负载结肠癌干细胞gp96-肽复合物dc-cik对同源肿瘤干细胞杀伤作用的初步研究

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1、分类号：R55学校代码：10062密级：学号：2012602520硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目负载结肠癌干细胞gp96-肽复合物DC-CIK对同源肿瘤干细胞杀伤作用的初步研究TITLEPrimarystudyoftheeffectionofCIKcombinedwithDCPulsedgp96-peptidecomplexesfromcoloncancerstemcellonhomologouscancerstemcells一级学科：临床学科二级学科：内科学血液病学论文作者：于杰指导教师：庞华教授天津医科大学研究生院二〇一五年五月分类号：R55学校代码：

2、10062密级：学号：2012602520学位类别：科学学位√专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目负载结肠癌干细胞gp96-肽复合物DC-CIK对同源肿瘤干细胞杀伤作用的初步研究TITLEPrimarystudyoftheeffectionofCIKcombinedwithDCPulsedgp96-peptidecomplexesfromcoloncancerstemcellonhomologouscancerstemcells一级学科：临床医学二级学科：内科学血液病学论文作者：于杰指导教师：庞华教授天津医科大学研究生院二〇一五年五月学位

3、论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授

4、权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日天津医科大学硕士学位论文中文摘要【目的】研究结肠癌干细胞来源的gp96-肽复合物冲击树突细胞（DC）后，与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养，探讨其对结肠癌干细胞的杀伤效果。为进一步研究奠定基础。【内容】论文首先采用3种方法检测常规培养的结肠癌细胞HT29中是否存在肿瘤干细胞（CSC），三种方法分别是：双苯酰亚胺33342荧光染料检测常规培养HT29＋细胞中侧群细胞（SP）的比例，流式细胞仪分析HT29贴壁细胞中CD133细胞的比例，应用Westernblotting检测其AL

5、DH1蛋白表达情况；确认存在CSC后利用无血清悬浮培养法富集HT29结肠癌干细胞，并于显微镜下观察其成球状况及形态学特征；利用流式仪（检测HT29微球中CD133+细胞比例）、Westernblotting（检测ALDH1蛋白表达情况）及克隆形成试验对HT29结肠癌干细胞的富集效果进行检测，并进行统计学分析。继而，从HT29微球中提取细胞总蛋白后，通过硫酸铵分级盐析，经ConA亲和层析、DEAE离子交换层析纯化gp96-肽复合物备用；从脐血中分离单个核细胞，分别培养DC和CIK，用纯化的gp96-肽复合物冲击DC，与CIK共培养，采用LDH法检测gp96-肽复合物冲击DC-CIK细胞对

6、结肠癌CSC的杀伤活性，其结果用统计学方法分析。【方法】1.用双苯酰亚胺33342荧光染料检测常规培养HT29细胞中侧群细胞的比例，＋利用流式、Westernblotting分别检测HT29贴壁细胞CD133细胞的比例及ALDH1蛋白表达情况。2.使用添加多种因子的无血清培养基富集HT29结肠癌干细胞，显微镜下观察微球规则后，胰酶消化，制备单细胞悬液进行传代。3.HT29结肠癌干细胞富集效果的检测：采用流式细胞术检测HT29微球中CD133的表达，Westernblotting检测HT29微球中ALDH1的表达；克隆形成试验检测HT29微球的克隆形成能力。I天津医科大学硕士学位论文4.

7、将从结肠癌细胞HT29微球中提取的总蛋白通过硫酸铵分级盐析后，经ConA亲和层析、DEAE离子交换层析纯化gp96-肽复合物，并通过SDS-PAGE、蛋白免疫印迹对其进行鉴定，利用BCA法测定各步所得蛋白的浓度。5.从脐血分离单个核细胞后，分别培养DC、CIK，DC培养至第5天加入纯化的gp96-肽复合物，继续培养72h，促进DC成熟。于培养第10天将DC、CIK以1:5的比例混合培养，继续培养2-3天后采用LDH法检测对结肠癌CSC的杀伤活性