明，MPTP诱导的PD模型C57小鼠在LA干预后，可有效防止细胞凋亡信号通路的激活、线粒体功能障碍和相对的多巴胺能神经元的损失。Bilska等[32]运用腹腔注射LA干预利血平介导的PD模型大鼠，发现纹状体还原性谷胱甘肽（GSH）含量明显升高，一氧化氮（NO）产生减少，显著降低氧化应激水平。Fujita等[33]研究发现LA可抑制6-OHDA诱导PD模型大鼠活性氧（ROS）的生成和细胞凋亡，增加GSH水平。Zaitone等[34]应用LA干预鱼藤酮介导的PD模型大鼠，证实其可改善线粒体功能障碍和降低氧化应激，具备成为治疗早期PD药物的条件。DeAraujo等[35]通过口服给药的方式给予6-OHDA介导的帕金森病模型大鼠LA，探讨对行为学和神经化学物质的影响，证实其可降低氧化应激水平，改善病理行为学变化，提示硫辛酸可能是一个新的治疗帕金森病的药物。Jalali-Nadoushan等[36]对6-OHDA的PD模型大鼠采用LA预处理，结果表明可显著减少多巴胺能神经元的丢失，降低丙二醛（MDA）和亚硝酸盐的含量，改善超氧化物歧化酶（SOD）活性，证实LA可以减弱6-OHDA的神经毒性及氧化应激水平从而起到神经保护作用。王伟等[37]研究发现LA能有效减轻PD大鼠脑内氧化应激损伤、保护脑内多巴胺能神经体系，同时改善PD的症状。李艳花等[38]研究发现LA可能通过抑制脑内的炎症反应来缓解脂多糖（LPS）经鼻诱导的PD小鼠的行为学和病理学的改变。李大伟等[39]研究证实了LA可有效的防护MPP+对PC12细胞的毒性损伤作用，且可有效抑制ROS生成，为LA可能成为PD神经保护治疗药物提供了一定的理论基础。我们推测LA与铁离子螯合作用提示其可能在与铁积聚有关的一些疾病治疗的研究中具有潜力。故本实验通过应用6-OHDA建立PD模型大鼠，进一步探索铁沉积的发病机制；给予不同剂量硫辛酸干预治疗，观察不同剂量硫辛酸对PD模型大鼠黑质内铁含量、黑质内铁阳性细胞染色、铁离子相关转运蛋白的影响，旨在探讨硫辛酸与帕金森病铁代谢关键蛋白的调控关系，进一步为硫辛酸治疗帕金森病提供分子基础。为实现硫辛酸临床治疗帕金森病提供可靠的实验依据。3 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文第一部分α-硫辛酸对帕金森病模型大鼠黑质内铁含量及铁代谢相关蛋白的影响1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物与分组健康雄性SD大鼠130只，体重250～300g，贵阳医学院动物实验中心提供，动物合格证号：SYXK（黔）2012-0001。喂养条件包括标准饲料，清洁水，室温控制在22±1℃，湿度保持50%~60%，自然昼夜规律，通风良好，大鼠自由进食水和饲料。实验前，将动物置于实验环境中适应三天。大鼠随机分为对照组（颅内注射生理盐水）30只，其中术后4周在30只对照组中再随机取20只作为假手术组；模型组（颅内注射6-OHDA）100只，其中术后4周在100只6-OHDA大鼠中随机取80只成功模型组，再随机分为PD模型组和硫辛酸干预低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组20只。故本实验总共分为5组，假手术组20只，PD模型组20只，硫辛酸干预低、中、高剂量组各20只。1.1.2实验试剂6-羟基多巴胺(6-OHDA)美国Sigma公司抗坏血酸（L-ascorbicacid）美国Sigma公司地昔帕明（Desipramine）美国Sigma公司阿扑吗啡（Apomorphine，APO）美国Sigma公司石蜡德国Leica公司PVDF膜德国MerckMillipore公司BCA蛋白浓度测定试剂盒上海碧云天生物技术有限公司彩色预染蛋白质分子量标准上海碧云天生物技术有限公司SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)上海碧云天生物技术有限公司Western封闭液上海碧云天生物技术有限公司增强型HRP-DAB底物显色试剂盒北京天根生化科技有限公司DAB显色剂上海长岛生物技术有限公司增强型RIPA裂解液武汉博士德生物工程有限公司PMSF武汉博士德生物工程有限公司4 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文PBS缓冲液武汉博士德生物工程有限公司枸橼酸盐缓冲液武汉博士德生物工程有限公司多聚赖氨酸处理的防脱载玻片武汉博士德生物工程有限公司中性树胶北京索莱宝科技有限公司产品SDS-PAGE凝胶制备试剂盒北京索莱宝科技有限公司产品普鲁士蓝染色试剂盒北京索莱宝科技有限公司产品甘氨酸（Glycine）北京索莱宝科技有限公司产品三羟甲基氨基甲烷（Tris）北京索莱宝科技有限公司产品十二烷基硫酸钠（SDS）北京索莱宝科技有限公司产品Tween20北京索莱宝科技有限公司产品二甲苯天津市富宇精细化工有限公司苯重庆茂业化学试剂有限公司甲醇上海振兴化工一厂无水乙醇国药集团化学试剂有限公司优级纯硝酸国药集团化学试剂有限公司优级纯高氯酸国药集团化学试剂有限公司硝酸镁天津市科密欧化学试剂有限公司多聚甲醛天津市科密欧化学试剂有限公司水合氯醛中国医药集团上海化学试剂公司苦味酸上海通蔚实业有限公司50%戊二醛天津市科密欧化学试剂有限公司磷酸氢二钠重庆江川化工有限公司磷酸二氢钠重庆茂业化学试剂有限公司氢氧化钠成都金山化学试剂有限公司铁光谱标准溶液核工业北京化工冶金研究院生理盐水四川科伦药业有限公司硫辛酸注射液烟台只楚药业有限公司青霉素注射液哈药集团有限公司内参（GAPDH）抗体康成生物工程有限公司5 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文细胞膜铁转运蛋白（FP1）抗体北京博奥森生物技术有限公司铁蛋白（Ferritin）抗体北京博奥森生物技术有限公司二价金属转运蛋白1（DMT1）抗体北京博奥森生物技术有限公司酪氨酸羟化酶（TH）抗体武汉博士德生物工程有限公司即用型SABC-POD(小鼠IgG)试剂盒武汉博士德生物工程有限公司HRPAnti-RabbitIgG（二抗）武汉博士德生物工程有限公司HRPAnti-MouseIgG（二抗）武汉博士德生物工程有限公司实验用水为灭菌双蒸水1.1.3溶液配制（1）地昔帕明取100mg溶于10ml无菌生理盐水中。（2）10%水合氯醛10g水合氯醛溶于80ml灭菌双蒸水中，最后定容至100ml。（3）抗坏血酸取0.2mg溶于1ml无菌生理盐水中。抗坏血酸浓度为0.2mg/ml，即为0.02%。取10mg溶于1ml的无菌生理盐水中，即为1%。（4）6-OHDA称取5mg6-OHDA，溶于1ml含0.02%抗坏血酸的生理盐水中，最终6-OHDA在生理盐水中的浓度为5ug/ul。（5）阿扑吗啡10mg阿扑吗啡加1ml灭菌水配制成10mg/ml的溶液，然后加9ml含1%抗坏血酸的生理盐水，使其在生理盐水的最终浓度为10mg/ml。（6）0.2mol/L的PB称取5.2904g的NaH2PO4·2H2O和59.8448g的Na2HPO4·12H2O，加双蒸水800ml溶解，PH仪调至PH7.4，继续加双蒸水定容至1L。（7）灌注液（4%多聚甲醛磷酸缓冲液）称取60g多聚甲醛，溶于513ml的双蒸水中（置于磁力搅拌器上加热至30-40℃溶解，温度不超过60℃，必要时可加固体NaOH溶解），溶解后依次加入25%的戊二醛12ml，饱和苦味酸225ml，0.2mol/L的PB750ml，即为1500ml。6 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文PH仪调至PH7.4。（8）固定液称取8g多聚甲醛，溶于54.7ml的双蒸水中，加0.2mol/L的PB100ml，加双蒸水定容至200ml，PH仪调至PH7.4。（9）0.9%的无菌生理盐水称取9g氯化钠，溶于800ml的双蒸水中，加双蒸水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌后使用。（10）SDS-PAGE电泳缓冲液称取Tris15.1g，Glycine94g，SDS5.0g，加入800ml双蒸水搅拌充分溶解，继续加双蒸水定容至1L后，室温保存。（11）膜转移缓冲液（Western杂交用）称取Tris5.8g，Glycine2.9g，SDS0.37g，加入600ml双蒸水搅拌充分溶解后，加入200ml的甲醇，室温保存。（12）TBSTBuffer（Western杂交膜清洗液）称取NaCl8.8g，加1MTris-HCI（PH8.0）20ml，继续向烧杯中加入800ml的双蒸水，充分搅拌溶解，加入0.5mlTween20后充分混匀，继续加双蒸水定容至1L后，4℃保存。（13）封闭缓冲液（Western杂交用）称取0.5g脱脂奶粉加至10ml的TBSTBuffer中，充分搅拌使其溶解，4℃保存，必须现配现用。（14）α-硫辛酸（LA）每支LA为150mg，加3ml生理盐水充分溶解，最终浓度为50mg/ml。1.1.4实验仪器蓝星脑立体定位仪（ZH-蓝星C/s）淮北正华生物仪器设备有限公司微型颅骨钻上海雅颂医疗器械有限公司石蜡切片机德国Leica公司超声细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司电脑三恒多用电泳仪北京六一仪器厂制胶器北京六一仪器厂7 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文半干转膜仪北京六一仪器厂凝胶图像处理系统（Tannon1600）上海天能科技有限公司显微成像系统日本Nikon公司原子吸收分光光度计（WFX-210）北京北分瑞利分析仪器公司台式高速冷冻离心机（TGL16M）长沙迈佳仪器设备有限公司台立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-30Kb）上海申安医疗器械厂电热恒温水浴箱（600型三用水箱）金坛市富华仪器有限公司电子分析天平（AUX120）日本岛津公司PH测量仪（PHS-25）上海精科雷磁公司恒温磁力搅拌器金坛市富华仪器有限公司快速混匀器姜堰市新康医疗器械有限公司移液器（Eppendorf）德国艾本德公司微量进样器上海安亭微量进样器厂1.2方法1.2.1模型制备首先大鼠用Desipramine[40](25mg/kg,腹腔注射)提前30min预处理，水合氯醛(400mg/kg,腹腔注射)麻醉，麻醉以后将头部固定于立体定向仪上，使前后囟位于同一水平面上，眼科剪剪去颅顶鼠毛，常规备皮、消毒，手术刀依次切开头皮和皮下组织，钝性分离颅骨外膜，充分暴露前囟。齿杆较耳杆低2.4mm，采用单侧（右侧）纹状体两点定位法制备PD大鼠模型。根据Paxinos和Watson[41]大鼠脑立体图谱以前囟为零点进行定位确定两点坐标：(1)A/P:1.5mm,L/M:2.7mm,D/V:-4.5mm；(2)A/P:0mm,L/M:3.5mm,D/V:-5mm。在上述选定的坐标点用微型磨钻钻颅，第1、2坐标点如下图（图1-1，Fig.1-1），模型组每个点注射2μl6-OHDA到右侧纹状体（图1-2，Fig.1-2）；对照组每个点注射2μl含0.02%抗坏血酸的生理盐水到右侧纹状体。使用微量进样器以0.5μl/min的速度注入，注射完成后进样器留置10min，然后以1mm/min的速度缓慢退出，避免药物溢出，明胶海绵填充颅骨孔，局部消毒缝合头部皮肤，术中全程给予电热毯保温，待苏醒后置笼喂养。术后每天腹腔注射20万单位青霉素，连续7d以预防感染。8 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文图1-1两点定位法颅骨钻钻孔Fig.1-1two-pointlocatingmethoddrillingthroughskulldril图1-26-OHDA注入大鼠右侧纹状体内Fig.1-2Photoshowinginjecting6-OHDAintotherightstriatumofrat1.2.2行为学检测术后2、4周，将大鼠放置于圆柱形盒子(直径240mm,高300mm)中[42]，15min适应期过后，给予APO(0.5mg/kg)腹腔注射，诱发大鼠向健侧旋转行为。给药10min后观察记录其行为变化。表现为以健侧的后肢为支撑点，头尾相接、身体弯曲成环状、原地恒定的快速向健侧（左侧）逆时针旋转行为，旋转360°为一转（r）。摄像机连续记录40min，计算大鼠向左侧旋转的次数。平均转速超过7r/min者，视为成功模型[43,44]。1.2.3双侧纹状体、黑质酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化检测术后4周，随机取假手术组、PD成功模型大鼠各3只，10%水合氯醛腹腔9 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文注射麻醉，麻醉后迅速剪开胸腹腔暴露心脏，持9号针头从心尖部刺入左心室，剪开右心耳，快速灌注生理盐水以清除血液，直至右心耳中流出透明液体，肝脏变白，再灌注液换成含４%多聚甲醛的磷酸缓冲液250ml进行固定，灌注过程中大鼠躯体及四肢会出现不自主抽搐，灌注完成后，小心剪开颅骨分离出脑组织，置于后固定液中后固定12h。次日从固定液取出脑组织后沿脑组织进针孔位置横切为两段，双蒸水冲洗30分钟，30分钟后取出放于滤纸上吸干水分，然后放置于70%酒精中过夜。第三日从70%酒精中取出进行梯度脱水：依次放入70%酒精（1h）→80%酒精（1h）→90%酒精（1h）→95%酒精1（45min）→95%酒精2（45min）→100%酒精1（30min）→100%酒精2（30min）→半无水酒精半苯（30min）→苯1（过夜）。第四日进行包埋：依次放入苯2（1h）→半苯半石蜡56-60℃（30min）→石蜡1（56-60℃）30min→石蜡2（56-60℃）30min，包埋蜡熔化后倒至于均匀涂抹甘油的培养皿中，用镊子夹取脑组织后轻轻放置于培养皿中，小心用镊子赶去表面及组织周围气泡，待其凝固后放置于盛有双蒸水的烧杯中，蜡块自然漂浮后取出晾干水，标记。继而进行切片、贴片、烤片：把蜡块放置于56-58℃恒温箱中30min中，使蜡块软化。软化后进行修块，并使其粘附于蜡托上，固定于石蜡切片机上，装上刀片，调制6μm切片，注意观察切片解剖位置，收集纹状体及中脑黑质区切片，每隔5张选取一张切片。小心用镊子夹取切片放置于常温双蒸水中，再放置于52℃的恒温水浴烧杯中使蜡片展开，用多聚赖氨酸处理过的载玻片捞起，放置于37℃的恒温干燥箱中备用。次日将恒温干燥箱调至58-60℃烤片1h，使石蜡切片与载玻片牢牢粘附，防止脱片。彻底脱蜡至水：依次放入二甲苯1（30min）→二甲苯2（30min）→无水酒精1（4min）→无水酒精2（4min）→95%酒精（4min）→95%酒精（4min）→90%酒精（4min）→80%酒精（4min）→70%酒精（4min）→双蒸水（4min）。灭活内源性酶：30%H2O21份+双蒸水10份混合，室温5-10分钟，双蒸水洗2min×3次。热抗原修复：将切片侵入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0），电炉加热至沸腾后断电，间隔5-10分钟重复1-2次。自然冷却后用PBS缓冲液（pH7.4）洗2min×3次。滴加5%BSA封闭液，室温20min，甩去多余液体，不洗。滴加用PBS缓冲液（1:100）稀释的小鼠腹水单克隆（TH）抗体，37℃孵育2h（也可4℃过夜），PBS缓冲液（pH7.4）洗2min×3次。滴加生物素化山羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，PBS缓冲液（pH7.4）10 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文洗2min×3次。滴加试剂SABC，37℃孵育30min，PBS缓冲液（pH7.4）洗5min×4次。DAB显色：取1ml双蒸水，滴加A液、B液各一滴，混匀后加至切片，室温显色5-10min，双蒸水冲洗。切片依次经脱水、透明、封片：95%酒精1（3min）→95%酒精2（3min）→100%酒精1（3min）→100%酒精2（3min）→二甲苯1（9min）→二甲苯2（9min），切片滴上中性树胶，盖上盖玻片，赶走气泡。在显微镜下观察并成像，比较假手术组及成功模型组双侧纹状体、黑质TH染色差异。1.2.4硫辛酸干预术后4周，对硫辛酸低、中、高剂量组大鼠分别腹腔注射25mg/kg/d、50mg/kg/d、100mg/kg/d，连续14d[45-48]。1.2.5脑组织蛋白提取硫辛酸干预结束后，随机取假手术组、PD模型组和硫辛酸干预低、中、高剂量组各5只，大鼠冰上断头取脑，分离右侧黑质，手术切取脑组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸干组织表面液体，将组织称量后切成几个较小的组织块放入组织匀浆器中，取适当量的RIPA裂解液混匀，RIPA裂解液在使用前数分钟内加入PMSF，最终使PMSF的工作浓度为1mM；按组织净重（g）：裂解液(ml)=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，超声破碎，冰上孵育1小时，直至充分裂解。组织充分裂解后，12000r/min离心30min，取上清。1.2.6BCA法蛋白定量（1）取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。（2）取适量25mg/ml蛋白标准，稀释50倍至终浓度为0.5mg/ml。（3）根据样品数量，该实验样本共25个，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。（4）将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl。（5）加适当体积组织样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20μl。（6）各孔加入200μlBCA工作液，37℃放置20-30min。11 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文（7）测定562nm波长的吸光度。根据所得的标准曲线计算出样本的蛋白浓度。1.2.7WesternBlot法检测（1）制备浓缩胶及分离胶首先把制胶板固定在制胶架上，然后将分离胶缓慢加入两块制胶板之间，上层加少许水至胶板最上层，放入37℃恒温干燥箱使分离胶完全凝固，继而将上层水倒出，并用滤纸将水吸干，小心加入浓缩胶，插上梳齿，再次放入37℃恒温干燥箱待其凝固。SDS-PAGE分离胶和浓缩胶的配方如下（表1-1，Tab.1-1）和（表1-2，Tab.1-2）：表1-1：SDS-PAGE分离胶配方Tab.1-1：IngredientofSDA-PAGEseparationgel分离胶（12%）10mL（10%）10mLddH2O3.3mL4.0mL30%丙烯酰胺溶液(29:1)4mL3.3mL1.5MTris-HCI(pH8.8)2.5mL2.5mL10%SDS0.1mL0.1mL10%AP0.1mL0.1mLTEMED0.01mL0.01mL表1-2：SDS-PAGE浓缩胶配方Tab.1-2：IngredientofSDS-PAGEstackinggel浓缩胶（5%）5mLddH2O3.42mL30%丙烯酰胺溶液(29:1)0.83mL1MTris-HCI(pH6.8)0.625mL10%SDS0.05mL10%AP0.075mLTEMED0.0075mL（2）蛋白上样组织蛋白样本加入适当比例的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)，具体标准为12 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文样本与蛋白上样缓冲液的比例为4:1，混匀后放置于沸水浴中5min，促使蛋白变性。把制胶架放置到电泳槽内，在上下槽加入适量的1×电泳缓冲液（上槽应用新配的电泳缓冲液，下槽可用回收的电泳缓冲液），并将梳齿取出，第一孔加入适量的蛋白质分子量Marker，从第二孔起分别依次加入计算好的上样量加样：假手术组、PD模型组、LA低剂量组、LA中剂量组、LA高剂量组大鼠黑质组织蛋白样本。（3）电泳连接电源线，启动电源，加电压调为80V进行电泳，待蛋白Marker分开后，调整电压为120V继续电泳，至溴酚蓝迁移至分离胶底部时停止电泳，小心取下玻璃板及凝胶。蛋白Marker的分子量依次为170kDa，130kDa，95kDa，72kDa，55kDa，43kDa，34kDa，26kDa，17kDa，10kDa(其中72kDa为红色，10kDa为绿色，其余为蓝色)。（4）转膜（半干转）电泳结束后，将凝胶放于膜转移缓冲液中浸泡。将与凝胶大小一致的PVDF膜（做好正反及条带标记）浸于100%甲醇5min后，再放在膜转移缓冲液中浸泡。将与凝胶大小一致的8层滤纸浸于膜转移缓冲液中，完全排除气泡。最先整齐放置4层滤纸，将凝胶对齐置于4层滤纸上，PVDF膜对齐置于凝胶上，最上面对齐放置4层滤纸，每层均要注意排除气泡，按照转膜装置上的电极表示正确放置，黑端为负极，红端为正极，根据PVDF膜面积的两倍设置恒定电流转移1h，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。（5）抗体孵育转膜完成后，置于TBST溶液中清洗膜5min，然后将上述PVDF膜浸泡于5%脱脂奶粉封闭液封闭1h。封闭后经TBST漂洗5min×3次后，PVDF膜转入用TBST稀释的RabbitAnti-FP1抗体（1:300），4℃过夜。次日取出，室温孵育1h，TBST洗膜5min×3次后，加入TBST稀释的Anti-rabbitIgG/HRP（1:1000），低速摇床上孵育2h，TBST洗膜5min×3次。RabbitAnti-DMT1抗体（1:200），RabbitAnti-Ferritin抗体（1:300）的孵育同上步骤。MouseAnti-GAPDH抗体（内参抗体，1:0000）次日加二抗为Anti-MouseIgG/HRP（1:1000），其余同上步骤。（6）蛋白质染色13 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文分别取增强型HRP-DAB底物显色试剂盒中试剂A50ul、试剂B50ul、试剂C50ul加入装有1mL的1×HRP反应缓冲液中，将PVDF膜转入平皿中，加入配好的显色剂，静置避光显色，显色时间根据条带出现及背景染色的情况而定，一般5min左右，不超过30min。双蒸水终止反应，然后将显色后的膜拍照且过塑保存。（7）图像条带处理以GAPDH为内参，应用ImageJ软件测量并计算各个目的蛋白条带与GAPDH蛋白条带灰度值的比值，进行统计学处理。1.2.8普鲁士蓝铁染色（Perlsstain）硫辛酸干预结束后，随机取假手术组、PD模型组和硫辛酸干预低、中、高剂量组各5只，大鼠脑组织灌注、固定、脱水、石蜡包埋、脑组织切片步骤同上。切片常规脱蜡至水后进行染色：切片入等体积的PerlsstainA1(亚铁氰化钾)与PerlsstainA2(稀盐酸)的混合液30min，双蒸水充分冲洗5min×3次，放入PerlsstainB（伊红染色液）复染30s，双蒸水冲洗5s。然后切片依次经脱水、透明、封片。在显微镜下观察并摄影。每只大鼠随机选取损毁侧（右侧）5张切片，每张切片随机选取4个高倍视野（HP，400×），在同一视野面积，同一放大倍数，同一背景光强度下采集图像。采用Image-ProPlus6.0图像分析系统软件统计铁染色阳性细胞数。1.2.9原子吸收分光光度计测定大鼠中脑黑质区铁含量硫辛酸干预结束后，随机取各组大鼠各5只，断颈处死大鼠后分离右侧脑黑质区称重，加入适量体积的混合酸(高氯酸：硝酸=1:4)，依次经过微波消解，挥酸处理，容量瓶定容。将铁光谱标准溶液（50mg/L）用5%稀硝酸分别稀释100倍、50倍、25倍、16.7倍和12.5倍，配制浓度分别为0、0.5ug/mL、1.0ug/mL、2.0ug/mL、3.0ug/mL和4.0ug/mL的铁溶液上机测定，绘制标准曲线。设定仪器参数：波长为248.3nm，燃烧器高度为9mm，狭缝为0.2nm，灯电流为12mA，乙炔流量为2.2升/分，空气流量为15.0升/分。用原子吸收分光光度计火焰法连续测定空白管和样品管三次，记录248.3nm的吸光度，分析数据[49-54]。1.2.10统计学处理应用SPSS19.0软件，计量资料以均数±标准差（⎯χ±s）表示，计量资料符14 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文合正态分布者，采用单因素方差（One-wayANOVA）分析数据，组间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1帕金森病模型大鼠的行为学变化100只颅内定向注射6-OHDA的SD大鼠4周后有3只死亡，97只腹腔注射阿扑吗啡（APO）后，91只均出现偏侧（向左）旋转行为（图2-1，Fig.2-1）；86只大鼠左侧旋转圈数＞7r/min；假手术组30只无死亡，注射APO也无旋转行为，LA干预结束后，高剂量组死亡1只。图2-1帕金森模型大鼠腹腔注射阿扑吗啡后的偏侧旋转行为Fig.2-1PhotoshowingtherotationalbehaviorofPDmodelratafterAPObyintraperitonealinjection2.2PD大鼠右侧纹状体双靶点6-OHDA立体定位注射成功干预结束后灌注取材，脑组织经后固定24h后取出，表面观可见右侧两个进针孔，矢状位切开可见针道，垂直于脑表面，且均定位于右侧纹状体（图2-2，Fig.2-2）。图2-26-OHDA损毁侧大鼠脑组织经多聚甲醛灌注后两个进针孔的表面观（A）、纹状体第一定位点进针道（B）、纹状体第二定位点进针道（C）。Fig.2-2braintissuein6-OHDAlesionedratbyparaformaldehyde-perfusedhastwopinholeslookingfromthesurface(A);thefirst(B)andsecond(C)positioningpointtractintherightstriatum15 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文2.3假手术组及模型组大鼠双侧纹状体、黑质TH免疫组化结果如图所示（图2-3，Fig.2-3），假手术组大鼠纹状体TH免疫组化染色（图A）可见两侧纹状体TH免疫阳性纤维密集；两侧黑质致密部TH免疫组化染色（图B）可见大量TH阳性神经元，形态完整，突触细长密集，排列整齐，呈条带状。模型大鼠损毁侧（右侧）纹状体TH染色（图C）可见TH免疫阳性纤维数量明显减少、分布稀疏，而其左侧纹状体TH免疫阳性纤维密集；损毁侧（右侧）黑质TH染色（图D）可见TH阳性神经元数量明显减少，接近耗竭，右侧黑质致密部DA能神经元数量明显减少，胞体皱缩变小，结构不清，而其左侧黑质致密部DA能神经元核大而圆，胞浆丰富，形态完整，突触细长密集，数量较多。图2-3假手术组大鼠纹状体（A）、中脑黑质（B）和成功模型组大鼠纹状体（C）、黑质（D）TH免疫组化染色（40×）Fig.2-3THimmunohistochemistryinstriatum(A)andsubstantianigra(B)ofshamgrouprat,instriatum(C)andsubstantianigra(D)ofPDmodelgrouprat（40×）2.4硫辛酸对各组大鼠黑质内DMT1、FP1、Ferritin的表达水平的影响如图所示（图2-4，Fig.2-4），与假手术组比较，PD模型组、LA低、中、高剂量组DMT1表达均明显增加（P＜0.05），FP1、Ferritin的表达水平均明显减少（P＜0.05）；与PD模型组比较，LA低、中、高剂量组DMT1表达均显著16 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文下调（P＜0.05），FP1表达均显著上调（P＜0.05），LA中、高剂量组Ferritin表达显著上调（P＜0.05），但PD模型组、LA低剂量组Ferritin表达无统计学差异（P＞0.05）；与LA低剂量组比较，LA中、高剂量组FP1、Ferritin表达均显著上调（P＜0.05），DMT1表达显著下调；与LA中剂量组比较，LA高剂量组FP1、Ferritin均明显上调（P＜0.05），但LA中、高剂量组之间DMT1的表达水平均无统计学差异（P＞0.05）。注：各组的上标a、b、c、d、e分别代表各组间比较的结果。即相同字母所在的组别之间比较无统计学差异（P＞0.05），不同字母所在的组别之间比较有统计学差异（P＜0.05）。图2-4各组大鼠右侧中脑黑质DMT1(A)、Ferritin(B)、FP1(C)的相对蛋白表达量的比较Fig.2-4TherelativeproteinexpressionofDMT1(A),Ferritin(B)andFP1(C)ontherightsideofsubstantianigraineachgrouprats2.5普鲁士蓝铁染色如图所示（图2-5，Fig.2-5），黑质区域铁阳性细胞染色呈亮蓝色。假手术组大鼠黑质铁染色阳性细胞极少，其余各组大鼠黑质区域均能看到铁染色阳性细胞。它主要集中在中脑黑质致密部，少量分布于黑质网状部，形状不规则。与假手术组比较，PD模型组、LA低、中、高剂量组大鼠黑质铁阳性细胞数量均明显增加（P＜0.05）；与PD模型组比较，LA低、中、高剂量组黑质铁阳性细胞数量明显减少（P＜0.05）；与LA低剂量组比较，LA中、高剂量组大鼠黑质铁阳性细胞数量明显减少（均P＜0.05）；与LA中剂量组比较，LA高剂量组大鼠黑质铁阳性细胞数量明显减少（P＜0.05），见(表2-1，Tab.2-1)。图2-5显微镜下示各组大鼠铁染色阳性细胞在大鼠右侧黑质致密部分布情况（A:假手术组；B:PD模型组；C:LA低剂量组；D:LA中剂量组；E:LA高剂量组）(400×)17 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文Fig.2-5Microphotographsshowingironstainingpositivecellsintherightsidesubstantianigraparscompactaofratsinshamgroup(A),PDmodelgroup(B),lipoicacidinlow(C),medium(D)andhigh(E)dosegroups,respectively.(400×)表2-1各组大鼠右侧黑质区域铁染色阳性细胞数目的比较（⎯χ±s，个/HP，n=5）Tab.2-1Thenumberofironstainingpositivecellsintherightsidesubstantianigraparscompactaofratsineachgroup组别铁染色阳性细胞数假手术组0.28±0.09210.32±0.489aPD模型组9.36±0.276abLA低剂量组7.28±0.268abcLA中剂量组4.60±0.300abcdLA高剂量组注：aP＜0.05与假手术组相比；bP＜0.05与PD模型组比较；cP＜0.05与LA低剂量组比较；dP＜0.05与LA中剂量组比较。2.6原子吸收分光光度计火焰法检测各组大鼠黑质内铁含量的结果如图所示（图2-6，Fig.2-6），为液体进样法绘制的铁标准曲线。与假手术组比较，PD模型组、LA低、中、高剂量组大鼠黑质铁含量均明显增加（P＜0.05）；与PD模型组比较，LA低、中、高剂量组黑质铁含量明显减少（P＜0.05）；与LA低剂量组比较，LA中、高剂量组大鼠黑质铁含量明显减少（均P＜0.05）；LA中、高剂量组大鼠黑质铁含量无统计学差异（P＞0.05），见（表2-2，Tab.2-2）。18 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文图2-6铁标准曲线Fig.2-6Ironstandardcurve表2-2各组大鼠右侧黑质区域铁含量的比较（⎯χ±s，ug/g，n=5）Tab.2-2Thecontentofironintherightsidesubstantianigraparscompactaofratsineachgroup组别铁含量假手术组37.85±1.97115.32±6.61aPD模型组96.98±3.80abLA低剂量组81.36±3.43abcLA中剂量组72.77±2.59abcLA高剂量组注：aP＜0.05与假手术组相比；bP＜0.05与PD模型组比较；cP＜0.05与LA低剂量组比较。3讨论PD是一种以黑质部位DA能神经元进行性减少为特征的神经变性疾病，最终导致脑内多巴胺含量减少，从而出现一系列运动障碍为主的临床综合征。发病机制至今尚不完全清楚。然而铁在中脑黑质部位的异常沉积被认为是PD发病的重要因素之一。Lehermitt[3]首先在1924年就发现PD患者SN中铁含量明显高于19 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文正常人。Becker[55]等在1995年首次将头颅超声高信号作为PD的典型特征，后来证实头颅超声高信号主要是由中脑黑质部铁沉积引起。Oakley[6]等运用电子探针X线证明了SN神经元内铁含量出现了异常的沉积，且铁含量与残存神经元的数目并无关系，说明了铁异常沉积是导致PD的原因而并非是结果。应用磁共振成像技术（MRI）的大量研究得出一系列结论：PD的发病与脑内局部铁含量的增加有关；壳核、黑质、苍白球、红核为PD铁异常沉积的部位；并且发现在PD的亚临床期就有铁的异常沉积，铁水平的不断增高与PD病程的进展相一致[7,56-65]。一种理想的可以模拟PD临床和病理特征的动物模型对于研究PD的发病机制和治疗干预显得非常重要。本实验采用纹状体立体定位技术定向注射6-OHDA的方法建立PD大鼠模型，究其原因是6-OHDA化学结构与DA相似，通过轴突的逆行转运至黑质内的神经元胞体,可选择性地破坏DA能神经元而出现类似人类帕金森病的症状。由于6-OHDA必须通过轴突逆向转运才能到达中脑黑质，因此多巴胺能神经元的死亡是一种渐进的过程，和黑质直接毁损法相比，这种损伤过程更接近于人类PD发病的临床特点，同时避免了对黑质的直接机械性损伤，它的意义明显要高于黑质直接毁损法，目前此种方法得到普遍认可[66-68]。目前的研究发现，6-OHDA模型大鼠黑质致密部铁沉积明显增多[69]。其机制可能是6-OHDA到达中脑黑质后分解后产生ROS，导致氧化应激；通过MAO-B产生H2O2；并且6-OHDA能使铁离子从铁蛋白中释放，然而恰恰在黑质内有高浓度的抗坏血酸盐，能够将Fe3+还原为Fe2+，二价铁离子作为电子供体催化产生高2++H-度细胞毒性的羟自由基（OH·），具体通过Fenton反应：（Fe2O2→OH·+OH+Fe3+），不断增加游离铁含量，从而导致铁的沉积，继而产生越来越多的具有高度细胞毒性OH·，它作用于蛋白质核酸和细胞膜，造成细胞损伤及死亡[70-72]。据文献报道，单靶点注射造模成功率降低，在黑质内仍可见到40%-50%的DA能神经元残存，只有当黑质部位的DA能神经元毁损超过90%时，才会出现相应的行为学变化[73]。单点毁损纹状体所破坏DA能神经元的比例不足以达到90%，因而造成行为学变化阳性率较低；同时纹状体解剖结构相对较大，易于定位，这使得双靶点定向注射可以成功进行。故本实验采用双靶点纹状体定向注射方法进行造模。20 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文应用6-OHDA立体定向注射损毁黑质-纹状体DA通路后，造成中脑黑质DA神经元丢失，从而导致黑质内DA含量减少，导致大鼠两侧大脑半球功能不对称。损伤侧突触后膜DAD2受体由于失神经支配而处于超敏状态，APO是突触后膜DAD2受体激动剂，引起损伤侧D2受体过度兴奋强于健侧D2受体，从而诱导模型动物产生健侧旋转[74]。本实验定向注射右侧纹状体，故成功模型大鼠向左侧旋转。这种旋转行为可量化其损伤，每分钟旋转次数超过7次的大鼠被选择用于后期实验，从而判断是否造模成功，目前是公认的评价大鼠PD模型制备成功的金标准[75]。本实验造模为偏侧帕金森病模型大鼠，建模两周后给予腹腔注射DA受体激动剂APO检测模型是否成功。本实验造模成功率为86%，故再次验证双靶点注射高效可靠稳定。生理情况下，铁是中枢神经系统代谢中不可或缺的辅助因子，它参与氧化磷酸化、髓鞘及神经递质的合成、一氧化氮的代谢和氧的运输，在电子传递中起着极其重要的作用[76]。所以，铁的代谢对脑组织的功能活动极其重要。正常脑组织内铁的分布具有组织差异性，其含量从低至高依次是小脑、大脑白质、尾状核、黑质、壳核及苍白球，脑铁含量最丰富的区域也是DA能神经元聚集的区域，即苍白球、壳核及黑质。有研究表明正常人黑质网状带的铁含量比黑质致密带（SNc）高，但PD患者黑质铁沉积具有一定的部位特异性，主要发生在SNc，这也表明SNc的铁沉积在PD发病中发挥了独特的作用。铁在脑内的代谢包括对铁的摄取、储存以及释放等过程。其中铁代谢的关键蛋白TfR、DMT1（铁摄取）；Ferritin（铁储存）；FP1（铁释放）参与了脑内铁离子的代谢过程，共同维持脑内铁的稳态和平衡[77,78]。胃肠道吸收入血的Fe3+无法直接通过血脑屏障，需与Tf结合，当血浆中的Fe3+-Tf复合物被转运至血脑屏障时，需与血脑屏障内皮细胞上的转铁蛋白受体（TfR）结合才能进入脑内[17],在内涵素包被的凹陷部位内吞进入细胞形成内吞小体，如果TfR异常过度的表达，就会增加脑铁的过量摄入。随后在质子泵的作用下，内吞小体中的pH值下降到5.5-6.5左右，铁与Tf的结合力减弱，从Fe-Tf-TfR复合物中释放出来并被还原为Fe2+。Fe2+再经由DMT1介导Fe2+跨越内吞小体膜进入脑毛细血管内皮细胞胞质内，然而当DMT1作为重要的金属离子转运体过度表达，会造成脑内铁代谢的失控及紊乱[79-81]。而胞质中的一部分铁离子进入线粒体，另一部分转化成21 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文主要的储铁蛋白，即铁蛋白（Ferritin）[82]。Ferritin是脑内最主要的储铁蛋白，其主要功能是回收铁以用于血红素合成以及螯合游离铁保护细胞不受氧化损伤。当细胞缺乏铁时，铁从铁蛋白中分离出来以供细胞利用；当细胞内的铁含量高于细胞代谢所需要的水平时就会诱发铁蛋白的合成，这样铁就以一种无毒形式储存下来。但若Fe-ferritin复合物结构被破坏，则可以引起脑铁聚集[83,84]。FP1是一种跨膜的铁输出蛋白，广泛分布于机体各组织中，它可将铁从细胞中转出，但需膜铁转运辅助蛋白（HP）或铜蓝蛋白（CP）的协助下完成。FP1功能缺失会引起铁代谢的紊乱，导致细胞内铁的积聚[81]。本实验结果证实，6-OHDA致PD大鼠脑黑质DMT1表达较假手术组显著升高，而FP1和Ferritin表达则显著减低。DMT1表达增加使细胞内铁摄取增加，Ferritin表达减少使细胞游离铁增加，FP1表达减少使细胞内铁转出减少，从而使细胞内铁离子大量积聚，过量的铁离子可通过Fenton反应促进氧化应激，最终导致DA能神经元死亡。这与宋杨文等[16]的研究发现PD患者黑质DMT1表达持续增加，FP1表达持续降低，PD患者脑内铁异常沉积和DMT1表达恰在同一部位相吻合。这些事实证明了铁代谢蛋白DMT1的表达增加和FP1的表达降低参与了黑质铁聚集的发生发展过程。同时利用普鲁士蓝铁染色方法发现6-OHDA致PD大鼠中脑黑质铁阳性细胞数量较假手术组显著升高，证明了铁在黑质内的沉积。从细胞形态上判断铁阳性细胞可能是胶质细胞，并非是神经元。也不可能是星形胶质细胞，因为星形胶质细胞是啮齿类动物中唯一不含铁及相关蛋白的神经胶质细胞。这与刘卓等[82]关于铁的分布具有细胞差异性，小胶质细胞和少突胶质细胞均含有大量的铁，其中以少突胶质细胞含铁量最高的研究结果相符。最值得重视的是本实验利用原子吸收分光光度计检测6-OHDA的PD大鼠中脑黑质铁含量，结果为PD大鼠中脑黑质铁含量明显高于假手术组，直接客观的证明了PD大鼠中脑黑质铁的沉积。到目前为止，PD的治疗仍然是以多巴胺替代治疗为主，在治疗后期会产生严重的毒副作用以及疗效明显下降，而其他治疗方法，如细胞移植、转基因、脑部手术等，仍不成熟，无法大规模应用于临床，亦不能彻底治愈PD。因此，寻求新的治疗方法是PD研究的热点。鉴于铁异常沉积在PD发病机制中的重要地位，研究开发安全、有效的铁离子螯合剂用来抑制或减轻中脑黑质的铁聚集是PD治疗的新靶点。铁螯合剂与铁离子的紧密结合可以阻止铁促进氧化应激反应22 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文的能力，干扰Fenton反应，直接阻断自由基的生成，还可通过阻止铁与黑色素的结合从而抑制Fe2+通过再循环而激发OH·的生成。现有的铁螯合剂，例如去铁胺、去铁酮、氯碘羟喹、地拉罗司等，存在各种各样的缺陷及毒副作用，限制了它们在临床上的研究及应用。例如，去铁胺无法透过血脑屏障，与增强血脑屏障（BBB）通透性的药物合用时有明显的眼和脑毒性。去铁酮有胃肠道反应、关节疼痛、肝功能异常和锌缺乏等副作用，较严重的副作用就是粒细胞缺乏症。临床上大约有三分之一患者因副作用大而不能坚持服药。氯碘羟喹会产生严重的眼毒性、肝肾毒性、生殖系统毒性，视神经、脊髓神经毒性。地拉罗司可能具备肾毒性，包括肾衰竭；肝毒性，包括肝衰竭；胃肠道出血等。因此，多年以来科学家一直致力于寻找吸收好、毒副作用小的新型铁螯合剂。LA及其还原态DHLA是均高效抗氧化剂。在细胞内，LA是α-酮酸脱氢酶的必须辅基，在线粒体能量代谢中起重要作用，并且可在线粒体内合成，还可以从食物中完整吸收。目前发现LA具有以下特性：LA是目前已知唯一的同时在脂溶性和水溶性环境中都能发挥抗氧化性能的物质，因此易于被细胞吸收，广泛分布于各组织器官。据文献报道，LA可显著降低脑组织中丙二醛（MDA）和活性氧簇（ROS）的生成，增加还原型谷胱甘肽（GSH）的含量，降低氧化应激水平[37]，LA亦可通过提高内源性抗氧化剂及抗氧化酶的形成进而提高机体抗氧化能力，LA作为天然抗氧化剂，其抗氧化能力是一般抗氧化剂所不能及，因而被医学界誉为“万能抗氧化剂”。LA易于通过血脑屏障，并能迅速在大脑中扩散。硫辛酸是天然的金属螯合剂；一般来说，LA更容易与Cu2+、Zn2+、Pb2+结合，不易于Fe2+结合；但DHLA与Cu2+、Zn2+、Pb2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+等离子均具有较强的结合能力。研究已经发现，LA具有清除自由基、抗炎、保护神经细胞的作用，对脑缺血再灌注的保护作用十分明显[26,85-87]。LA现应用于肝病、糖尿病、阿尔兹海默病、血管性痴呆、牛皮癣、湿疹、风湿病、心脏病等疾病的治疗[26,27,88]。在LA应用于帕金森动物模型和细胞模型的研究中证实，它可以明显改善认知功能、降低脑内氧化应激水平、抑制神经胶质细胞过度表达、保护多巴胺能神经元[31-39,89-94]。迄今为止，尚未发现LA作为铁螯合剂应用于PD动物模型的干预研究，并且目前没有文献报道LA应用于帕金森病的临床治疗。值得瞩目的是，LA的治疗剂量几乎没有明显毒副作用。综上所述，LA具备了清除PD模23 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文型大鼠中脑黑质铁沉积的条件。本实验通过腹腔注射给予不同剂量硫辛酸干预治疗，应用原子吸收分光光度计测得干预后LA低、中、高剂量组大鼠黑质铁含量较PD模型组明显降低；利用普鲁士蓝染色发现铁阳性细胞数量较PD模型组明显减少；本研究发现给予铁螯合剂LA后，对DMT1、Ferritin、FP1的表达有明显的调节作用，使DMT1的表达显著降低，Ferritin、FP1的表达显著增高。这与熊珮[95]关于黄芩苷抑制鱼藤酮诱导的帕金森模型大鼠铁积聚及黑质DMT1、FP1的影响的研究一致。所以我们推测LA的作用机制是通过调节铁代谢相关蛋白，使DMT1的表达降低，从而减少细胞对铁离子的摄取；使FP1的表达增高，增加细胞内游离铁的释放；从而抑制Fenton反应，阻断具有高度细胞毒性OH·的生成，抑制铁诱导的氧化应激反应，从而调节ferritin的表达，恢复了ferritin的活性，进而使游离Fe以铁蛋白的形式储存下来，从而减少细胞死亡，这可能是其清除脑内过量铁、保护DA神经元的机制之一。此结果提示了LA作为铁鳌合剂在治疗PD中的意义和价值。然而令人遗憾的是，本实验关于TfR的WesternBlot检测可能由于技术的不成熟、方法的不完善、条件的不足等原因至今未能得出结果，这使得在探索研究铁摄取这一过程中不能很好的了解TfR所发挥的作用，也无法确定在LA干预后对TfR表达的影响，但是在随后的实验研究中我们必定完善实验方法、改善实验条件、弥补技术上的不足跨越这一障碍。4结论4.1PD模型大鼠中脑黑质铁含量明显升高。4.2PD模型大鼠中脑黑质铁阳性细胞数量明显增多，推测可能是小胶质细胞和少突胶质细胞。4.3PD模型大鼠中脑黑质DMT1表达明显增高，Ferritin、FP1表达明显降低。4.4LA通过调控铁代谢相关蛋白的表达，可以减少PD模型大鼠中脑黑质的铁含量及铁阳性细胞数量，从而清除中脑黑质过量铁的沉积，进而抑制铁诱导的氧化应激反应，维持铁平衡的稳态。24 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贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文[94]deAraujoDP,DeSousaCN,AraujoPV,etal.Behavioralandneurochemicaleffectsofalpha-lipoicAcidinthemodelofParkinson'sdiseaseinducedbyunilateralstereotaxicinjectionof6-ohdainrat[J].EvidBasedComplementAlternatMed.2013,2013:571378.[95]熊珮.黄芩苷对帕金森病大鼠多脑区铁积聚及黑质DMT1、FP1的影响[D].首都医科大学,2013.32 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文第二部分α-硫辛酸对帕金森病模型大鼠黑质内神经胶质细胞及炎性因子的影响近年来，越来越多的研究证实神经炎症反应也参与了帕金森病的发病[1-4]。其中小胶质细胞和星形胶质细胞所介导的神经炎症愈发受到重视。小胶质细胞和星形胶质细胞在脑中存在静息、适度活化、异常激活三种状态。当被异常激活时分泌大量的致炎细胞因子如：肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、一氧化氮（NO）、干扰素-γ(IFN-γ)、趋化因子等，表现出对神经元的损伤作用，其中公认以TNF-α、IL-1β的细胞毒性较强[5-10]。故本实验通过应用6-OHDA建立PD模型大鼠，进一步探索PD炎症的发病机制；给予不同剂量硫辛酸干预治疗，观察不同剂量硫辛酸对PD模型大鼠黑质内小胶质细胞、星形胶质细胞、炎性因子TNF-α、IL-1β的影响，旨在探讨硫辛酸与帕金森病神经炎症反应的关系，进一步为硫辛酸治疗帕金森病提供分子基础。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物与分组健康雄性SD大鼠50只，体重250～300g，贵阳医学院动物实验中心提供，动物合格证号：SYXK（黔）2012-0001。饲养条件同上。大鼠随机分为假手术组组（颅内注射生理盐水）8只；模型组（颅内注射6-OHDA）42只，随机取其中的成功模型大鼠32只随机分为PD模型组和硫辛酸干预低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组8只。1.1.2实验试剂6-羟基多巴胺(6-OHDA)美国Sigma公司抗坏血酸（L-ascorbicacid）美国Sigma公司地昔帕明（Desipramine）美国Sigma公司阿扑吗啡（Apomorphine，APO）美国Sigma公司石蜡德国Leica公司PVDF膜德国MerckMillipore公司BCA蛋白浓度测定试剂盒上海碧云天生物技术有限公司彩色预染蛋白质分子量标准上海碧云天生物技术有限公司33 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)上海碧云天生物技术有限公司Western封闭液上海碧云天生物技术有限公司增强型HRP-DAB底物显色试剂盒北京天根生化科技有限公司DAB显色剂上海长岛生物技术有限公司增强型RIPA裂解液武汉博士德生物工程有限公司PMSF武汉博士德生物工程有限公司PBS缓冲液武汉博士德生物工程有限公司枸橼酸盐缓冲液武汉博士德生物工程有限公司多聚赖氨酸处理的防脱载玻片武汉博士德生物工程有限公司中性树胶北京索莱宝科技有限公司产品SDS-PAGE凝胶制备试剂盒北京索莱宝科技有限公司产品甘氨酸（Glycine）北京索莱宝科技有限公司产品三羟甲基氨基甲烷（Tris）北京索莱宝科技有限公司产品十二烷基硫酸钠（SDS）北京索莱宝科技有限公司产品Tween20北京索莱宝科技有限公司产品二甲苯天津市富宇精细化工有限公司苯重庆茂业化学试剂有限公司甲醇上海振兴化工一厂无水乙醇国药集团化学试剂有限公司多聚甲醛天津市科密欧化学试剂有限公司水合氯醛中国医药集团上海化学试剂公司苦味酸上海通蔚实业有限公司50%戊二醛天津市科密欧化学试剂有限公司磷酸氢二钠重庆江川化工有限公司磷酸二氢钠重庆茂业化学试剂有限公司氢氧化钠成都金山化学试剂有限公司生理盐水四川科伦药业有限公司硫辛酸注射液烟台只楚药业有限公司青霉素注射液哈药集团有限公司34 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文内参（GAPDH）抗体康成生物工程有限公司TNF-α抗体武汉博士德生物工程有限公司IL-1β抗体北京博奥森生物技术有限公司胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体武汉博士德生物工程有限公司小胶质细胞离子钙接头蛋白（AIF1/IBa1）抗体武汉博士德生物工程有限公司小胶质细胞离子钙接头蛋白（AIF1/IBa1）抗体北京博奥森生物技术有限公司即用型SABC-POD(兔IgG)试剂盒武汉博士德生物工程有限公司HRPAnti-RabbitIgG（二抗）武汉博士德生物工程有限公司HRPAnti-MouseIgG（二抗）武汉博士德生物工程有限公司1.1.3溶液配制同第一部分1.1.4实验仪器蓝星脑立体定位仪（ZH-蓝星C/s）淮北正华生物仪器设备有限公司微型颅骨钻上海雅颂医疗器械有限公司石蜡切片机德国Leica公司超声细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司电脑三恒多用电泳仪北京六一仪器厂制胶器北京六一仪器厂半干转膜仪北京六一仪器厂凝胶图像处理系统（Tannon1600）上海天能科技有限公司显微成像系统日本Nikon公司台式高速冷冻离心机（TGL16M）长沙迈佳仪器设备有限公司台立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-30Kb）上海申安医疗器械厂电热恒温水浴箱（600型三用水箱）金坛市富华仪器有限公司电子分析天平（AUX120）日本岛津公司pH测量仪（PHS-25）上海精科雷磁公司恒温磁力搅拌器金坛市富华仪器有限公司快速混匀器姜堰市新康医疗器械有限公司移液器（Eppendorf）德国艾本德公司微量进样器上海安亭微量进样器厂35 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文1.2方法1.2.1模型制备、行为学检测、硫辛酸干预同第一部分1.2.2脑组织蛋白提取及BCA法蛋白定量硫辛酸干预结束后，随机取假手术组、PD模型组和硫辛酸干预低、中、高剂量组各4只，其余步骤同第一部分。1.2.3WesternBlot法检测GFAP、IBa1、TNF-α、IL-1β的表达PVDF膜转入用TBST稀释的RabbitAnti-GFAP抗体（1:400）孵育，4℃过夜。次日取出，室温孵育1h，TBST洗膜5min×3次后，加入TBST稀释的Anti-rabbitIgG/HRP（1:1000），低速摇床上孵育2h，TBST洗膜5min×3次。RabbitAnti-Iba1抗体（1:300），RabbitAnti-TNF-α抗体（1:200），RabbitAnti-IL-1β抗体（1:300）的孵育同上步骤。MouseAnti-GAPDH抗体（内参抗体，1:0000）次日加二抗为Anti-MouseIgG/HRP（1:1000），其余同上步骤。1.2.4免疫组化检测GFAP、IBa1硫辛酸干预结束后，随机取假手术组、PD模型组和硫辛酸干预低、中、高剂量组各4只，大鼠脑组织灌注、固定、脱水、石蜡包埋、脑组织切片、贴片、脱蜡至水、灭活内源性酶、热抗原修复、BSA封闭步骤同第一部分。然后滴加用PBS缓冲液（1:200）稀释的兔多克隆（GFAP）抗体，37℃孵育2h（也可4℃过夜），PBS缓冲液（pH7.4）洗2min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育1h，PBS缓冲液（pH7.4）洗2min×3次。滴加试剂SABC，37℃孵育30min，PBS缓冲液（pH7.4）洗5min×4次。DAB显色后切片依次经脱水、透明、封片处理。上述20只大鼠每只分别随机选取中脑黑质5张切片，每张切片随机选取4个高倍视野（HP，400×），在同一视野面积，同一放大倍数，同一背景光强度下采集图像。采用Image-ProPlus6.0图像分析系统软件统计各组大鼠右侧黑质GFAP、IBa1阳性细胞数量及分析比较形态学变化。1.2.5统计学处理同第一部分。2结果2.1帕金森病模型大鼠的行为学变化42只定位注射6-OHDA的SD大鼠4周后有1只死亡，41只腹腔注射APO后，35只大鼠左侧旋转圈数＞7r/min；假手术组大鼠无死亡，注射APO均未出36 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文现旋转行为，LA干预过程中大鼠无死亡。2.2各组大鼠右侧黑质GFAP、IBa1免疫组化结果如图所示（图2-2-1，Fig.2-2-1），假手术组可见GFAP表达阳性淡染的星形胶质细胞，无反应性增生肥大，胞体较小，分支少而细长；PD模型组GFAP阳性细胞表达着色深，胞体肿胀，突起增多并延长，胞核较大；LA干预低剂量组胞体肿胀程度及阳性细胞着色程度与PD模型组无明显差异，LA干预中、高剂量组较PD模型组GFAP阳性细胞表达着色稍弱，胞体肿胀减轻，胞核较大。与假手术组比较，PD模型组及LA干预低中高剂量组GFAP阳性细胞数量明显增多（P＜0.05）；与PD模型组比较，LA干预低剂量组GFAP阳性细胞数量无明显差异（P＞0.05），LA干预中、高剂量组GFAP阳性细胞数量明显减少（P＜0.05）；与LA干预低剂量组比较，LA干预中、高剂量组GFAP阳性细胞数量明显减少（P＜0.05）；LA干预中、高剂量组见比较GFAP阳性细胞数量无统计学差异（P＞0.05），见(表2-2-1，Tab.2-2-1)。图2-2-1显微镜下示各组大鼠右侧黑质GFAP免疫组化染色（A:假手术组；B:PD模型组；C:LA低剂量组；D:LA中剂量组；E:LA高剂量组）(400×)Fig.2-2-1MicrophotographsshowingGFAPimmunohistochemistrystainingpositivecellsintherightsidesubstantianigraofratsinshamgroup(A),PDmodelgroup(B),lipoicacidinlow(C),medium(D)andhigh(E)dosegroups,respectively.(400×)37 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文表2-2-1各组大鼠右侧黑质区域GFAP免疫组化染色阳性细胞数目的比较（⎯χ±s，个/HP，n=4）Tab.2-2-1ThenumberofGFAPimmunohistochemistrystainingpositivecellsintherightsidesubstantianigraofratsineachgroup组别GFAP免疫组化染色阳性细胞数假手术组5.58±0.09219.42±1.131aPD模型组17.67±0.948aLA低剂量组11.50±0.723abLA中剂量组9.50±0.783abLA高剂量组注：aP＜0.05与假手术组相比；bP＜0.05与PD模型组比较。如图所示（图2-2-2，Fig.2-2-2），假手术组可见IBa1表达阳性淡染的小胶质细胞，无反应性增生肥大，胞体较小，胞核染色较浅，稀疏分布，数量较少；PD模型组IBa1阳性细胞表达着色深，胞体肿胀，出现突起，胞核较大；LA干预低剂量组胞体肿胀程度及阳性细胞着色程度与PD模型组无明显差异，胞核较大，但未见明显突起，LA干预中、高剂量组较PD模型组IBa1阳性细胞表达着色明显变弱，胞体肿胀减轻。与假手术组比较，PD模型组及LA干预低中高剂量组IBa1阳性细胞数量明显增多（P＜0.05）；与PD模型组比较，LA干预低、中、高剂量组IBa1阳性细胞数量明显减少（P＜0.05）；与LA干预低剂量组比较，LA干预中、高剂量组IBa1阳性细胞数量明显减少（P＜0.05）；与LA干预中剂量组比较，LA干预高剂量组IBa1阳性细胞数量明显减少，差异具有统计学差异（P＜0.05），见(表2-2-2，Tab.2-2-2)。图2-2-2显微镜下示各组大鼠右侧黑质IBa1免疫组化染色（A:假手术组；B:PD模型组；C:LA低剂量组；D:LA中剂量组；E:LA高剂量组）(400×)Fig.2-2-2MicrophotographsshowingIBa1immunohistochemistrystainingpositivecellsintherightsidesubstantianigraofratsinshamgroup(A),PDmodelgroup(B),lipoicacidinlow(C),medium(D)andhigh(E)dosegroups,respectively.(400×)38 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文表2-2-2各组大鼠右侧黑质区域IBa1免疫组化染色阳性细胞数目的比较（⎯χ±s，个/HP，n=4）Tab.2-2-2ThenumberofIBa1immunohistochemistrystainingpositivecellsintherightsidesubstantianigraofratsineachgroup组别IBa1免疫组化染色阳性细胞数假手术组16.75±1.268107.17±2.738aPD模型组95.50±3.526abLA低剂量组69.08±2.560abcLA中剂量组57.17±2.206abcdLA高剂量组注：aP＜0.05与假手术组相比；bP＜0.05与PD模型组比较；cP＜0.05与LA低剂量组比较；dP＜0.05与LA中剂量组比较。2.3硫辛酸对各组大鼠黑质内GFAP、IBa1、TNF-α、IL-1β表达水平的影响2.3.1各组大鼠黑质内Iba1和GFAP表达的比较如图所示（图2-2-3，Fig.2-2-3），与假手术组比较，PD模型组、LA低、中、高剂量组IBa1和GFAP表达均明显增高（P＜0.05）；与PD模型组比较，LA低、中、高剂量组IBa1和GFAP表达均明显减少（P＜0.05）；与LA低剂量组比较，LA中、高剂量组IBa1和GFAP表达均明显减少（P＜0.05）；但LA中、高剂量组之间IBa1和GFAP的表达水平均无统计学差异（P＞0.05）。注：各组的上标a、b、c、d分别代表各组间比较的结果。即相同字母所在的组别之间比较无统计学差异（P＞0.05），不同字母所在的组别之间比较有统计学差异（P＜0.05）。图2-2-3各组大鼠右侧中脑黑质GFAP(A)、IBa1(B)的相对蛋白表达量的比较Fig.2-2-3TherelativeproteinexpressionofGFAP(A),IBa1(B)ontherightsideofsubstantianigraineachgrouprats39 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文2.3.2各组大鼠黑质内TNF-α和IL-1β表达的比较如图所示（图2-2-4，Fig.2-2-4），与假手术组比较，PD模型组、LA低、中、高剂量组TNF-α和IL-1β表达均明显增高（P＜0.05）；与PD模型组比较，LA低、中、高剂量组IL-1β表达均明显减少（P＜0.05），LA低剂量组TNF-α表达水平无统计学差异（P＞0.05），LA中、高剂量组TNF-α表达均明显减少（P＜0.05）；与LA低剂量组比较，LA中、高剂量组TNF-α表达均明显减少（P＜0.05）；与LA中剂量组比较，LA高剂量组TNF-α表达明显减少（P＜0.05）；LA低、中、高剂量组之间IL-1β的表达水平均无统计学差异（P＞0.05）。注：各组的上标a、b、c、d分别代表各组间比较的结果。即相同字母所在的组别之间比较无统计学差异（P＞0.05），不同字母所在的组别之间比较有统计学差异（P＜0.05）。图2-2-4各组大鼠右侧中脑黑质TNF-α(C),IL-1β(D)的相对蛋白表达量的比较Fig.2-2-4TherelativeproteinexpressionofTNF-α(C),IL-1β(D)ontherightsideofsubstantianigraineachgrouprats3讨论帕金森病的病理生理机制复杂，由氧化应激、炎症反应等多个方面共同介导所致。随着越来越多的研究证实神经免疫和炎症反应也参与了帕金森病的发病，对帕金森病的研究越来越倾向神经胶质细胞及炎性因子的探索。神经胶质细胞主要包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞。由于少突胶质数量极少且难以检测，故目前的研究重心主要集中在对前两者的探索。McGeer等[11]研究证实PD患者黑质部位存在大量主要组织相容性复合物阳性的小胶质细胞，其数目是正常人的6倍，主要分布于死亡的多巴胺能神经元周围。Long-SmithCM等[12]40 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文对帕金森病患者的尸检可观察到黑质部位存在异常激活的小胶质细胞；OuchiY等[13]应用PET/CT对帕金森病患者进行检查，发现小胶质细胞激活与多巴胺能神经元变性死亡具有相关性，Gerhard等[14]运用相同的技术也验证了这一发现。在PD患者和PD动物模型中研究发现，黑质致密部除了大量的DA能神经元缺失外，还存在轻至中度星形胶质细胞的激活[15]。TeismannP等[16]研究发现星形胶质细胞在PD的发病的过程中具有推波助澜的作用。StoneDK等[17]发现帕金森病患者的脑组织和脑脊液中检测到TNF-α、IL-1β、IL-6的水平升高。小胶质细胞是中枢神经系统内的固有免疫效应细胞，是神经元生存外环境重要组成部分，约占神经胶质细胞总数的10%~20%，以中脑黑质分布最为密集。生理状态下，小胶质细胞为静息状态；小胶质细胞对外界环境刺激非常敏感，在细胞外刺激因素如内毒素、细胞因子、趋化因子、错误折叠蛋白等的作用下，小胶质细胞可发生激活，适度激活的小胶质细胞作为通过吞噬神经元和细胞残骸维持细胞数目稳定，从而保证中枢神经系统正常的结构与功能[18]，并可在吞噬病原体和受损细胞，释放生长因子营养支持邻近的神经元和神经胶质细胞[19]；小胶质细胞的适度激活对中枢神经系统具有支持保护作用，而在某些情况下小胶质细胞的异常激活则对神经元产生毒性作用，从而引起损伤。SaijoK[20]等研究发现小胶质细胞为炎症反应的始动细胞；被异常激活的小胶质细胞可通过分泌大量细胞炎性因子如TNF-α、IL-1β等，以及活化诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）和NADPH氧化酶（NOX）等介导对神经元的损伤作用[21]。而这些细胞因子又可激活小胶质细胞，加速其释放大量炎症因子致使神经元变性。星形胶质细胞约占大脑皮质总细胞数的50%，是哺乳动物脑中含量最丰富的胶质细胞，由于其与神经元紧密相邻，又被称作神经元的支持细胞，对维持脑内稳态与神经元的正常功能至关重要[22]。不仅为神经元提供结构及营养支持，并且参与突触形成、神经元的发育、神经元的物质代谢调节和神经信息调控[23]。在病理情况下，星形胶质细胞被异常激活后增殖加速，合成并分泌多种免疫和炎症介质，并参与抗原提呈。星形胶质细胞多在小胶质细胞激活后继发活化[24]，然而星形胶质细胞可以放大由小胶质细胞介导的炎症反应[20]。星形胶质细胞被激活后可产生TNF-α、IL-1β、IL-6、NO、PGE-2等致炎因子[25]。这些致炎因子41 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文能够以不同途径启动细胞内某些信号转导通路，最终导致DA能神经元的损伤。炎性因子在PD发病中的作用已得到广泛认可，TNF-α、IL-1β是最具代表性的炎性细胞因子，它们共同参与机体免疫反应和炎症的调节[26-28]。TNF-α是重要的对DA能神经元具有潜在毒性作用的细胞因子。TNF-α能诱导胶质细胞释放一氧化氮、谷氨酸等神经毒性物质，促进炎症因子合成，扩大炎症反应，并影响细胞内钙离子平衡，加重细胞损伤[29]。另外，TNF-α与TNF-1R结合可通过半胱氨酸天冬氨酸酶(caspases)途径导致细胞凋亡[30]。IL-1β可促进自由基的产生，增强氧化应激，最终增加iNOS的表达，使一氧化氮(NO)和自由基产量增加；增加细胞内钙离子浓度，促进钙超载；增加α-突触核蛋白的合成，促进路易小体的形成；增加兴奋性氨基酸的毒性；促进其他炎性因子合成，扩大炎性反应；使线粒体膜电位异常，通过形成过氧化亚硝酸盐耗尽能量，最终使线粒体功能受损[31-35]。IBa1在脑内小胶质细胞中特异性表达，可作为小胶质细胞的特异性标记物[36]；GFAP是星形胶质细胞中间纤维结构蛋白的组成部分，可作为星形胶质细胞的特异性标记物[37]。本实验给予右侧纹状体定向注射6-OHDA后，通过轴突的逆行转运至黑质内的神经元胞体,可选择性地破坏DA能神经元，并通过实验证实注射神经毒性药物6-OHDA后PD模型组大鼠黑质内小胶质细胞和星形胶质细胞被异常激活，胞体肿胀，着色加深，胞核增大，且两种细胞数量较假手术组明显增多，IBa1和GFAP表达较假手术组明显增高。通过行蛋白质免疫印迹法检测发现TNF-α及IL-1β的表达较假手术组明显上调。上述结果均表明6-OHDA导致了PD模型大鼠黑质内神经炎症的发生，也间接证实了小胶质细胞和星形胶质细胞介导损害了多巴胺能神经元产生的炎性反应。给予硫辛酸干预后，免疫组化染色发现小胶质细胞和星形胶质细胞胞体肿胀减轻，着色变浅，细胞数量减少，且主要炎性因子TNF-α及IL-1β的表达明显减少。本实验结果表明，LA通过抑制PD模型大鼠中脑黑质内小胶质细胞及星形胶质细胞的过度活化及表达，从而减少炎性因子TNF-α、IL-1β的释放，降低脑内神经炎症的进展程度。但LA降低脑内炎症的发展进程可能存在其它的机制，我们推测LA还可能通过抑制iNOS通路阻断细胞内外活性氧及自由基的产生，降低氧化应激水平，从而减少细胞毒性因子的释放，我们将在下一步的实验研究中证实这一假设。42 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文4结论4.1PD模型大鼠中脑黑质小胶质细胞及星形胶质细胞明显增多，Iba1和GFAP表达明显增高。4.2PD模型大鼠中脑黑质TNF-α和IL-1β表达明显增多。4.3LA可以抑制PD模型大鼠中脑黑质内小胶质细胞及星形胶质细胞的过度活化及表达，从而减少炎性因子TNF-α、IL-1β的释放，降低脑内神经炎症的程度。43 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文参考文献[1]袁红，郑静晨，刘平，等.帕金森病的发病机理:氧化应激,环境影响因素与神经炎症(英文)[J].NeuroscienceBulletin.2007(02):125-130.[2]张瑞萍，陈彪.神经炎症、小胶质细胞与帕金森病[J].神经损伤与功能重建.2007(06):321-325.[3]PfeifferRF.NeuroinflammationandParkinsondisease:thesilentbattleground[J].Neurology.2009,73(18):1434-1435.[4]KumarH,KoppulaS,KimIS,etal.Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2signalinginParkinsondisease:apromisingmultitherapeutictargetagainstoxidativestress,neuroinflammationandcelldeath[J].CNSNeurolDisordDrugTargets.2012,11(8):1015-1029.[5]GaoHM,JiangJ,WilsonB,etal.Microglialactivation-mediateddelayedandprogressivedegenerationofratnigraldopaminergicneurons:relevancetoParkinson'sdisease[J].JNeurochem.2002,81(6):1285-1297.[6]WhittonPS.InflammationasacausativefactorintheaetiologyofParkinson'sdisease[J].BrJPharmacol.2007,150(8):963-976.[7]AmorS,PuentesF,BakerD,etal.Inflammationinneurodegenerativediseases[J].Immunology.2010,129(2):154-169.[8]SaijoK,CrottiA,GlassCK.Nuclearreceptors,inflammation,andneurodegenerativediseases[J].AdvImmunol.2010,106:21-59.[9]LeeHJ,SukJE,PatrickC,etal.Directtransferofalpha-synucleinfromneurontoastrogliacausesinflammatoryresponsesinsynucleinopathies[J].JBiolChem.2010,285(12):9262-9272.[10]ShuklaV,MishraSK,PantHC.Oxidativestressinneurodegeneration[J].AdvPharmacolSci.2011,2011:572634.[11]McgeerPL,ItagakiS,BoyesBE,etal.ReactivemicrogliaarepositiveforHLA-DRinthesubstantianigraofParkinson'sandAlzheimer'sdiseasebrains[J].Neurology.1988,38(8):1285-1291.[12]Long-SmithCM,SullivanAM,NolanYM.TheinfluenceofmicrogliaonthepathogenesisofParkinson'sdisease[J].ProgNeurobiol.2009,89(3):277-287.[13]OuchiY,YagiS,YokokuraM,etal.NeuroinflammationinthelivingbrainofParkinson's44 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贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文文)[J].WorldJournalofAcupuncture-Moxibustion.2011(03):46-49.[27]成晓华，刘斌，马原源，等.咪多吡对帕金森病模型大鼠黑质炎性因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ表达的影响[J].免疫学杂志.2014(08):671-676.[28]李淑娟，胡国华，过红明，等.白介素-1β和小胶质细胞在帕金森病中的作用[J].中国老年学杂志.2009(10):1189-1191.[29]TanseyMG,MccoyMK,Frank-CannonTC.NeuroinflammatorymechanismsinParkinson'sdisease:potentialenvironmentaltriggers,pathways,andtargetsforearlytherapeuticintervention[J].ExpNeurol.2007,208(1):1-25.[30]杨丽.黑质小胶质细胞激活诱导帕金森病的机制[J].中国老年学杂志.2012(17):3853-3855.[31]YasuharaR,MiyamotoY,AkaikeT,etal.Interleukin-1betainducesdeathinchondrocyte-likeATDC5cellsthroughmitochondrialdysfunctionandenergydepletioninareactivenitrogenandoxygenspecies-dependentmanner[J].BiochemJ.2005,389(Pt2):315-323.[32]WangX,ChenS,MaG,etal.Involvementofproinflammatoryfactors,apoptosis,caspase-3activationandCa2+disturbanceinmicrogliaactivation-mediateddopaminergiccelldegeneration[J].MechAgeingDev.2005,126(12):1241-1254.[33]GriffinWS,LiuL,LiY,etal.Interleukin-1mediatesAlzheimerandLewybodypathologies[J].JNeuroinflammation.2006,3:5.[34]KoprichJB,Reske-NielsenC,MithalP,etal.NeuroinflammationmediatedbyIL-1betaincreasessusceptibilityofdopamineneuronstodegenerationinananimalmodelofParkinson'sdisease[J].JNeuroinflammation.2008,5:8.[35]PottGM,TarelliR,FerrariCC,etal.CentralandsystemicIL-1exacerbatesneurodegenerationandmotorsymptomsinamodelofParkinson'sdisease[J].Brain.2008,131(Pt7):1880-1894.[36]ItoD,TanakaK,SuzukiS,etal.EnhancedexpressionofIba1,ionizedcalcium-bindingadaptermolecule1,aftertransientfocalcerebralischemiainratbrain[J].Stroke.2001,32(5):1208-1215.[37]MaurelD,SageD,MekaoucheM,etal.Glucocorticoidsup-regulatetheexpressionofglialfibrillaryacidicproteinintheratsuprachiasmaticnucleus[J].Glia.2000,29(3):212-221.46 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文综述：综述一铁代谢与帕金森病徐利综述焦玲审校帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)又称震颤麻痹，是常见的中枢神经系统退行性疾病。临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常等症状。病理学特征改变为中脑黑质致密带(substantianigraparscompacta，SNpc)多巴胺(dopamine，DA)能神经元进行性缺失，纹状体区DA含量相应减少，残留神经元变性，神经黑色素减少，胞质内出现路易(Lewy)小体。其具体发病机制尚不明确，近年来越来越多的研究提示过量铁的沉积与帕金森病发生密切相关；铁代谢紊乱、铁诱导的氧化应激及自由基生成很可能是帕金森病极为重要的发病因素[1,2]。1铁的生理功能、脑内分布及存在形式铁是细胞色素蛋白中血红素的关键成分，细胞呼吸过程中介导线粒体内的电子传递，还参与了与儿茶酚胺代谢有关的酪氨酸羟化酶(tyrosineydroxylase,TH)和单胺氧化酶的构成,是脑内许多独特的酶系统的辅助因子[3]。正常脑组织内铁的分布具有组织差异性，其含量从高至低依次为苍白球、壳核、黑质、尾状核、大脑白质及小脑，脑铁含量最丰富的区域也是DA能神经元聚集的区域，即苍白球、壳核及黑质。铁的分布还具有细胞差异性，小胶质细胞和少突胶质细胞均含有大量的铁，其中以少突胶质细胞含铁量最高[4]。生理条件下，铁主要以非血红素铁的形式广泛存在于脑组织内，主要包括：（1）小分子复合物，铁与低分子量螯合剂如ATP、ADP或柠檬酸、氨基酸、神经黑色素等小分子物质结合，这些低分子量螯合剂通常也被称为“低分子量铁池”(lowmolecularweightironpool)；（2）金属蛋白，如Tf、乳铁蛋白(lactoferrin，Lf)；（3）贮存蛋白，如铁蛋白(ferritin)和含铁血红素；（4）游离铁离子。研究表明，铁元素的动态平衡对于脑的正常功能尤其是学习、记忆功能是非常重要的，一旦缺乏将导致学习和工作能力降低以及认知障碍等。47 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文2铁诱导细胞损伤的病理机制自由基的形成一直被认为是导致PD黑质多巴胺能神经元死亡的一个主要原因，铁通过芬顿（Fenton）反应：Fe2++H-3+2O2→OH·+OH+Fe，产生具有高度细胞毒性的羟自由基（OH·），它通过作用蛋白质、核酸和细胞膜导致细胞损伤，甚至死亡；结合的Fe3+还原后才能与H2O2反应而产生OH·是产生氧化反应应激损伤的关键，而黑质高浓度的抗坏血酸盐恰能将Fe3+还原为Fe2+，从而产生OH·。研究显示，PD患者黑质中，抗氧化保护机制缺失，缺乏了对铁的主动且有效的清除机制，体内会积聚过多的铁，催化自由基的生成，从而使电子传递受阻、胞内钙平衡紊乱、蛋白酶作用加强、膜脂质过氧化增强，最后导致细胞死亡以及多种中枢神经系统疾病[5]。此外，游离铁还可通过改变线粒体内Ca2+稳态而导致细胞受到损害，从而引发基础脂质过氧化水平增高。体外实验说明铁诱发的氧化损伤与铁能够打开二氢吡啶钙离子通道使细胞内Ca2+增多和线粒体内Ca2+释放有关[6]。3PD脑内铁异常沉积的研究回顾其实早在1924年，Lehermitt[1]第一个发现PD患者黑质(substantianigra，SN)中铁含量的明显高于正常人。1988年Sofic等[1]尸检发现帕金森病患者较正常人脑内黑质和苍白球有大量铁沉积，其中三价铁增高极其显著。Riederer等[8]则在1992年发现铁水平的增高与PD病程的进展相一致。Becker等[9]在1995年首次将头颅超声高信号作为PD的典型特征，后来证实这种高信号主要是由中脑黑质部铁沉积引起。Faucheux等[10]在2003年发现，PD患者黑色素颗粒的氧化还原能力明显高于正常。2007年Oakley等[11]等运用电子探针X线也证明了PD患者SN神经元内铁含量出现了异常沉积，SN神经元内铁的异常沉积是PD患者的特异性改变。Martin等[12]通过检测早期和晚期PD患者脑内铁含量的改变提出这种手段不仅有助于早期诊断PD，还可以提示PD的进展程度。2009年舒红格等[13]应用颅脑MR平扫及SWI检查对铁进行了定量研究发现PD的发病与局部铁含量的增加有关；壳核、黑质、苍白球、红核为PD铁异常沉积的部位，且在PD的亚临床期就有铁异常沉积，但铁含量的增加与病情的严重程度无关。Powers等[14]还发现，食用富含铁食物的人群患PD的危险性增加了1.7倍。近几年来化学病理学研究还发现在PD患者SN中有铁代谢的改变超负载铁离子的细胞毒性，以及过量铁诱导氧化应激反应促进自由基的生成可能是PD极为重要的病理机48 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文制。一系列实验结果均证明，铁直接参与PD的神经变性改变。4脑内铁转运相关蛋白在PD进程中的变化从已有的研究中发现，PD患者脑内铁代谢紊乱可能发生在铁代谢的各个阶段，包括对铁的摄取、释放、储存、细胞代谢以及调节[15-17]。其中铁代谢关键蛋白起到了重要的作用。转铁蛋白（transferrin,Tf）是脑内的主要铁重要的结合、转运及贮存蛋白，是体内重要的铁代谢调节蛋白，参与维持铁代谢平衡。主要存在于寡树突胶质细胞等非神经元细胞。血液中的铁不能直接透过血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB)进入脑组织。血浆铁主要以铁-转铁蛋白复合物Fe-Tf的形式存在，但是转铁蛋白只能与Fe3+结合,因此由细胞中释放的Fe2+需要氧化为Fe3+才能与血浆中的Tf结合。体内的大多数细胞以内吞的方式通过膜表面的转铁蛋白受体(transferrinReceptor,TfR)将血液中的Fe-Tf摄入细胞内。在内涵素包被的凹陷部位内吞进入细胞形成内吞小体。在质子泵的作用下，内吞小体中的pH值下降到5.5～6.5左右，铁与Tf的结合力减弱，因此从Fe-Tf-TfR复合物中释放出来并被还原为Fe2+。再由二价金属离子转运1(divalentmetaltransporter1,DMT1)介导Fe2+跨越内吞小体膜进入脑毛细血管内皮细胞胞质内，一部分铁以Ferritin的形式储存起来，另一部分铁经过膜铁转运蛋白1（ferroportin1,FP1）转移进入细胞外液。在pH=7.4的环境条件下，Tf-TfR复合物经由囊泡外排回到细胞表面，Tf被释放到循环系统中继续完成下一次使命。有的研究认为转铁蛋白依赖的铁的转运是机体中铁转运的主要途径，但决不是细胞获取铁的唯一途径。研究发现，在PD患者中，许多与铁代谢相关的蛋白表达异常，如TfR、DMT1、Ferritin、FP1、Lf、铜蓝蛋白（ceruloplasmin,CP）等[11,18,19]，这些蛋白的表达可能是PD黑质内铁增高的直接原因。转铁蛋白/铁(Tf/Fe)是铁转运能力的指标，PD病人的苍白球、壳核中此指标降低。Faucheux等[20]在1995年通过定量的碘标记的转铁蛋白放射自显影技术对正常人、PD病人、MPTP损毁猴进行实验，观察TfR的分布及数量变化。正常组碘标记的转铁蛋白结合部位在尾壳核最高，苍白球最低；PD病人尾壳核的密度增加；MPTP损毁猴尾壳核密度降低。这些结果提示纹状体中TfR参与铁摄取，且MPTP诱导的急性病变与PD病人的慢性过程不同。DMT1的功能主要是介导小肠上皮细胞的铁吸收以及参与铁从内吞小体移位到胞浆的过程。DMT1介导的铁转运是一个主动的和H+依赖的过程。DMT1也49 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文参与其他二价金属如Zn2+、Mn2+、Co2+、Cd2+、Cn2+、Ni2+和Pb2+的转运。Andrews[21]研究发现PD病人脑内黑质神经元DMT1有过高表达。宋杨文等[18]研究也发现，PD患者黑质DMT1表达持续增加，FP1表达持续降低，而黑质铁大量集聚发生在其后，而PD患者脑内铁异常沉积和DMT1表达恰在同一部位。这些事实证明铁转运蛋白DMT1表达增加和FP1表达降低参与了黑质铁积聚的发生与发展。Ferritin是脑内最主要的储铁蛋白，其主要功能是回收铁以用于血红素合成以及螯合游离铁保护细胞不受氧化损伤。铁蛋白是由蛋白质外壳和壳内无机复合体的铁核构成。蛋白质外壳是由H亚基和L亚基组成。不同铁蛋白L亚基和H亚基含量不同。铁聚集在铁核内,其铁含量为0～4500个Fe3+不等,以多聚体形式存在。铁以Fe2+的形式被摄取,随之在铁蛋白外壳被氧化为Fe3+并转入铁核。当细胞内的铁含量高于细胞代谢所需要的水平时就会诱发铁蛋白的合成，这样铁就以一种可利用的无毒形式储存下来；如果ferritin的合成正常进行，PD患者SN中增加的铁就没有毒性作用；但若Fe-ferritin复合物结构被破坏，则可以引起脑铁聚集，从而导致氧化反应增加和线粒体功能异常，这可能是导致PD铁沉积的重要原因之一[22]。FP1是一种跨膜的铁输出蛋白，广泛分布于机体各组织中，它参与脑内铁的输出，这对于保护脑细胞不受铁诱导的氧化应激损伤起到了重要作用[23]。临床及动物实验均显示，脑内参与神经细胞铁摄入和释放有关的铁转运相关蛋白的异常，可能导致黑质致密部铁含量显著增高，脑铁沉积进而诱发神经元死亡，最终导致PD的发生[24]。在人体，Lf主要贮存于中性粒细胞的次级溶酶体和胞质内，与铁的结合、转运、贮存有关，研究证实在脑内其过度表达与PD病人脑区高铁形成有关。CP是存在于人类及脊椎动物的唯一的多铜氧化酶，是一种丰富的血清α2-糖蛋白，分子量大约132kDa。这种蛋白由含1046个氨基酸的单一多肽链组成，属于多核铜蓝氧化酶家族。CP在脑部表达的下降或缺失可能是低铜蓝蛋白血症及许多神经元变性疾病脑部铁过度增高的原因。正常情况下，Fe2+穿过BBB，经CP的氧化作用变成Fe3+，而后Fe3+与Tf结合被脑细胞摄取。但在病理情况下，CP氧化酶活性减低，使Fe2+氧化成Fe3+困难。因此Fe3+和Fe-Tf减少，同时非转铁蛋白结合铁如枸橼酸亚铁和游离Fe2+将增加，因此脑细胞摄取非转铁蛋白结合铁增加，在细胞内因缺乏CP，Fe2+难以被氧化成Fe3+[25]。另外，尽管细胞内Fe2+增加，但由于细胞外Fe2+增高造成铁浓度差减少，故Fe2+不能释50 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文放。这些因素致铁积累引发氧化应激反应，导致神经元死亡。可见铁代谢紊乱与铁转运蛋白的表达水平密切关联，脑内铁的增加触发了一系列有害的级联事件，最终导致了神经系统的退行变性。5关于铁螯合剂的研究现状及展望综上所述，在PD发病中铁代谢发生了显著的变化，黑质致密区内铁异常沉积，过量铁作为一种神经毒素诱发了氧化应激，使自由基生成，继而引起膜脂质过氧化等一系列氧化损伤，最终导致了黑质DA能神经元的选择性缺失。因此铁鳌合剂在治疗神经退行性疾病的方面越来越受到重视。铁螯合剂与铁离子的紧密结合可以阻止其催化氧化应激反应的能力，干扰Fenton反应，直接阻断自由基的生成，从而阻断脂质过氧化，它还可以通过干预铁与黑色素的结合从而抑制Fe2+通过再循环而激发OH·生成的过程。姜宏等[6]实验证实了提前给大鼠脑室注射铁螯合剂去铁胺(DFO)可以阻断6-OHDA对DA能神经元的损伤，但DFO不能通过血脑屏障，与可增强BBB通透性的精神抑制药合用时则有明显眼和脑的毒性。EUK-189、迷迭香酸等均能有效地减少DA能神经元的死亡，增加脑内DA含量，延缓PD进展，但均有大量明显的毒副作用[26-28]。宋杨文等[18]实验证实了黄芩苷对PD大鼠多巴胺能神经细胞具有保护作用与抑制铁积聚，调节铁转运蛋白DMT1、FP1表达，但中成药一般中短期效果不明显。刘黎星等[29]实验证实，染料木素（genistein）具有类雌激素样作用，通过降低SN铁含量及增加Bcl-2凋亡抑制蛋白的表达，发挥其对6-OHDA所致PD模型大鼠、SN多巴胺神经元的保护作用，但可能引起类固醇综合征。YoudimMB等研究证实[30]VK-28是很强的铁螯合剂且能透过血脑屏障，在6-OHDA毁损的大鼠模型上显示出神经保护作用，但具备肝肾毒性、视神经毒性、生殖毒性、脊髓神经毒性等严重副作用。于嵩等[31]研究发现姜黄素对铁负载的小鼠具有神经保护作用。上述铁离子螯合剂的研究多在PD动物模型中进行，尚未发现其对人体具有清除脑铁及神经保护作用，且大多都存在严重的毒副作用。综上所述，急需研究并开发可溶性、能通过血脑屏障、安全、无毒的铁离子螯合剂，为PD治疗提供新的手段。51 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文参考文献[1]RouaultTA.Irononthebrain[J].NatGenet.2001,28(4):299-300.[2]RhodesSL,RitzB.GeneticsofironregulationandthepossibleroleofironinParkinson'sdisease[J].NeurobiolDis.2008,32(2):183-195.[3]王俊，姜宏，谢俊霞.中枢神经系统铁代谢与帕金森病的关系[J].生理科学进展.2003(01):67-70.[4]刘卓，孙莉，张巍.铁与帕金森病[J].中华临床医师杂志(电子版).2012(17):5212-5215.[5]郭春彦，陈忻.铁与帕金森病关系研究进展[J].中国实验动物学报.2011(04):363-368.[6]姜宏，谢俊霞.脑内高铁在帕金森病病因中的作用[J].中国神经科学杂志.2001(02):201-204.[7]SoficE,RiedererP,HeinsenH,etal.Increasediron(III)andtotalironcontentinpostmortemsubstantianigraofparkinsonianbrain[J].JNeuralTransm.1988,74(3):199-205.[8]RiedererP,DirrA,GoetzM,etal.DistributionofironindifferentbrainregionsandsubcellularcompartmentsinParkinson'sdisease[J].AnnNeurol.1992,32Suppl:S101-S104.[9]BeckerG,SeufertJ,BogdahnU,etal.DegenerationofsubstantianigrainchronicParkinson'sdiseasevisualizedbytranscranialcolor-codedreal-timesonography[J].Neurology.1995,45(1):182-184.[10]FaucheuxBA,MartinME,BeaumontC,etal.Neuromelaninassociatedredox-activeironisincreasedinthesubstantianigraofpatientswithParkinson'sdisease[J].JNeurochem.2003,86(5):1142-1148.[11]OakleyAE,CollingwoodJF,DobsonJ,etal.IndividualdopaminergicneuronsshowraisedironlevelsinParkinsondisease[J].Neurology.2007,68(21):1820-1825.[12]MartinWR,WielerM,GeeM.MidbrainironcontentinearlyParkinsondisease:apotentialbiomarkerofdiseasestatus[J].Neurology.2008,70(16Pt2):1411-1417.[13]舒红格，漆剑频，朱文珍，等.帕金森病脑铁沉积的定量研究[J].华中科技大学学报(医学版).2009(04):527-530.[14]PowersKM,Smith-WellerT,FranklinGM,etal.Dietaryfats,cholesterolandironasriskfactorsforParkinson'sdisease[J].ParkinsonismRelatDisord.2009,15(1):47-52.[15]KeY,MingQZ.Ironmisregulationinthebrain:aprimarycauseofneurodegenerative52 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贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文综述二小胶质细胞和星形胶质细胞在帕金森病发病中的作用机制徐利综述焦玲审校帕金森病（PD）是中老年常见的神经系统变性疾病，以中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性变性缺失、纹状体多巴胺能水平下降为主要病变特征。临床主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态障碍等运动症状，部分患者可伴有嗅觉减退、自主神经功能失调、睡眠障碍、认知损害等非运动性症状，生活质量严重受损，最终导致失去生活自理能力。迄今为止，其病因及发病机制尚未明确，也无令人满意的有效治疗方法。目前普遍认为其是多种因素共同导致，这其中包括家族遗传、环境毒物、氧化应激和能量代谢异常等。近年来，越来越多的研究证实神经炎症反应也参与了帕金森病的发病。其中小胶质细胞和星形胶质细胞所介导的神经炎症愈发受到重视。1小胶质细胞小胶质细胞(microglia)是神经胶质细胞的一种，约占大脑中的神经胶质细胞的10%-20%。一般认为，小胶质细胞起源于血循环中的单核细胞。单核细胞进入发育中的中枢神经系统后转变阿米巴样小胶质细胞，后者具有吞噬能力，能吞噬中枢神经系统内一些自然退变的残余物，同时进行繁殖，再至中枢神经系统发育完全后变成静止小胶质细胞。小胶质细胞是脑内唯一能进行有丝分裂的成熟细胞，其寿命比较短暂，随着年龄的增长不断的进行自我更新并逐渐趋向老化。正常情况下，静息的小胶质细胞在脑内行使正常的生理功能，具有免疫监视和维护脑内内环境稳态平衡和保护神经元的作用[1]。小胶质细胞的适度激活对中枢神经系统具有支持保护作用，而在某些情况下小胶质细胞的持续激活或过度激活则对神经元产生毒性作用，从而引起损伤。Saijo等[2]研究发现小胶质细胞是炎症反应的始动细胞。小胶质细胞对中枢神经系统稳态环境非常敏感，一旦中枢神经系统稳态环境发生改变，小胶质细胞就会被迅速激活，并且分泌和释放大量的炎症因子如：TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6、一氧化氮（NO）、活性氧（ROS）、前列腺素E2（PGE2）等[3]。在炎症介质的损害机制方面，TNF-α的过度表达既可以55 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文通过诱发自主免疫反应直接损害中枢神经系统；又间接诱导了一氧化氮合(iROS)和环氧化酶-2（COX-2）的合成，后者可以增加NO及PGE2的产生，进一步增强炎症反应[4]。TNF-α和IL-1β还可以造成血-脑屏障的损害，诱导粘附分子及其他炎症因子的合成，加重脑组织的炎症反应[5]。另外，TNF-α和IL-1β还可以相互诱导合成，放大毒性作用，导致神经元的凋亡[6-7]。上述细胞因子，尤其是IFN-γ能诱导小胶质细胞内的FcεR11抗原CD23的表达而引起iROS及COX-2的水平增高。然而，由激活的小胶质细胞释放的自由基基团是造成多巴胺能神经元损害的主要原因：iROS可与DNA、RNA、脂质等结合并导致后者的功能丧失，进而导致细胞凋亡。另外，ROS及iROS均可与NO反应生成的强效的过氧化亚硝酸盐，直接损伤多巴胺能神经元。它们的毒性作用可能通过激活细胞凋亡途径的关键激酶半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶caspase家族蛋白导致的，从而引起DA能神经元的大量凋亡[8]。同时大量的炎症因子还可激活神经酰胺途径发挥神经毒性作用，神经酰胺途径不仅可以放大caspase途径的激活所产生的神经毒性作用，还可激活NF-κB发生核转位，NF-κB通路的激活可以诱导多种炎症相关基因的表达[9]。这些物质对于神经元具有细胞毒性作用，进一步扩大炎症反应，加重疾病进展。MeGeer等[10]的研究表明应用免疫组化法证明小胶质细胞标记HLA-DR的存在可以间接判定反应性小胶质细胞的存在，其研究结果证实PD患者大脑中的黑质(SN)存在大量反应性HLA-DR阳性小胶质细胞。此外，体外细胞培养证实[11]，激活的小胶质细胞通过产生氧自由基、活性氧、氮化物及细胞因子等引起脑内炎症反应，继而导致神经元死亡。而其产生大量的超氧化物是氧化应激反应的主要原因，氧化应激反应被认为是DA神经元死亡的主要原因。大量的反应性小胶质细胞不仅在原发性PD患者的SN和纹状体内发现，也在家族性PD患者中发现。McGeer等[12]对帕金森病患者的尸检结果发现，黑质致密部激活的小胶质细胞聚集在Lewy小体周围。Gerhard等[13]对帕金森病患者进行的PET研究也有相同发现。α⁃突触共核蛋白（α⁃Syn）是Lewy小体的主要成分，许多帕金森病实验模型也证实其作为病理蛋白可以刺激小胶质细胞发生异常激活.2星形胶质细胞星形胶质细胞是哺乳动物脑中含量最丰富的胶质细胞，由于其与神经元紧密相邻，又被称作神经元的支持细胞，对维持脑内稳态与神经元的正常功能至关重56 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文要。它在中枢神经系统中始终伴随着神经元发育的整个过程，除了支持和隔离作用外，星形胶质细胞还能调节细胞内外离子浓度，传递第二信使，摄取、供给和灭活神经递质，营养修复神经元，也能抵抗氧化应激所致的细胞死亡[14]。星形胶质细胞还可分泌合成多重生长因子，具有较强的抗氧化作用[15]。而当炎性刺激、氧化应激或脑部损伤进一步加重，星形胶质细胞也可被异常激活。此时的星形胶质细胞可产生NO，并与超氧阴离子结合形成氧自由基，造成细胞损伤。可能机制为NO能破坏线粒体膜功能，影响呼吸链复合体I,造成细胞内钙离子蓄积，引起NOS作用增强，又进一步引起NO的产生增多。多巴胺能神经元中多巴胺的代谢产生较多自由基，同时多巴胺的自身氧化产生大量铁离子，该离子能与DA代谢中产生的过氧化氢发生氧化反应，产生羟自由基，进而导致黑质部位神经元损伤[16]。星形胶质细胞多在小胶质细胞激活后继发活化[17]。星形胶质细胞被异常激活后可产生TNF-α、IL-6、NO、PGE-2、IL-1β等致炎因子。这些致炎因子能够以不同途径启动细胞内某些信号转导通路，最终导致DA能神经元的损伤。此外，α-突触核蛋白也可以激活星形胶质细胞，令其异常活化，进一步加重DA神经元死亡进程[18]。在研究中发现[19]，PD病人脑内含α-syn阳性星形胶质细胞的出现与黑质DA能神经元的死亡有关，其数量与PD病人黑质部位神经元缺失的严重程度相关。Muramatsu等[20]观察了MPTP小鼠纹状体、黑质神经元和胶质细胞中S100β的表达,发现S100β阳性染色仅存在于星形胶质细胞，说明星形胶质细胞的激活在MPTP诱导的DA能神经元损伤中可能具有一定作用，也为PD的发病学提供了有价值的信息。3总结与展望小胶质细胞与星形胶质细胞在PD中发挥着重要作用，依其不同活性状态PD中起神经保护或损伤作用，但其确切的作用机制还不是很清楚。比如两种胶质细胞所分泌的众多因子在PD中以哪一种作用为主，这种作用是原发的还是继发以及其分子机制等问题的明确还有待于进一步研究。但是肯定的是，两种胶质细胞既对DA能神经元有保护作用，也对其具有毒性作用。在PD的早期，可能其保护作用占主导；随着病情的发展，其毒性作用逐渐明显。一些新的实验动物模型以及新的实验方法为PD的改善及治疗提供了崭新的思路，以小胶质细胞和星形胶质细胞为靶点来治疗PD的策略值得进一步探索。目前PD的治疗主要是对症57 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文治疗，仅能起到缓解症状的作用，不能逆转病情，因此加强对PD神经免疫炎症机制的研究，从中发掘PD治疗上的突破点具有重要的意义。58 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文参考文献[1]KreutzbergGW.Microglia:asensorforpathologicaleventsintheCNS.TrendsNeurosci,1996,19:312⁃318.[2]SaijoK,WinnerB,CarsonCT,etal.ANurr1/CoRESTPathwayinMicrogliaandAstrocytesProtectsDopaminergicNeuronsfromInflammation-InducedDeath[J].Cell,2009,137:47-59.[3]ShuklaV，MishraSK，PantHC．Oxidativestressinneurodegeneration[J]AdvPharmaeolSci，2011：572634．[4]RamanCS，LiHui-ying，PavelMartasek，etal.Crystalstructureofconstitutiveendothelialnitricoxidesynthase：Aparadigmforpteridinefunctioninvolvinganovelmetalcenter[J].Cell，1998，95（7）：939-950.[5]StreitWJ，CondeJR，FendrickSE，etal.Roleofmicrogliainthecentralnervoussystem’simmuneresponse[J].NeurolRes，2005，27（7）：685-691.[6]RealeM，IarloriC，ThomasA，etal.PeripheralcytokinesprofileinParkinson’sdisease[J].BrainBehavImmun，2009，23（1）：55-63.[7]MichelleLBlock，LuigiZecca，Jau-ShyongHong.Microglia-mediatedneurotoxicity：uncoveringthemolecularmechanisms[J].NatRevNeurosci，2007，8（1）：57-69.[8]ChristophRichter，VladimirGogvadze，RenatoLaffranchi，etal.Oxidantsinmitochondria：fromphysiologytodisease[J].BiochimBiophysActa，1995，1271（1）：67-74.[9]BrassescoMS，RobertoGM，MoralesAG，etal.InhibitionofNF-κBbydehydroxymethylepoxyquinomicinsuppressesinvasionandsynergisticallypotentiatestemozolomideandγ-radiationcytotoxicityinglioblastomacells[J].ChemotherResPract，2013，1155：593020.[10]McGeerPL，McGeerEG.GlialreactionsinParkinson’sdisease[J]．MovDisord．2008．23：474-483．[11]EkdahlCT．KokaiaZ．Ljndvall0．Brainjnflammationandadultneurogenesis：thedualroleofmicrog1ia[J]．Neuroscience，2009，158：1021-1029.[12]McGeerPL,ItagakiS,BoyesBE,McGeerEG.ReactivemicrogliaarepositiveforHLA⁃DRinthesubstantianigraofParkinson'sandAlzheimer'sdiseasebrains.Neurology,1988,38:1285⁃1291.59 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文[13]GerhardA,PaveseN,HottonG,TurkheimerF,EsM,HammersA,EggertK,OertelW,BanatiRB,BrooksDJ.Invivoimagingofmicroglialactivationwith[11C](R)⁃PK11195PETinidiopathicParkinson'sdisease.NeurobiolDis,2006,21:404⁃412.[14]KimelbergHK．Functionsofmaturemammalianastrocytes：acurrentview．Neuroscientist，20l0，16：79-106.[15]Sidoryk-WegrzynowiczM，WegrznowiczM，LeeE,eta1．Roleofastrocytesinbrainfunctionanddisease[J]．ToxicolPathol，2011，39(1)：115-123．[16]AmorS，PuentesF，BakerD，eta1．Inflammationinneurodegenerativediseases[J]．Immunology，2010，129(2)：154-169.[17]LiuB,HangJS.Roleofmicrogliaininflammation-mediatedneurodegenerativedisease:mechanismsandstrategiesforther-apeuticintervention.JPharmacolExpTher,2003,304:1-7.[18]LeeHJ，SukJE，PatrickC，eta1．Directtransferofalpha-synucleinfromneurontoastrogliacausesinflammatoryresponsesinsynucleinopathies[J]．JBiolChem，2010，285(12)：9262-9272．[19]MaragakisNJ，RothsteinJD．MechanismsofDisease：astrocytesinneurodegenerativedisease[J].NatCIinPractNeurol，2006，2：679-689.[20]MuramatsuY,KurosakiR,WatanabeH,etal.ExpressionofS-100proteinisrelatedtoneuronaldamageinMPTP-treatedmice.Glia，2003，42:307-313.60 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文作者简历姓名：徐利性别：男出生年月：1986年10月民族：汉族籍贯：山东政治面貌：群众一、简要学历及工作经历2005年9月-2008年7月滨州医学院临床医学专业；2008年9月-2012年8月山东省泰安市交通医院内一科工作。2012年9月-2015年6月贵阳医学院攻读医学硕士学位（统招）。二、攻读学位期间获奖情况1.2014年11月，获2013-2014学年贵阳医学院优秀“三好学生”；2.2015年03月，获贵阳医学院优秀大学毕业生。四、攻读学位期间发表的学术论文（一）已发表论文1.徐利，张春林，周波，等.硫辛酸对帕金森模型大鼠黑质内神经胶质细胞及多巴胺能神经元的影响[J].神经解剖学杂志.2015(01):59-64.61 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文致谢时光飞逝，转眼硕士生活即将结束。暮然回首，对学习生活的眷恋和对老师及同学的感激之情油然而生。不会忘记导师焦玲教授严肃的科学态度、严谨的治学精神、精益求精的工作作风，从课题设计、论文撰写及修改等各个环节都给予悉心的指导。老师渊博的知识、活跃的学术思维和敏锐的洞察力给了我很多启迪，受益匪浅。不会忘记张春林教授高尚的品德、深厚的学术造诣、一丝不苟的工作态度以及伟大的人格魅力，是我学习的榜样，感谢您曾经给予的帮助。不会忘记周波老师和文敏老师，在具体实验过程中给予精心指导、无私帮助、技术与设备上的大力支持。由衷感谢药学院的李勇军教授和王爱民教授，多亏得到你们的大力帮助，我的实验才能顺利得以完成。非常感谢药学院的研究生朱迪等同学，不辞劳苦、无怨无悔的指导与帮助，使我在最短的时间掌握相关实验方法、获得相关实验结果。十分感谢勾云、翟素珍、陈运华、王吉平、陈瑶瑶、余大成等师弟师妹们的帮助，在整个实验过程中配合密切，共同经历了因实验不顺利带来的困惑，分享了实验成功带来的喜悦；攻克了一道道难关，最终到达了胜利的彼岸。在此，向师弟师妹表示由衷的感谢。感谢家人这些年来的大力支持和鼓励。特别感谢我的同窗兼好友蔡刚、李福海、殷和平等，三年来你们一直陪伴着我，在我最困难的时候助我渡过难关。非常感谢商正玲教授在我实验过程中提供的大力帮助和技术支持，使我的实验得以顺利完成。最后，祝愿所有帮助和关心我的老师、同学和亲友幸福安康。62 贵阳医学院2015届科学学位硕士研究生学位论文学位论文数据集关键词*密级*中图分类号*UDC论文资助帕金森病；α-硫辛酸；二价公开R741616.8金属离子转运蛋白1；细胞膜铁转运蛋白1；铁蛋白学位授予单位名称*学位授予单位代码*学位类别*学位级别*贵阳医学院10660科学学位医学硕士论文题名*论文语种*α-硫辛酸对帕金森病模型大鼠黑质铁沉积的干预机制研究中文并列题名*MechanismofalphalipoicacidinterveningonirondepositioninthesubstantianigraofParkinson'sdiseasemodelrat作者姓名*徐利学号*10660S120365培养单位名称*培养单位代码*培养单位地址邮编贵阳医学院10660学科专业*研究方向*学制*学位授予年*神经病学帕金森病32015年论文提交日期*2015年05月导师姓名*焦玲职称*教授评阅人答辩委员会主席*答辩委员会成员盲评徐平柏华、楚兰、刘芳、商正玲电子版论文提交格式文本（）图像（）视频（）音频（）多媒体（）其它（）推荐格式：application/msword；application/pdf电子版论文出版（发布）者电子版论文出版（发布）地权限声明论文总页数*63共33项，其中带*为必填数据，为22项。63