猪星状病毒rt-pcr检测方法的建立及两株江西地区猪星状病毒全基因组测序与分析

《猪星状病毒rt-pcr检测方法的建立及两株江西地区猪星状病毒全基因组测序与分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

’八一．去＊、一＂町石＾分类号：Ｓ８Ｓ５Ｊ学校代码，１０４１０巧级：学号：０２０２０１２２１４麻成豕ｔ夫等巧女《隹俗議猪星状病毒ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立及两株江西地区猪星状病奉全基因组测序与分析Ｔｈｅ－Ｅｓ化ｂ！ｉｓｈ助ｅｎｔｏｆＲＴＰＣＲ化ｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰｏｒｃｉｎｅＡｓｔｒｏｖｉｎｉｓｅｓａｎｄｔｈｅＣｏｍｌｅｔｅＧｅｎｏｍｅＳｅｕｅｎｃｉｎｇｐｑａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＴｗｏＳｔｒａｉｎｓｏｆＰＡｓｔＶｆｒｏｍＪｉａｎＸｉｇ＾申请人：黄瑶八兴Ｖ巧导教师；唐玉新教授一＂六学科专业：预防兽医学，心胃所在晓（所）；动物科学技米学隐论文提交日期一五年六月：二巧■■■ 独创性声明Ｉ本人声明，所呈交的学位论文，，是在指导教师指导下通过我的努力取得的成果并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中己经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在江西农业大学或其它教育机构获得学位或证书而使一用过的材料同对本研巧做出贡献的同志，。。与我都在论文中作了。明确的说明并表示了谢意如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任Ｍ学位论文作者亲笔签名：考偽日期；ｔ．化论文使用授权的说明本人完全了解江西农业大学有关保留、使用学位论文的规定．即学校有权送交论文的宮印他件，允许论文被查阅和借阅；学校可ｔｉｌ公布论文的全部或部分内容，可Ｗ采用影印、缩印或其复制手段保存论文。保密，在＾年后解密可适用本授权书。不保密，本论文属于不保密。ｙｆ位“（请在方框内巧小）学位论文作者亲笔签名；寺始日期；欠护＾指导教师亲笔签名：＾攻—日期：心竺；Ａ 本研究课题来源国家自然科学基金：腹泻新生仔猪肠道微生物群落宏基因组学分析（编号：31372457）ThisworkwasfundedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina:MetagenomicAnalysisoftheGutMicrobiomeinNeonatalPigletswithDiarrhea(No.31372457) 目录目录摘要.......................................................VABSTRACT...................................................VII第一章文献综述..............................................11.星状病毒简介........................................................12.星状病毒的命名和分类................................................13.星状病毒的形态特征和理化性质........................................24.星状病毒的基因结构..................................................35.星状病毒的病理学....................................................45.1临床症状........................................................45.2组织病变........................................................55.3致病机理........................................................56.星状病毒的诊断......................................................56.1直接电镜法......................................................56.2免疫电镜法......................................................66.3酶联免疫技术....................................................66.4免疫荧光技术....................................................66.5分子探针技术....................................................66.6反转录PCR.......................................................66.7免疫胶体金技术..................................................76.8环介导等温扩增技术..............................................76.9荧光定量PCR技术................................................77.星状病毒的细胞培养..................................................87.1人星状病毒的细胞培养............................................87.2动物星状病毒的细胞培养..........................................98.CDNA末端快速扩增技术..............................................9第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用...............121.试验材料和仪器设备.................................................121.1样品采集.......................................................121.2试剂...........................................................121.3主要的仪器和设备...............................................122.试验方法和步骤.....................................................132.1引物设计.......................................................132.2样品处理及RNA的提取...........................................132.2.1粪便样品的处理..............................................13I 目录2.2.2肠组织样品的处理............................................132.2.3RNA提取....................................................132.3反转录（RT）...................................................142.4PCR扩增.......................................................142.5琼脂糖凝胶电泳.................................................152.6PCR反应条件优化...............................................152.6.1退火温度优化................................................152.7H片段的胶回收.................................................152.8H片段回收产物的鉴定...........................................162.9H片段的T-A克隆...............................................162.9.1H片段与pMD18-T载体连接....................................162.9.2连接产物的转化..............................................162.9.3重组菌的扩大培养............................................162.9.4重组菌液的鉴定.............................................172.11H片段的测序..................................................172.12PCR扩增效率检测..............................................172.12.1质粒提取...................................................172.12.2标准品的建立...............................................172.13RT-PCR检测方法的应用.........................................183.试验结果...........................................................183.1重组菌液的PCR结果.............................................183.2退火温度优化结果...............................................193.3敏感性检测结果.................................................193.4江西各地区商业猪群中猪星状病毒感染率检测结果...................204.讨论...............................................................21第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株全基因组测序..............221.试验材料和仪器设备.................................................221.1样品采集.......................................................221.2试剂...........................................................221.3仪器和设备.....................................................221.4溶液和培养基的配制.............................................232.试验方法和步骤.....................................................232.1引物设计.......................................................232.2样品RNA的提取.................................................252.2.1样品的处理..................................................252.2.2病毒RNA的提取.............................................252.3两株病毒基因组各片段的扩增.....................................25II 目录2.3.1JXJA-1、JXJA-2、JXJA-3、JXJA-4、JXJA-5的反转录.............252.3.2JXZS-1、JXZS-2、JXZS-3、JXZS-4的反转录.....................262.3.3JXJA-1、JXJA-2、JXJA-3、JXJA-4、JXJA-5的PCR扩增...........262.3.4JXZS-1、JXZS-2、JXZS-3、JXZS-4的PCR扩增...................272.4两株病毒全基因组各片段的克隆和测序.............................282.4.1全长扩增片段的回收和纯化....................................282.4.2回收产物与载体连接..........................................282.4.3连接产物的转化..............................................282.4.4重组菌液的扩大培养..........................................292.4.5重组菌液的PCR鉴定..........................................292.4.6测序........................................................292.53’末端的扩增和测序............................................302.5.1第一条cDNA链的合成.........................................302.5.23’末端的PCR扩增..........................................302.5.33’RACE产物的胶回收........................................312.5.4回收产物与载体连接.........................................312.5.6回收产物的克隆和转化.......................................312.5.73’end片段的测序...........................................312.65’RACE........................................................322.6.1引物设计...................................................322.6.2病毒RNA准备................................................322.6.3第一条cDNA链的合成.........................................322.6.4末端PCR扩增................................................332.6.55’RACE产物的回收..........................................332.6.6RACE产物的无缝克隆（In-FusionClone）......................343.试验结果...........................................................353.1JXJA株全长各片段扩增结果......................................353.2JXZS株全长各片段扩增电泳结果..................................364.猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长序列分析.......................364.1JXJA株和JXZS株同源性分析.....................................374.2JXJA株和JXZS株与参考株同源性分析.............................404.2.1JXJA株和JXZS株与参考株全基因组同源性......................404.3JXJA株和JXZS株与参考株进化树分析.............................424.3.1基于基因组全长进化树分析....................................424.3.2ORF1ab和ORF2进化树分析....................................444.4衣壳蛋白（ORF2）分析...........................................465.小结与讨论.........................................................47III 目录全文总结....................................................48致谢........................................................54IV 摘要摘要星状病毒（Astrovirus）被认为是引起婴幼儿、老年人及抵抗力缺陷人群病毒性腹泻的第二大病原。星状病毒广泛分布于世界各地，可感染人、多种哺乳动物和禽类，其基因组变异性较大，适应宿主能力强。有研究表明星状病毒存在不同血清型和不同种间的基因重组，并可能存在动物之间和动物与人之间的跨种传播。星状病毒的宿主适应性、衣壳蛋白变异性、基因重组性使得其具有潜在的公共卫生学危险。猪星状病毒（PorcineAstrovirus,PAstV）可与轮状病毒、猪流行性腹泻病毒等肠道病原混合感染引起仔猪腹泻，造成巨大的经济损失。本研究根据GenBank登录的PAstVRNA依赖型RNA多聚酶(RDRP)基因的保守区域设计引物，建立并优化了一种快速高效的反转录多聚酶链式反应检测方法（ReverseTranscription–PolymeraseChainReaction,RT-PCR)，将扩增出的片段命名为H片段。然后，将H片段克隆至pMD18-T载体构建重组质粒标准品用于敏感性检测。敏感性检测结果表明本研究建立的RT-PCR方法能检测到的最低模板拷贝浓度为310copies/μl。应用该检测方法对从江西地区10个商业猪场采集的共219份仔猪粪便和肠组织样品进行了检测，检测结果表明PAstV在粪便样品的阳性率为29.2%（47/161），在肠组织样品的阳性率为51.7%（30/58）。从样品采集时间来看，1月份的样品阳性率最高为66.7%，3月份最低为18.7%。为研究江西地区猪星状病毒的遗传变异和分子流行病学，本研究首先对GenBank目前登录的12条PAstV全长序列进行了比对分析，在此基础上设计了5对特异性引物，对两株分别采集自江西吉安和江西樟树的PAstVJXJA株和JXZS株的基因组进行全长扩增，另外设计了2条RACE引物对cNDA末端进行扩增，将扩增的片段连接至pMD18-T载体并克隆测序。使用DNASTAR的Editseq和MegaAlign等软件将得到的各片段序列进行编辑和装配，最终得到JXJA株全长为6675nt，JXZS株全长为6700nt。对这两株病毒基因进行同源性分析，发现这两株病毒全基因核苷酸和氨基酸同源性分别为82.2%和66.3%，ORF1a同源性分别为94.9%和97.6%，ORF2同源性分别为62.6%和49.9%。本研究使用MEGA6.0软件对JXJA株、JXZS株和GenBank上登录的其它30株哺乳动物和禽类星状病毒参考株的全基因序列做遗传进化分析，对JXJA株、JXZS株和其他11株PAstV的全基因、ORF1a基因、ORF2基因分别做了遗传进化分析。全基因组进化树分析结果表明猪星状病毒JXJA株和JXZS株与猪星状病毒4型遗传距离最近，与鼠星状病毒较近，存在重组的可能,与人星状病毒较远，重组可能性较低。此外，ORF2的进化结果表明，JXZS株与JXJA株以及其他2株4型PAstV包括野猪星状病毒匈牙利株处于进化树不同分支，基于星状病毒依据ORF2基因型分型的原则，JXZS株可能为一株新型的猪星状病毒。本研究建立了一种针对PAstV的RT-PCR检测方法，将该方法用于江西商业猪场的PAstV感染率检测，结果表明江西地区猪群PAstV感染普遍,冬季较高。与此同时，本研究对两株江西地区PAstV的全基因序列进行了分析，分析结果揭示了江西地V 摘要区PAstV的遗传和变异关系，本研究的测序株与目前国内报道的仅有的1株上海株和1株广西株基因组差异大，提示与这两株PAstV可能属于不同的血清型。研究结果为PAstV的研究提供了更多的参考依据，为PAstV的诊断和防控提供了理论基础和方法。关键词：星状病毒；RT-PCR；基因组全长；进化树VI AbstractAbstractAstrovirusisconsideredtobethesecondarycauseoftheviraldiarrheaamonginfantsandelders.Astrovirusdistributeswildlyintheworldwhileitcaninfectvariousofmammalsandaviansandhasahighvariationingenome.Researcheshaverevealedthatgenomicrecombinationmayexistbetweendifferentserologictypesofastrovirus.Soitmayhastheabilitytospreadbetweendifferentspeciesofanimalsorfromanimalstohumans,whichmakesastrovirusbecomeapotentialzoonoticagent.Inaddition,theporcineastrovirus(PAstV)cancauseawaterydiarrheainpigletswhencoinfectedwithporcineepidemicdiarrheavirusandrotavirus,andthuscausingsustantialeconomiclossesinpigindustry.Toestablishanovelreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)fordetectionofporcineastroviruses,apairofprimersspecifictoRNAdependentRNApolymerase(RDRP)geneofPAstV,themostconservedregion,wasdesignedandthenarapidandefficientRT-PCRmethodfordetectingPAstVwasestablishedandoptimizedbasedonthedesignedprimers.TheRT-PCRproducts,designatedasfragmentH,wasclonedintopMD18-TvectorasstandardsforthedeterminationofthesensitivityoftheRT-PCRmethodestablished.Theresultsshowedthatthedetectionlimitofthismethodwas310copies/µl.Afterwards,smallintestineandfecalsamples(N=219)wereexaminedbyusingtheestablishedassay.TheresultsshowedthatthepositiverateofPAstVwas51.7%forintestinesamplesand29.2%forfecalsamples.ToaddressthemolecularcharacteristicsofPAstVsatthebasisofthecompletegenome,5pairsofprimerforamplificationoffull-lengthofgenomeand2pairsofprimerfor5’and3’RACEweredesigned.Therewith,twostrainsofPAstV,onefromJiangxiJi’an(JXJA)andanotherfromJiangxiZhangshu(JXZS)weresequenced,Thefull-lengthgenomeofJXJAandJXZSwere6,675ntand6,700ntinsize,respectivelyafterannotatedwithDNAStar.TheresultsofmultialignmentanalysesofthesetwoPAstVstrainsindicatedthatthenucleotideidentityandthededucedaminoacididentityofthecompletegenomewere82.2%and66.3%,respectively.TheidentityofORF1awasthehighest(94.6%(nt)and97.6%(aa)),whiletheidentityofORF2wasthelowest(62.6%(nt)and49.9%(aa)).DuetothevariabilityoftheORF2,thepresumedORF2capsidproteinofPAstVstrainsofJXJAandJXZSinhydrophobicityandantigenicitywerecompared.Inaddition,aphylogenetictreebasedonthecompletegenomeofthetwoPAstVstrainssequencedinthisstudyand30referenceastrovirusstrainsretreavedfromGenBankwasconstructed.Thephylogenetictreeshowedthatthesequencedstrainsweremostclosedwithtype4PAstVs.PhylogenetictreebasedontheORF2geneshowedthatJXZSstrainwasfallenintothedifferentbranchunlikeJXJAstrainandothertype4PAstVs,whichwereclusteredintoanothergroup,suggestingtheJXZSstrainmightbeanovelgenotypeofPAstV.Together,theresultsfromthisstudyrevealedthegeneticcharacteristicsofthegenomeofPAstVscurrentlycircultinginJiangxiprovince.Uptodate,thereportsonPAstVinChinaareverylimited,e.g.,thereareonlytwocompletegenomesequencesofPAstVs,VII AbstractfromShanghaiandGuangxi,respectivelyavailableinGenBank.AsthegreatvariabilityofthesequenceatthecompletegenomelevelwhencomparedwithotherreferencePAstVstrains,thePAstVsdeterminedinthisstudymightbeanovelgenotype.ThefindingsofthisstudyprovideausefultoolfordetectionofPAstVsandmolecularbasiswhichwillenrichourknowledgeonPAstVvirology,whichwillbenefitthepreventionandcontrolofthediseasecausedbyPAstVs.Keywords:Astrovirus；RT-PCR；CompleteGenome；PhylogeneticTreeVIII 第一章文献综述第一章文献综述1.星状病毒简介星状病毒最早于1975年由Madeley和Cosgrove等人在电镜下观察患胃肠炎婴儿[1]的粪便样品时发现，其外观呈星状，有五至六个角，表面光滑，直径约28纳米。星状病毒目前被认为是导致婴幼儿及免疫力下降人群患病毒性胃肠炎的重要病原之[2]一，尤其是对于婴儿病毒性腹泻来说，星状病毒被认为是除了轮状病毒外第二大致病原。星状病毒广泛分布于世界各地并能感染多种动物，迄今为止，除了人以外，星状病毒在猪、野猪、牛、羊、犬、水貂、猫、蝙蝠等31种哺乳动物和鸡、鸭、火鸡[3-15]等6种禽类中都有发现。星状病毒有如此广泛的宿主谱主要源于其基因组的高度变异性，这些变异使得病毒具有很强的适应新宿主的能力，已经有越来越多的证据表[16]明星状病毒可能存在跨种间传播。因此，研究星状病毒基因组的变异在公共卫生学上具有重要意义。猪星状病毒（porcineastrovirus）最早由Briger于1980年在电镜下观察3周龄腹[6]泻仔猪的粪便样品时发现。猪星状病毒在世界范围内分布广泛，在健康猪群中普遍存在感染，其常与冠状病毒、轮状病毒等肠道病毒混合感染引起猪的急性胃肠炎和腹泻。每年由于腹泻导致大量初生仔猪死亡，对养猪业造成巨大的经济损失，星状病毒感染是其原因之一，因此了解星状病毒在猪群的感染状况对仔猪腹泻的研究具有重要意义。2．星状病毒的命名和分类星状病毒由于在电镜下的大小和形态接近小RNA病毒，最初被归类到微RNA病毒科，同样为核酸为无囊膜单股正链RNA，星状病毒的分子结构和复制机制却不同于微RNA病毒和杯状病毒。在复制机制上，星状病毒和杯状病毒在核酸的复制过程中会产生亚基因组，而微RNA病毒不产生。在衣壳蛋白结构上，星状病毒有多个[6,17,18]大小不同的衣壳蛋白而杯状病毒只有一个58-65kd的衣壳蛋白。因此在1993年的第六次国际病毒分类学报告中将星状病毒归类为星状病毒科，该病毒科包括哺乳动物星状病毒和禽星状病毒两个病毒属。在2012年第九次病毒学分类报告中，国际病毒分类委员会（ICTV）按照衣壳蛋白的遗传距离即ORF2基因的同源性和物种的来源作为同属病毒的不同种的分类标准，将哺乳动物星状病毒（Manastrovirus）分为19个种，分别为Mamastrovirus1至Mamastrovirus19，以人星状病毒为代表种。将禽星状病毒分为3个种，分别为Avastrovirus1至Avastrovirus3，以火鸡星状病毒为代表[19]种。猪星状病毒共五个血清型，分别为猪星状病毒1型，猪星状病毒2型，猪星状[20]病毒3型，猪星状病毒4型和猪星状病毒5型。1 第一章文献综述3.星状病毒的形态特征和理化性质人星状病毒和动物星状病毒在形态上基本一致，在电镜下用磷钨酸钾或钼酸铵负染，可见病毒粒子呈20面体对称，球形无囊膜，衣壳外有5至6个突起结构，在样品中的星状病毒直径为28至30纳米，在单层细胞中培养的星状病毒体积较大，直径可达41[21]纳米，细胞培养的病毒粒子表面有明显的纤突但是不呈典型的星状，使用碱性磷酸酶处理后才出现星形。人星状病毒在用磷钨酸钾染色后只有10%呈星状结构，而用钼[22]酸铵染色后几乎全部病毒粒子都呈现典型的星状结构。使用冷冻电子显微镜技术可以发现星状病毒粒子的衣壳蛋白和少量散布的突起，这些衣壳蛋白突起的晶体结构特[23]征对研究病毒感染中细胞受体和宿主特异性具有重要意义。人星状病毒的排列方式呈类晶格样，粒子间隔6.5nm。Aroonprasert等报道牛星状病毒粒子的平均直径为[24]34nm。羊星状病毒主要存在于绒毛尖端上皮细胞，偶尔见于巨噬细胞。在细胞膜或空泡内也可见到病毒。常可见到无核心的病毒粒子，其平均直径为24.8±0.6nm。Shimizu等观察到猪的星状病毒粒子呈球形，直径为30nm左右，除部分呈星形外还有[25]少量空壳粒子存在。图1-1人星状病毒电镜图（图片来自LindaSaif）TransmissionelectronmicrographofAstrovirusparticles（FromLindaSaif）完整的人星状病毒粒子在氯化铯中的密度为1.35g/ml至1.37g/ml，火鸡星状病毒的浮力密度为1.34至1.36g/ml，猪星状病毒密度为1.38g/ml，文献记载的星状病毒最大7密度为1.39至1.40g/ml。病毒的RNA基因组分子量为2.7×10道尔顿，在蔗糖梯度中的[26]沉降系数为35s星状病毒不易灭活，对酸不敏感，在PH为3的酸性环境中稳定存在。星状病毒耐热性较强，能抵抗50℃处理1小时，60℃处理5分钟。此外，星状病毒对有机溶剂（氯仿和乙醚）、各种洗涤剂和脂溶剂、胰蛋白酶及两性离子消毒剂等稳定，[27]对除90%酒精外的其它各种浓度的酒精不敏感。星状病毒的实验室灭活一般使用90%[28]酒精或者含过硫酸盐的消毒剂。2 第一章文献综述4.星状病毒的基因结构星状病毒的基因组为一条单股正链RNA，基因组长度最短的为6124nt，最长的为7722nt。至今为止在GenBank中收录的星状病毒全长序列有147条，主要包括人和猪、牛、兔、水貂、火鸡、鸡、鸭等动物中发现的星状病毒。其中猪星状病毒基因组全长序列共登录12条，基因组全长为6318nt至6706nt。目前对于猪的星状病毒基因结构研究不多，对人星状病毒基因组的研究较多。人星状病毒和猪星状病毒的基因组结构相似，在基因组RNA的5’端共价连接着一个基因连接蛋白（Vpg蛋白），RNA的3’端为长约30nt的多聚腺苷酸尾巴（polyA）。星状病毒包含3个开放性阅读框（ORF）和两个非编码区（5’UTR和3’UTR），开放性阅读框的顺序从病毒基因组的5’至3’分别为ORF1a(约2.8kb)、ORF1b（约1.4kb）、ORF2（约2.4kb）。[29]图1-2星状病毒基因组结构示意图Fig1-2Genomicstructureofastrovirus一般情况下，ORF1a编码非结构蛋白，ORF1b编码RNA依赖性RNA聚合酶(RDRP)，RDRP是通过核糖体移位机制合成的一个融合蛋白。ORF2编码结构蛋白。人星状病毒的ORF1a包括一段跨膜螺旋蛋白酶序列，一个假定的蛋白酶依赖性切割位点（HEL），一个核酸定位信号（NLS），一个核糖体移码信号和一个免疫抗原表位，ORF1a可编[30]码丝氨酸蛋白酶。ORF1b包含了第一个框内起始密码子AUG，可编码RNA依赖性RNA多聚酶。ORF2编码一个87kd的衣壳蛋白前体VP90，该前体可聚合形成类病毒颗[31]粒，由于其表面存在抗原决定簇可作为候选疫苗。VP90衣壳蛋白前体后续在细胞内半胱氨酸蛋白酶的作用下形成VP70蛋白，失去C末端的酸性区域。VP70蛋白聚合成的颗粒并不成熟需要胰酶的裂解，其在细胞外通过十分复杂的途径产生具有很强感[32]染性的衣壳蛋白粒子VP34，VP27/29，VP25/26。VP34来自多聚蛋白高度保守的N末端区域，构成病毒衣壳的外壳，VP27/29和VP25/26来自高变异的C末端区域，构成病毒表面的二聚体纤突。星状病毒的ORF1a和ORF1b，ORF1b和ORF2之间存在短重叠区域。不同的星状病毒重叠区域的大小不一，哺乳动物星状病毒的ORF1a和ORF1b的重叠区域长度为[33]10nt至148nt，而禽星状病毒为12nt至45nt。在ORF1a和ORF1b的重叠区域存在一个3 第一章文献综述七聚体形式的移码序列AAAAAAC，在转录的过程中作为核糖体移码的诱导信号（RFS），下游RDRP基因依赖核糖体移码机制进行表达，所以该信号为其表达的必需[34]信号。除了最新发现的鸡星状病毒之外（鸡星状病毒的ORF1b中自带启动子），RFS[35]在所有星状病毒中都存在。而以核糖体移码机制完成RDRP的表达也是星状病毒和其他单股正链RNA病毒的主要区别。ORF1b和ORF2的重叠区域长度各异，也可能不存在重叠（鸭星状病毒），重叠区域中同样有一段高度保守的序列，作为亚基因组合[36]成的启动子。在病毒RNA复制的过程中会形成全长6.8kb基因组RNA和一种长约2.8kb的亚基因组RNA，这两种RNA都包含ORF2，而亚基因组可作为mRNA编码病毒[37-39]衣壳蛋白。星状病毒的5’UTR位于5’末端长度为11nt至80nt，3’UTR位于ORF2和polyA之间，长度为80nt-85nt。目前在星状病毒中未发现有内部核糖体插入位点（IRES），该位点存在杯状病毒中同样不存在，但存在于于其他的单链RNA病毒如小RNA病毒科和黄病毒科中。星状病毒的ORF1a和ORF1b相对保守，其RDRP基因为保守基因，5’UTR和3’UTR也属于保守区域，ORF2基因的变异性很强，不同种的星状病毒甚至同种不同血清型的星状病毒之间的ORF2基因差别较大，而病毒的抗原决定簇主要位于ORF2基因，ORF2基因的变异使得病毒的抗原表位变异性较大，这很可能是星状病毒具有强大的宿主适应性的原因。5.星状病毒的病理学5.1临床症状人星状病毒（HAstV）作为第二大胃肠道病毒在世界范围内分布广泛，HAstV对儿童易感，成人的感染报导极少。血清学研究表明大多数儿童感染HAstV后可产生抗体保护以后不被感染。免疫低下人群和老年人也属于HAstV易感人群。HAstV感染的典型症状是温和的水样腹泻，伴随呕吐、发热、厌食和腹痛，持续2至3天。相对于杯状病毒和轮状病毒感染来说，星状病毒感染出现呕吐症状的较少，而HAstV相对来说[40,41]潜伏期较长，平均潜伏期为4.5天。通常来说HAstV引起的腹泻症状比杯状病毒和轮状病毒更温和，可自然耐过。无论儿童还是成人都存在隐性感染，对免疫缺陷人[42-44]群的研究表明，HAstV感染与胃肠炎的发生有关。而最近在对免疫高度缺陷的儿[45]童研究中发现HAstV感染可扩散至全身造成致死性感染。为此，YokoyamaCC等用鼠星状病毒和免疫缺失的小鼠证实了病毒在体内的分布除了胃肠道外，还存在于脾脏、肝和肾中。尽管引起肠套叠的频率和次数比轮状病毒和诺如病毒低，我们依然不能忽[46]视星状病毒引起肠套叠的风险。4 第一章文献综述5.2组织病变对HAstV感染患者的空肠和十二指肠活体组织样品的研究发现病毒增殖主要位于肠上皮细胞表面，尤其是肠绒毛的尖端，可引起小肠绒毛萎缩，伴随着小肠轻微炎[47,48]症反应。对实验室感染的小羊、小牛和火鸡的肠组织的超微结构研究发现星状病毒只感染成熟的肠上皮细胞，病毒粒子顺着小肠微绒毛呈次晶状排列，与溶酶体和自噬小泡混[52]在一起，一些病毒粒子被巨噬细胞吞噬，一些在溶酶体中。被病毒感染的小肠细胞脱落在肠管内，病变最严重的部位是空肠和回肠，在结肠中观察不到病毒的感染。使用小鼠模型进行星状病毒研究发现小鼠并不产生腹泻症状，不同小鼠品种对病毒易感性不同。星状病毒在野生鼠体内潜伏14天后被发现，在十二指肠、空肠、结肠[14,45]附近和肠系膜淋巴结中都检测到病毒RNA存在。5.3致病机理由于星状病毒感染的小肠病变和炎症反应相对轻微，人们不得不研究是否有其他机制导致宿主的腹泻症状。在一般的腹泻感染中，致病机理主要是小肠上皮细胞损伤和炎症反应，而星状病毒感染中水和电解质的快速流失源于小肠吸收功能受阻，分泌[49]过程的激活和肠上皮屏障渗透性的下降。对火鸡感染模型的研究发现在感染过程中麦芽糖酶的活性降低，导致二糖的消化和吸收能力降低引起渗透性腹泻，直接影响小肠的吸收功能导致钠的吸收降低，这可能使得钠转运蛋白重新分配而增加钠氢交换体NHE2的数量和增加NHE3从膜上转运[50]到胞质内。但是对感染火鸡的肠细胞进行分析时却并没有找到细胞旁路扩张的证据。最终，研究者使用HAstV感染CaCo-2细胞时发现了F肌动蛋白的重排，同时还有闭合蛋白的重排和细胞屏障的破坏。这证实了星状病毒导致腹泻的主要机理是影响电[51]解质平衡和使小肠屏障渗透性下降。6.星状病毒的诊断6.1直接电镜法星状病毒最初的检测使用的是直接电镜法，将粪便样品经阴极染色后直接在电镜下观测。对于有腹泻症状的人或者动物来说，样品中往往覆盖了大量的星状病毒，使[1]用电镜法能够有效的检测出来。直接电镜法能检测到的最低病毒浓度为每克样品中6710至10个病毒粒子。由于星状病毒在电镜下往往只有10%的病毒粒子呈现典型的五角或六角星状，所以在电镜下很难区分出星状病毒和其他的表面无明显特征的圆球状[27]病毒。相对来说使用电镜法检测星状病毒不仅费时费力，而且还需要经验丰富的操5 第一章文献综述作人员。6.2免疫电镜法由于电镜法的种种限制，Reynolds等使用了特异性和敏感度更高的免疫电镜法对星状病毒进行检测，免疫电镜法需要有与病毒血清型一致的抗体，在做免疫电镜时可能掩盖病毒典型的形态学特征，也可能无法检测出病毒新的血清型。6.3酶联免疫技术[52]Herrmann等将酶联免疫法（EIA）用于星状病毒的检测，此方法基于抗原和抗体反应的特异性和酶催化的高效性，以方便快捷高效的优势被广泛用于实验室对病原的检测。使用酶联免疫法需要抗病毒衣壳蛋白保守区域的单克隆抗体作为一抗，和过氧化物酶标记的多克隆抗体作为检测二抗。之后的研究发现用生物素标记检测二抗可[53,54]以使信号放大从而提高检测的敏感度。EIA方法可用于血样检测，并且针对不同型的病毒使用不同的单抗，使得EIA法可以检测并鉴别不同的病毒血清型。EIA法简单快速，尤其是在做流行病学调查时需要检测大量样品，EIA法十分有效。6.4免疫荧光技术此方法同样基于抗原和抗体的特异性反应原理，主要用于细胞培养物中的病毒和肠组织切片中病毒的检测。IF法简单快速，还可以用于研究病毒在组织中的分布和在病毒细胞中的增殖，但检测对象局限于死亡动物，无法对粪便中的病毒样品进行检测。6.5分子探针技术分子探针技术基于碱基互补配对的特异性和酶促反应的高效性，其敏感性和EIA相当。其原理是设计一段探针与病毒RNA互补，而探针上偶联的碱性磷酸酶可催化底[55]物显色。亲和素系统和地高辛（DIG）标记探针系统被用于改进的分子探针技术中，探针杂交完成后再使用生物素或者抗DIG抗体进行级联放大反应，大大提高反应敏感[56]性，主要见于原位杂交实验。而将探针与荧光素偶联进行荧光探针杂交或者将荧光素偶联于抗DIG抗体进行荧光抗体放大反应，最后通过荧光显微镜观察荧光，更大程[55]度的提高了反应的速度和检测性。原位杂交实验可以很好的揭示病毒在组织切片中[57,58]的感染状况，也可以在膜上检测病毒核酸。6.6反转录PCR反转录PCR法（RT-PCR）属于分子检测方法，其原理基于核酸碱基的互补配对6 第一章文献综述和基因的扩增和聚合酶链式反应（PCR）。由于碱基互补的特异性和PCR反应的放大性，使得RT-PCR方法具有极高的特异性和敏感性。RT-PCR方法的出现使得病毒检测的效率大大提高了几个数量级，其最低检测限度达到了每个样品10至100个病毒拷贝。RT-PCR方法适用于RNA病毒的检测，包括反转录（RT）和PCR。其中引物的特异性和效率是该方法成功的前提条件，所以引物的设计需要尽可能的考虑多种因素，如引物与模板的同源性，上下游引物之间的二聚体，引物自身二级结构，引物退火温度等，而RT反应使用的酶也有许多种类，比如说源于小鼠的M-MLV，源于禽类的AMV，具有长片段扩增性的Superscript等，可根据需求选择不同的酶和适合酶的缓冲体系[57]（Buffer）。在RT-PCR的基础上衍生出的一步RT-PCR法，多重RT-PCR法，RT-巢[59,60]式PCR法等使得RT-PCR的应用更多样。一步RT-PCR法简化了操作，缩短了RT-PCR的时间，多重RT-PCR在一个PCR反应中加入多对引物从而可以同时检测多种病毒或者检测一个病毒的多种血清型。RT-巢式PCR方法通过RT和巢式PCR的结合大大增强了反应的特异性。直到今天，传统RT-PCR方法及其衍生而来的各种RT-PCR法[61,62]仍然广泛沿用于各实验室的病毒。6.7免疫胶体金技术免疫胶体金技术（ICG）的原理基于抗原抗体的特异性反应，以胶体金为标记物在显微镜下对抗体或者抗原进行定位、定性或者定量研究的固相标记免疫检测技术。[63]最早于1971年由Faulk等首次用于检测细菌表面抗体分布。目前ICG已经被广泛用于被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、流式细胞术、液相免疫测定、斑点金免疫渗滤及免疫层析等，其中医学检验中主要使用的是免疫层析法（ICA）和快速免疫金渗滤[64]法（DIGFA）。ICG作为一种简便快速、敏感性强、特异性高、成本低廉的检测方[65,66]法，已经被广泛应用于病原临床检测、蛋白检测、药物检测等领域。6.8环介导等温扩增技术[67]2000年Notomi等发现了环介导等温扩增技术（LAMP），并将其用于病原微生物基因检测。LAMP技术比传统的PCR扩增技术具有更高的灵敏度，而且恒温反应条[67,68]件使得反应时间大大缩短，LAMP技术可在在1至2小时之内将产物量扩增百万倍，最后可通过肉眼或者染料显色观察颜色变化来判定实验结果。杨丽等建立的[69]RT-LAMP技术对HAstV的检测灵敏度可达每微升10-100个模板拷贝。目前主要通过对扩增产物进行限制性内切酶做酶切鉴定来验证是否发生非特异性反应，鉴定较为繁[70]琐，如果能找到更直接简便的鉴定方法将极大的提高LAMP法的实用性。6.9荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术（Q-PCR）全称real-timefluorescencequantitativePCR，是7 第一章文献综述一种结合PCR反应和荧光检测系统的高灵敏测技术，并且可以在每一个循环实时的检测荧光强度，通过荧光信号的累积制作扩增曲线和标准曲线对原始模板的基因拷贝数进行计算。Q-PCR方法有多种，常见的有SYBRGREEN染料法、TaqMan探针法、分子信标法等。染料法的原理是核酸染料（SYBRGREEN）会特异性结合于DNA双链中的凹槽，而SYBRGREEN本身是荧光染料，其荧光强度与DNA双链数量成正比，在理想扩增效率下每过一个循环，荧光强度增加一倍，最后依据待测样品中荧光强度达到阈值的循环数（CT值）和标准品（初始拷贝已知）的CT值的比值计算出带重测[26]样品的初始拷贝数。SYBRGREEN法检测灵敏度可达10至100个拷贝每μl样品。此外，由于SYBRGREEN染料可能结合在非特异扩增产物上，也可能结合在引物二聚体上，虽然通过对熔解曲线的分析可以知道扩增产物是否与预期一致，但该方法十分[71,72]依赖于引物的特异性和质量。TaqMan探针法依赖于taqDNA多聚酶的外切酶活性，其原理是设计一条16bp至25bp长的MGB探针与模板DNA反向互补，探针的两端分别共价连接了一个报告基团（reporter）和一个淬灭基团（quencher），在普通状态下由于两个基团距离很近，荧光处于淬灭状态无荧光信号。在PCR的退火过程，探针和引物同时结合至模板DNA，在延伸过程中由于taq酶的外切作用，当引物延伸至探针的位置时探针被分解，报告基团离开淬灭基团发射荧光，所以荧光的强度与新增的DNA链数量成正比，同样是每过一个循环荧光强度增加一倍，最后依据待测样品的CT值和标准品的CT值的比值和标准品的拷贝数计算出待测样品的拷贝数。探针法具有高特异性的优势，有效避免[73-75]了非特异扩增和引物二聚体，其检测灵敏度高达1至10个拷贝每μl样品。7.星状病毒的细胞培养7.1人星状病毒的细胞培养1977年，Lee等使用免疫荧光抗体技术（IFA）首次检测到人星状病毒在人原肾细[76]胞（HEK）中存在增殖。1981年有研究发现在加入胰酶的情况下，星状病毒可在[18]HEK细胞中连续传代培养，随后星状病毒被成功转染至狒狒原代肾细胞（PBK）。至1984年，共有5种血清型的人星状病毒在恒河猴肾细胞（LLCMK2）中成功培养，但是感染病毒的LLCMK2细胞并不出现病变（CPE）。之后有研究从粪便样品中分离到一株人星状病毒1型毒株，该毒株在可连续传代的人结肠癌细胞系（CaCo-2）中培养成功，并且在接种病毒的细胞中观察到了CPE。此后星状病毒又分别在293细胞、BHK-21细胞、PLC/PRF/5细胞中成功培养。至今，人星状病毒的所有8种血清型都已[77]经成功在CaCo2,T84，HT-29，和MA-104等细胞中培养和增殖。8 第一章文献综述7.2动物星状病毒的细胞培养与人星状病毒不同，动物星状病毒很难适应细胞培养环境，除牛星状病毒和猪星状病毒外，其他动物星状病毒无论在原代细胞还是在传代细胞中均未培养成功。Yu等试图用火鸡胚胎肾细胞、火鸡肾细胞、CaCo2细胞、Vero细胞、BGM-70细胞等多种细胞培养火鸡星状病毒（TAstV），但结果无一例外均失败了。通常在实验室中只能使用火鸡胚培养TAstV，TAstV能接种在22天的SPF火鸡胚卵黄囊或者24天的火鸡胚羊膜腔中。在接种病毒后的第4至5天，火鸡胚的小肠组织，胸腺和法氏囊可收集用于病毒的分离和纯化。在大部分的感染火鸡胚的小肠组织中可观察到明显的肠壁变薄，[78,79]肠管膨胀充满气体或液体等病变。但这种病变并不会致死火鸡胚，两周大的SPF[56]火鸡幼禽也可以用于火鸡星状病毒的培养，但是其病毒产量低于火鸡胚。1990年，Shimizhu等使用原代猪胚胎肾细胞分离到一株猪星状病毒，并且该病毒可使细胞产生CPE，感染的细胞增大，胞质中出现颗粒物，该毒株被用于研究星状病毒的特征和理[80,81]化性质。近年来陆续有使用PK15细胞分离猪星状病毒的报导，但PAstV的具体嗜[81,82]细胞性还不清楚。8.cDNA末端快速扩增技术cDNA末端快速扩增技术（rapidamplificationofcDNAends,RACE）是一种基于mRNA反转录和PCR技术建立起来的，以部分的已知区域序列为起点，扩增基因转录未知区域从而获得cDNA完整序列的方法。图1-33’RACE原理示意图Fig1-3Schematicdiagramof3’RACE在全长基因组扩增中，由于3’末端和5’末端的引物是根据参考序列所设计合成，而测序的病毒株相对参考株在引物位置处的序列可能存在突变，为了完整的扩增出待9 第一章文献综述测病毒株的真实3’末端和5’末端序列，需要使用RACE技术来完成mRNA(cDNA)末端的序列扩增。图1-45’RACE原理示意图Fig1-4Schematicdiagramof5’RACERACE技术于1988年由Frohman等发明使用。对于带polyA尾的mRNA序列，3’RACE的原理较为简单，以3’端加连续T修饰的引物为下游引物进行反转录，得到的第一链cDNA，再以特异性引物（genespecificprimer,GSP）为上游，不加T的下游引物为下游做PCR，即可得到包含待测mRNA的3’末端全长的产物。5’RACE的原理相对来说较为复杂，其原理是使用GSP作为下游引物反转录，而反转录到RNA末端时特殊的酶会在cDNA末端引入一段已知的接头序列，最后选择在3’端含接头序列的通用引物UPM作为上游引物，以GSP做下游引物进行PCR，从而扩增出包含mRNA5’末端全[83]长的产物。随着分子生物学技术的发展，RACE技术得到了改进，RACE的种类大大丰富，先后出现了Adapter-LigatedRACE、RLM-RACE、Cap-switchingRACE、环形RACE、[84-88]RCA-RACE等。对于扩增不同类型的RNA的cDNA末端，选择合适的RACE方法可以大大提高扩增效率和成功率。随着蛋白质组学和转录组学研究的不断深入，RACE技术与其他分子生物学技术的结合，如抗体技术、Q-PCR技术等等，将会是一[89]种趋势并且在交叉领域会获得新的发展。9.研究目的和意义PAstV可与猪流行性腹泻病毒（PEDV），轮状病毒等肠道病毒混合感染引起仔猪腹泻，造成仔猪死亡或称为僵猪，降低饲料报酬，每年给猪场带来重大的经济损失。10 第一章文献综述了解PAstV在猪群中的流行情况对有效防控PAstV，降低经济损失具有重要意义。国内外关于星状病毒基因组及遗传进化分析表明,星状病毒不仅可以感染处于不同环境中的多种动物,而且具有跨越种间屏障并且适应新宿主的潜力。猪是多种人兽共患病病毒的自然宿主，包括戊型肝炎病毒、尼帕病毒，H1N1型流感病毒等，同时猪也是诺如病毒、沙坡病毒、轮状病毒的潜在动物传染源。所以，星状病毒有在猪和人之间传播的潜在危险。因此，对PAstV的基因组进行遗传进化分析在公共卫生学上具有重要意义。11 第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用1.试验材料和仪器设备1.1样品采集本试验所使用的粪便和肠组织样品均于2013年至2014年采集自江西地区各商业猪场。样品使用冷冻保温盒运输，在实验室分装于无菌离心管进行编号和记录，并冻存于-80℃冰箱。1.2试剂RNAisoPlus购自大连宝生物公司RibonucleaseInhibitor购自大连宝生物公司M-MLV反转录酶购自大连宝生物公司dNTPs购自大连宝生物公司5×M-MLVRTBuffer购自大连宝生物公司10×PCRBuffer购自大连宝生物公司rTaqDNA聚合酶购自大连宝生物公司DNAMarker购自大连宝生物公司琼脂糖购自BioWest公司Top10感受态细胞购自北京天根生物公司pMD18-T连接试剂盒购自大连宝生物公司质粒提取试剂盒购自北京天根公司胶回收纯化试剂盒购自Omega公司1.3主要的仪器和设备ABI9700PCR仪美国ABIThermoSORVALLLEGENDMICRO21R赛默飞世ThermoSORVALLST16R赛默飞世隔水式恒温培养箱上海跃进医疗器械厂恒温振荡器北京培因超低温冰箱DW-86L388青岛海尔三恒多用电泳仪北京六一仪器厂Nanodrop2000赛默飞世12 第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用单人单面操作台苏州智净2.试验方法和步骤2.1引物设计基于猪星状病毒RDRP基因（RNA依赖性RNA多聚酶基因）的高度保守性，使用MEGA5.2软件将GenBank上登录的85株猪星状病毒RDRP基因进行比对（multialignment）。然后选择最保守的区域使用Primer3软件设计引物，再将引物在NCBI上进行BLAST以检测其特异性。设计的猪星状病毒检测引物信息如下：引物名称引物序列5’-3’片段大小片段位置PAstV-H-FGACATTTTGTGGATTTACAGTTGGPAstV-H-RTTGGTCCTCCCCTCCAAAG279bp3803-4082引物由上海生工生物工程有限公司合成。将扩增的目的产物命名为H片段。2.2样品处理及RNA的提取2.2.1粪便样品的处理①将粪便样品按1:10（重量:体积）比例加入1×PBS溶液。②在斡旋仪上斡旋5分钟使粪便充分悬浮在PBS溶液中。③悬浊液反复冻融3次。④8000×g离心5分钟取上清置于-80℃冰箱备用。2.2.2小肠组织样品的处理①剪取0.5g小肠组织置于匀浆器底部。②向匀浆器中加入1ml1×PBS溶液。③在冰上研磨匀浆10分钟至组织充分磨碎呈匀浆状。④将组织匀浆倒至离心管。⑤8000×g离心5分钟，取上清置于-80℃冰箱备用。2.2.3RNA提取①取250μl处理过的上清液（粪便或者小肠组织匀浆上清）加入750μlTRIZOL溶液，振荡混匀，静置5分钟。②向混合液中加入200μl氯仿，振荡混匀，静置5分钟。13 第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用③14000×g离心10分钟，可见溶液分三层，上层清亮透明，中层呈白色薄膜状，下层呈粉红色透明状。④吸取400μl上清于1.5ml离心管，加入400μl异丙醇，缓慢地上下颠倒混匀。⑤14000×g离心10分钟。⑥弃上清，在离心管中加入1ml浓度为75%的由DEPC处理高压灭菌去离水配制的乙醇。⑦14000×g离心5分钟。⑧弃上清，风干管内剩余乙醇。⑨向管底加入30μl经DEPC处理的高压灭菌去离子水溶解RNA。⑩RNA分装后储存于-80℃冰箱。2.3反转录以提取的RNA为模板，进行反转录反应合成cDNA。反转录反应体系如下无RNA酶水10μl反转录酶M-MLV0.5μlRNA酶抑制剂（RRI）0.5μl5×M-MLVBuffer4μldNTPmix2μl下游引物（reverseprimer，10pg/μl）1μl（终浓度0.5pg/μl）模板RNA2μl总体积20μl反应条件如下42℃50分钟95℃5分钟4℃5分钟反应完毕将产物储存于-20℃。2.4PCR扩增以反转录产物cDNA为模板，PAstV-H-F和PAstV-H-R分别为上下游引物进行PCR反应。PCR反应体系如下cDNA模板2.5μl10×PCRbuffer2.5μldNTP1μl上游引物（forwardprimer）1μl14 第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用下游引物（reverseprimer）1μlrTaqDNA聚合酶0.25μl去离子水16.75μl总体积25μl反应条件如下①94℃预变性5分钟②94℃变性30秒③52℃退火30秒④72℃延伸30秒②至④循环35次⑤72℃总延伸10分钟2.5琼脂糖凝胶电泳配制浓度为1.2%的琼脂糖凝胶，将PCR产物和DNAMarker分别加入到相应的胶孔，160V电压下电泳40分钟后使用凝胶成像仪观察电泳结果并拍照记录。2.6PCR反应条件的优化2.6.1退火温度的优化按上述总体积为25μl的PCR反应体系加样，改变退火温度，使PCR反应的退火温度从48℃至60℃按2℃的梯度递增进行PCR反应，凝胶电泳后用凝胶成像系统观察结果并挑选出最优的条带以确定最佳退火温度。2.7H片段的胶回收使用Omega胶回收试剂盒进行H片段PCR产物的回收①按50μl体系进行PCR反应。②在培清JS-680D凝胶成像仪的UV2灯下将含有目的条带的胶切下，装入已知重量的1.5ml离心管，称重并计算胶块重量。③加入质量体积比为1比1的BufferGM溶液（黄色）。④52℃水浴10分钟使胶块完全溶解。⑤将凝胶溶液转移至CP3吸附柱，10000×g离心1分钟，弃滤液。⑥向吸附柱中加入300μlBufferGM溶液，10000×g离心1分钟，弃滤液。⑦向吸附柱中加入700μlBufferWB溶液，10000×g离心1分钟，弃滤液。⑧重复步骤⑦。⑨13000×g离心2分钟。15 第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用⑩向吸附柱中加入30μl去离子水溶解DNA，13000×g离心2分钟，收集滤液，储存于-20℃。2.8H片段回收产物的鉴定1.使用Nanodrop2000对回收的H片段进行浓度和纯度的检测2.取4μl回收纯化的H片段进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。2.9H片段的T-A克隆2.9.1H片段与pMD18-T载体连接使用TAKARA的pMD-18T连接试剂盒进行H片段的连接。连接体系如下H片段体积4.5μlSolutionⅠ5μlpMD18-TVector0.5μl总体积10μl将混合液置于4℃连接过夜2.9.2连接产物的转化①取25μlTop10感受态细胞（北京TIANGEN）于高压灭菌的1.5ml离心管，向感受态细胞液中加入5μl连接产物。②用移液枪头轻轻搅拌混匀，置于冰水中水浴30分钟。③取出离心管置于42℃水浴90秒。④快速取出离心管并置于冰水中水浴5分钟。⑤向离心管中加入1ml经高压灭菌的LB培养液，37℃振荡培养2小时。2.9.3重组菌的扩大培养①取1ml振荡培养后的重组菌液，5000×g离心5分钟。②弃800μl上清，用枪头吹打重悬菌体沉淀。③吸取100μl菌液于含氨苄青霉素的LB固体培养基，用涂布棒将菌液均匀涂布于培养基表面。④37℃恒温培养20小时至培养基上出现形态颜色均一的菌落。16 第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用2.9.4重组菌液的鉴定①从培养基上的菌落中随机挑取5个菌落分别置于含氨苄青霉素的LB培养液中。②37℃振荡培养5小时至LB培养液浑浊。③以菌液为模板，PAstV-H-F、PAstV-R为上下游引物进行PCR扩增。2.11H片段的测序重组菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，测序用引物为M13引物。测序结果使用NCBI网站进行核酸BLAST，放置结果部分2.12PCR扩增效率检测2.12.1质粒提取重组菌液经PCR鉴定后转入含Amp的LB培养液扩大培养，使用质粒小提取试剂盒（北京TIANGEN）提取H片段重组菌液质粒。步骤如下：①向吸附柱CP4中加入500μl平衡液BL，13,400×g离心1min，弃滤液。②取5至10ml过夜培养的菌液加入离心管，13,400×g离心1min，弃上清。③向菌体沉淀中加入500μl溶液P1，吹打斡旋重悬混匀。④加入700μl溶液P3，温和上下翻转6-8次混匀，13,400×g离心10min。⑤将上一步的上清液加入吸附柱CP4中，13,400×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入管中。⑥加入600μl漂洗液PW，13,400×g离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。⑦重复上一步操作。⑧将吸附柱放入收集管，13,400×g空离2min以去除残余的漂洗液。⑨将吸附柱置于经高压灭菌的离心管，向吸附柱滤膜中央加入100至200μl去离子水，室温溶解5min，13,400×g离心2min洗脱质粒。⑩质粒溶液保存于-20℃冰箱。2.12.2标准品的建立使用Nanodrop2000测得质粒溶液浓度为21ng/μl。通过相对分子质量换算可得H12片段的拷贝浓度为1.4×10copies/μl。12将质粒溶液用去离子水按1：1.4稀释使其拷贝浓度为1×10copies/μl，并将此溶液作为标准品，分装储存于-20℃。17 第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用2.12.3敏感性检测将标准品按1:10倍比梯度稀释，分别作为DNA模板进行PCR反应，产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统记录结果。2.13RT-PCR检测方法的应用自2013年2月至2014年1月，本试验采集了江西地区商业猪场共219份猪粪便和小肠样品，经过处理和RNA提取，使用本试验建立的RT-PCR方法进行检测。3.试验结果3.1重组菌液的PCR结果图2-1H片段重组菌液PCR结果Fig2-1ResultsoftheHgenecolonyPCR重组菌液PCR条带大小与H片段预期大小一致，表明T-A克隆成功。3.2H片段测序结果H片段序列如下：5’-GACATTTTGTGGATTTACAGTTGGCCCAGATAGGCTACCTTACCCCACTGATGAAGAGAAACTCTATGCTGGACTTGTAACACCTGCAAGAAAACTTCCTGATGTCACAGCGCTGCATGGGAAACTCCTGAGCCTACAGCTTCTGATGCATAATCATCCTGACAGTGCCTTTAAAGATTACATCAACAAATGTTTGGCTGAAACAGCGAGGCACGCTGAGGATCTGCCTGCAAGACTCACAGAAAGGCAGATGGACAGGCTTTGGAGGGGAGGACCAA-3’18 第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用3.3退火温度优化结果Lane1Mt=46℃Lane2Mt=48℃Lane3Mt=50℃Lane4Mt=52℃Lane5Mt=54℃Lane6Mt=56℃Lane7Mt=58℃Lane8Mt=60℃。图2-2PCR退火温度优化Fig2-2MelttemperatureoptimizationofPCR退火温度优化结果表明PCR反应的最优退火温度为54℃。3.4敏感性检测结果987Lane11×10copies/µlLane21×10copies/µlLane31×10copies/µl654Lane41×10copies/µlLane51×10copies/µlLane61×10copies/µl321Lane71×10copies/µlLane81×10copies/µlLane91×10copies/µl图2-3PCR敏感性测试Fig2-3DetectionlimitofPCR由图2-2可知，本试验建立的RT-PCR方法最低可检测到的最低模板拷贝浓度为31×10copies/µl，敏感性可以满足临床检测的需要。19 第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用3.5江西各地区商业猪群中猪星状病毒感染率检测结果在对219份样品的RT-PCR检测中，本试验共检出猪星状病毒阳性样品77份，猪星状病毒阳性率为35.2%；其中粪便样品共161份，PAstV阳性47份，阳性率为29.2%；肠组织样品58份，PAstV阳性30份，阳性率为51.7%。检测结果如图2-4、图2-5、图2-6所示。图2-4各月份的星状病毒感染率检测结果图2-5PEDV与PAstV共同感染情况Fig2-4PAstVmonoinfectionrateofeachmonthFig2-5PAstV/PEDVcoinfectionrate图2-6各类样品中星状病毒阳性率Fig2-6InfectiousrateofPAstVindifferentsamples从样品采集时间上看，江西地区猪群全年都存在星状病毒感染，各月份的感染率分别为1月66.7%（10/15）、2月40%（4/10）、3月18.7%（14/75）、4月36%（9/25）、5月33.3%（9/27）、7月50%（9/18）、11月50%（6/12）、12月43.2%（16/37），其中冬春季节的11月至2月份为星状病毒感染率最高的时期，而冬春季节一般也是仔猪腹泻发病率最高的时期，到3月之后感染率有所降低。各季节普遍存在感染，尤其是健康猪群中存在很高的星状病感染率，表明猪星状病毒一般呈隐性感染。本试验对所采集的58份肠组织样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测（使用2013年曾珑建立的PEDV单重检测方法）得到PEDV阳性率为84.5%(49/58)，其中有26份肠组织样品存在PEDV和PAstV共同感染，其共同感染率为44.8%（26/58）。健康猪粪便中星状病毒阳性率为46.9%（23/49）高于腹泻猪粪便的21.4%（24/112）。猪腹泻粪便中的PEDV阳性率为75.9%(85/112),全部腹泻样品（粪便和肠组织）中星状病毒阳性率为31.8%20 第二章猪星状病毒RT-PCR检测方法的建立和应用（54/170）,PEDV阳性率为78.8%（134/170）。4.讨论PCR（聚合酶链式反应）于1985年由KaryMullis发明，至今已经30年历史。PCR技术日趋成熟，现在已经成为分子生物学中的一项重要技术，由于其具有高特异性、敏感性和快速简便的操作流程，使其在病原检测中的应用也越来越广。由PCR技术演变而来的RT-PCR技术、巢式PCR技术、荧光定量PCR技术、递减PCR技术、多重PCR技术等种类繁多的PCR技术，可以满足各种不同的片段扩增需求。RT-PCR即反转录PCR，当检测模板为RNA的时候，我们需要在进行PCR反应之前先进行一次反转录（reversetranscription）将RNA反转录为cDNA（complementaryDNA）。反转录反应成功的重要因素之一是模板RNA的质量，确保RNA完整、高浓度时，[90]RT-PCR反应的效率和产量将提高。PCR反应成功的重要因素之一是引物设计，一对特异、GC含量适中（为40%至60%）、不容易形成二聚体和发夹结构的引物可以使PCR反应更特异和灵敏。而较高的退火温度可以减少引物与模板链的非特异性结合，但如果退火温度过高则可能降低特异性结合使得PCR反应的效率降低。本试验成功建立了一种针对PAstV的快速、特异的RT-PCR检测方法，并将其应用于江西地区商业猪场的星状病毒感染检测，由检测结果可知猪星状病毒在商业猪场猪群中的感染率高达35.2%，在1月、2月、3月、4月、5月、7月、11月和12月时PAstV的感染率分别为66.7%、40%、18.7%、36%、33.3%、50%、43.2%,可知各商业猪群中PAstV感染率在冬春季节较高超过50%，3月以后逐渐降低。由于健康猪群的感染率高于腹泻猪群，推测猪星状病毒单独感染时较少引起仔猪腹泻症状，仔猪容易耐过感染。肠组织中的PEDV单独感染率和粪便样品基本相同，而肠组织中的PEDV和PAstV共同感染率则远远高于粪便样品，可知当猪群同时感染PEDV和PAstV时，腹泻的程度高于PEDV单独感染，预防和控制猪星状病毒的感染对降低猪场腹泻死亡率有重要意义。由于样品数量有限，揭示星状病毒感染和PEDV感染之间的相关性以及PAstV与PEDV之间致病的协同作用机理，还需要做进一步更深入的研究。21 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序1.试验材料和仪器设备1.1样品采集分别于2014年3月在江西樟树采集了一批腹泻仔猪粪便样品，于2014年9月在江西吉安采集了一批正常仔猪的粪便样品。样品置于经高压灭菌的10毫升离心管，-20℃保存。1.2试剂胶回收纯化试剂盒购自Omega公司RNAisoPlus购自大连宝生物公司RibonucleaseInhibitor购自大连宝生物公司M-MLV反转录酶购自大连宝生物公司dNTPs购自大连宝生物公司5×M-MLVRTBuffer购自大连宝生物公司10×PCRBuffer购自大连宝生物公司rTaqDNA聚合酶购自大连宝生物公司DNAMarker购自大连宝生物公司琼脂糖购自BioWest公司Top10感受态细胞购自北京天根生物公司pMD18-T连接试剂盒购自大连宝生物公司SMARTerRACE试剂盒Clontech1.3仪器和设备ABI9700PCR仪美国ABIThermoSORVALLLEGENDMICRO21R赛默飞世ThermoSORVALLST16R赛默飞世隔水式恒温培养箱上海市跃进医疗器械厂恒温振荡器超低温冰箱DW-86L388海尔三恒多用电泳仪北京六一仪器厂Nanodrop2000赛默飞世单人单面操作台苏州智净22 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序1.4溶液和培养基的配制1）100mg/ml氨苄青霉素（Amp）贮液：1g氨苄青霉素溶于8ml蒸馏水中，补加蒸馏水至10ml，0.22μm滤器滤过除菌，-20℃保存备用。2）LB液体培养基：胰蛋白胨l0g、酵母提取物5g、NaCl10g，加入蒸馏水950ml加热溶解，用1MNaOH溶液调pH至7.4，定容至1000ml，121℃高压灭菌20min。3）LB固体培养基：琼脂粉1.8g加热溶于100mlLB液体培养基中，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃左右，倾注平板。4）50×TAE贮存液：57.1ml冰乙酸，242gTris碱，100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），蒸馏水定容至1000ml，室温保存备用。5）10mg/mlEB贮存液：以10mg/ml浓度将EB溶于蒸馏水中，室温避光保存备用。6）1×TAE电泳缓冲液：取20ml50×TAE贮存液至容量瓶中用蒸馏水定容至1000ml，室温保存备用。7）1.2％琼脂糖凝胶：称取2.4g琼脂糖溶于200ml1×TAE中，加热溶化后加入EB贮存液至EB终浓度为0.5µg/ml。8）PBS（PH=7.4）溶液：称取11.65gNa2HPO4，1.65gKH2PO4，9gNaCl溶于1000ml去离子水，溶解后用0.1M氢氧化钠或盐酸调PH值到7.4。2.试验方法和步骤半巢式PCR技术由PCR技术拓展而来，其原理是根据模板序列设计3条特异性引物P1、P2、P3，其中P1和P2为上游引物，P3为下游引物，P1位于P2的上游。目的基因由P2和P3扩增得到。进行PCR反应时先由P1和P3进行第一轮扩增得到一条包含目的基因的长片段，然后以稀释的第一轮扩增产物为模板，由P2和P3进行第二轮扩增。此方法由于多一条引物，降低了引物和模板错配的几率，又因为其进行两轮扩增，使得PCR的产量得到提升。半巢式PCR技术比普通PCR在扩增效率和扩增特异性上具有更大的优势。本试验使用普通PCR与半巢式PCR相结合的方法对两株PAstV全基因的各片段进行扩增，并使用3’RACE和5’RACE法对两株PAstV基因组的末端进行扩增。2.1引物设计使用MEGA5.2软件对GenBanK上公布的12条PAstV全基因序列进行multialignment比对，根据比对结果，在相对保守的区域设计5对引物用来扩增PAstV全基因的中间部分片段,引物设计如图3-1，引物信息见表3-1、表3-2、表3-3。23 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序图3-1全长扩增引物设计示意图Fig3-1Strategyfordesigningtheprimersforcompletegenomeamplification表3-1全长扩增引物信息表Table3-1PrimerinformationofcompletegenomeofPAstVamplificationNameSequence(5'-3')PositionProductsizeOverlapPAstv4-1-FCCAAGGTTGATTTAGCTGTC44-631195PAstv4-1-RCCAGTTGGATCCCTTATCTC1219-1238PAstV4-2-FCAGCAGCACTCATTTCCCTG965-9841282273PAstV4-2-RATCGTCTTCAGGGTCACTCC2228-2247PAstv4-3-FGAAGGGTAAGACCAAGCATGGC2045-20661034130PAstv4-3-RATTGCTGAAAAGGCAGACACATAGG3055-3079PAstv4-4-FGTCATCCATATCTCAGCCACAGAG2924-29471025155PAstv4-4-RATCAGGAGTTGTAGGCTCAGGAG3927-3949PAstv4-5-FAGGGATTATGACACCATCGTC3657-36771755292PAstv4-5-RTGGCCAAGAGTATGGATTTCA5349-5369表3-23’RACE引物信息表Table3-2Primerinformationof3’RACE引物名称引物序列5’-3’引物位置GSP3-JXZSAGGGATTATGACACCATCGTC3657-3677GSP3-JXJAGGTAACGTAGGGTCTCCTCAG5300-5320Primer3RTGACCATCTAGCGACCTCCACTTTTTTTTPolyAPrimerKGTGGAGGTCGCTAGATGGTC24 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序表3-35’RACE引物信息表Table3-3Primerinformationof5’RACE引物名称引物序列5’-3’引物位置GSP-5GATTACGCCAAGCTTGTGTGTGGGGTTTGG873-898ATTGGGGCCANGSP-5GATTACGCCAAGCTTGGTCGGTGCCCTGGC74-97AAGCACCTC2.2样品RNA的提取2.2.1样品的处理①称取0.2g粪便样品置于经高压灭菌的1.5ml离心管。②加入1ml经高压灭菌的1×PBS溶液。③斡旋5分钟制成粪便悬浊液。④8000×g离心5分钟。⑤取上清液置于经高压灭菌的1.5ml离心管，-20℃保存。2.2.2病毒RNA的提取使用TAKARAviralRNA/DNAextractionkit5.0对处理过的样品进行RNA提取。操作步骤如下：取200μl上清液，加入200μl的BufferVGB、20μl的蛋白酶K和μl的CarrierRNA，充分混匀于56℃水浴10分钟。加入200μl乙醇，充分吹打混匀。将吸附柱置于收集管，溶液移至吸附柱中，12,000×g离心2分钟，弃滤液。将500μl的BufferRWA加入吸附柱，12,000×g离心1分钟，弃滤液。加入700μl的BufferRWB，12,000×g离心1分钟，弃滤液。重复上一步操作。12,000×g空甩2分钟。将吸附柱置于新的无RNA酶收集管，在吸附柱的滤膜中央加入30至50μl无RNA酶水，室温静置5分钟溶解RNA。12,000×g离心2分钟洗脱RNA。提取的RNA经Nanodrop2000检测浓度和质量后置于-80℃冰箱保存。2.3两株病毒基因组各片段的扩增2.3.1JXJA-1、JXJA-2、JXJA-3、JXJA-4、JXJA-5的反转录以JXJA的RNA为模板，分别以PAstV-1R、PAstV-3R、PAstV-5R为下游引物进行25 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序反转录合成cDNA-1、cDNA-3、cDNA-5。反转录体系如下：5×M-MLVRTBuffer4μldNTP2μl下游引物1μlRRI0.5μlM-MLVRT0.5μlRNA2μlRNasefreeH2O10μlTotal20μl反转录条件如下42℃50分钟，95℃5分钟，4℃5分钟。产物cDNA储存于-20℃。2.3.2JXZS-1、JXZS-2、JXZS-3、JXZS-4的反转录以JXZS的RNA为模板，分别以PAstV-3R、PAstV-5R为下游引物进行反转录合成cDNA-13、cDNA-15。反转录体系和条件同上，产物cDNA储存于-20℃。2.3.3JXJA-1、JXJA-2、JXJA-3、JXJA-4、JXJA-5的PCR扩增JXJA-1的PCR扩增，以cDNA-1为模板PAstV-1F为上游引物，PAstV-1R为下游引物进行PCR反应，反应体系如下10×PCRbuffer2.5μldNTP2μlPAstv4-1-F1μlPAstv4-1-R1μlrTaq0.25μlcDNA-12.5μlddH2O15.75μlTOTAL25μl反应条件94℃预变性5分钟，（94℃变性1分钟，52℃退火45秒，72℃延伸2分钟）×35个循环，72℃总延伸10分钟。JXJA-2的PCR扩增，以cDNA-3为模板，PAstV-1F为上游引物,PAstV-3R为下游引物进行半巢式PCR第一轮扩增反应体系如下：26 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序TOTAL25μl10×LABuffer2.5μldNTP4μlPAstV-1F1μlPAstV-3R1μlLATaq0.5μlcDNA-32.5μlddH2O13.5μl反应条件①94℃预变性5分钟②94℃变性1分30秒③54℃退火45秒④72℃延伸4分钟②至④循环25次⑤72℃总延伸10分钟第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，PAstV-2F和PAstV-2R为上下游引物，反应体系同JXJA-1,反应条件除退火温度为54℃外同JXJA-1。JXJA-3的扩增，以cDNA-3为模板，PAstV-3F为上游引物，PAstV-3R为下游引物做PCR。反应体系和反应条件同JXJA-1。JXJA-4的扩增，第一轮扩增以cDNA-5为模板，PAstV-4F为上游引物，PAstV-5R为下游引物进行PCR反应，反应体系和反应条件同JXJA-2第一轮。第二轮扩增以第一轮产物为模板，PAstV-4F和PAstV-4R分别为上下游引物做PCR，反应体系和反应条件同JXJA-2的第二轮PCR扩增。JXJA-5的PCR扩增，第一轮扩增同JXJA-4，第二轮扩增以第一轮产物为模板，PAstV-5F和PAstV-5R为上下游引物做PCR，反应体系和反应条件同JXJA-2。2.3.4JXZS-1、JXZS-2、JXZS-3、JXZS-4的PCR扩增第一轮扩增，分别以cDNA-13为模板，PAstV-1F和PAstV-3R为上下游引物。cDNA-15为模板，PAstV-4F和PAstV-5R为上下游引物做LAPCR扩增。反应体系如下10×LABuffer2.5μldNTP4μlPAstV-4F1μlPAstV-5R1μlLATaq0.5μlcDNA2.5μlddH2O13.5μl27 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序TOTAL25μl反应条件：94℃5分钟，（94℃1分钟，52℃45秒，72℃4分钟）×35个循环，72℃10分钟总延伸。第二轮扩增，JXZS-1、JXZS-2、JXZS-3使用cDNA-13的第一轮扩增产物；JXZS-4使用cDNA-15的第一轮扩增产物。JXZS-1引物PAstV-1F、PAstV-1R，JXZS-2引物PAstV-2F、PAstV-2R，JXZS-3引物PAstV-3F、PAstV-3R,JXZS-4引物PAstV-4F、PAstV-4R。反应体系如下10×PCRBuffer2.5μldNTP1μl上游引物1μl下游引物1μlrTaq0.25μl第一轮扩增产物2.5μlddH2O16.75μlTOTAL25μl反应条件94℃预变性5分钟，（94℃变性1分钟，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟）×35个循环，72℃总延伸10分钟。2.4两株病毒基因组全长片段的克隆和测序2.4.1全长扩增片段的回收和纯化使用Promega胶回收试剂盒回收各预期大小片段条带，步骤参照说明书，同H片段的回收。回收完后使用NanoDrop2000检测DNA回收的浓度和质量。2.4.2回收产物与载体连接使用TAKARA的pMD18-T载体与各回收产物进行连接，连接体系如下胶回收的DNA片段5μlSolutionI4.5μlpMD18-TVector0.5μlTotal10μl连接条件：4℃12小时（或过夜）。2.4.3连接产物的转化将连接后的重组载体转化到Top10感受态细胞（北京TIANGEN）①取5μl重组载体加入25μl感受态细胞，冰水浴30分钟。28 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序②42℃热应激90秒。③迅速放至冰水中冷却5分钟。④加入1ml经高压灭菌的LB培养液，37℃，220r/min振荡培养2小时。2.4.4重组菌液的扩大培养①取振荡培养后的重组菌液，5000×g离心5分钟，弃800μl上清。②用枪头吹打重悬菌体沉淀，并使重悬菌液混匀。③吸取100μl重悬菌液于经高压灭菌的含Amp（氨苄青霉素）的LB固体培养基。④用涂布棒使菌液均匀涂布与培养基表面。⑤37℃恒温培养20小时至平板上长出形态颜色均一的菌落。⑥每一份重组菌液样品涂布一块平板防止交叉污染。2.4.5重组菌液的PCR鉴定①从每个平板中挑取5个单菌落，每个单菌落转入1ml经高压灭菌的含Amp的LB培养液中。②37℃，220r/min振荡培养5小时。③以菌液做模板，各片段使用其特异性引物进行菌液PCR鉴定。PCR体系如下10×PCRBuffer2.5μldNTP1μl上游引物1μl下游引物1μlrTaq0.25μl菌液2.5μlddH2O16.75μlTotal25μl反应条件：94℃预变性10分钟，（94℃变性1分钟，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟）×35个循环，72℃总延伸10分钟。2.4.6测序经PCR鉴定过的菌液送往上海生工生物工程有限公司委托测序，超过1000bp的DNA片段均采用双向测序，测序结果使用DNASTAR软件中的SeqMan子软件进行编辑和拼接处理。成功得到JXJA-1、JXJA-2、JXJA-3、JXJA-4、JXJA-5、JXZS-1、JXZS-2、JXZS-3、JXZS-4片段的DNA序列。分别使用NCBI网站的BLAST软件对各片段进行核酸BLAST，结果显示各片段均为猪星状病毒片段。29 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序2.53’末端的扩增和测序由GENBANK登录的各星状病毒全长序列可知星状病毒的完整RNA具有polyA尾巴，可以使用oligodT进行第一条cDNA链的合成。2.5.1第一条cDNA链的合成以JXJA和JXZS的RNA为模板，Primer3RT为下游引物进行goscript反转录。取4μl模板RNA和1μl3RT引物于经高压灭菌的PCR管，用枪头轻轻吹打混匀，在PCR仪中70℃加热5分钟，冰水浴5分钟。goscript反转录体系：5×gocriptRTBuffer4μlMgCl2溶液3μldNTP1μlRRI0.5μlgocriptRT1μl无RNA酶水4.5μlDTT1μl引物模板液5μlTotal20μl反转录条件：25℃5分钟，42℃1小时，70℃5分钟，cDNA储存于-20℃。2.5.23’末端的PCR扩增以gocriptcDNA为模板，GSP3-F为上游引物，PrimerK为下游引物做PCR，扩增片段命名为3’end片段。JXJA3’末端扩增反应体系goscriptcDNA2.5μlGSP3-JXJA1μlPrimerK1μl10×PCRBuffer2.5μldNTPs2μlrTaq0.25μlddH2O15.75μlTotal25μlJXJA3’末端扩增反应条件94℃预变性5min，94℃变性45s，54℃退火30s，72℃延伸2min，反应35个循环后72℃总延伸10min。30 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序JXZS3’末端扩增反应体系goscriptcDNA2.5μlGSP3-JXZS1μlPrimerK1μl10×PCRBuffer2.5μldNTPs4μlrTaq0.25μlddH2O13.75μlTotal25μlJXZS3’末端反应条件94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火45s，72℃延伸4min，反应35个循环后72℃总延伸10min。2.5.33’RACE产物的胶回收将电泳条带切下，使用Promega胶回收试剂盒对JXJA和JXZS的3’RACE产物进行回收。使用Nanodrop2000测定产物纯度和浓度，并取5μl回收产物电泳确认回收成功，回收产物保存于-20℃。2.5.4回收产物与载体连接将回收产物与pMD18-T载体连接。由于JXZS的3’RACE产物超过3kb，故在连接体系中将载体体积增加至1μl，连接体系如下Total10μlpMD18-T载体1μl纯化后的DNA4μlSolutionI5μl2.5.6回收产物的克隆和转化将重组载体转入Top10感受态细胞中，先在LB培养液中振荡培养2小时，再将生长至对数期的菌液涂布于LB固体平板上37℃培养20小时，挑取单个菌落做菌液PCR鉴定。由于JXZS的3’end片段较大（＞3kb），连接效率较低，挑取的5个单菌落只有3个经PCR鉴定为阳性。2.5.73’end片段的测序将含3’end片段与pMD18-T载体的重组菌液送至上海生工生物工程有限公司进行测序。31 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序2.65’RACE本试验使用SMARTerRACE试剂盒（Clontech）对星状病毒JXJA株和JXZS株进行5’RACE扩增。2.6.1引物设计根据SMARTer5’RACE引物设计原则和测序成功的已知序列设计引物2.6.2病毒RNA准备使用TAKARA病毒DNA/RNA提取试剂盒对处理后的粪便样品进行RNA提取，步骤同3’RACE。用于RACE的病毒RNA要求较高的质量，包括纯度、盐离子浓度、完整性等。根据SMARTerRACE试剂盒说明书对提取的RNA进行纯化和质量评估，确保达到要求后冻存于-80℃冰箱。2.6.3第一条cDNA链的合成1.配置以下BufferMix体系，吹打混匀并简单离心后室温放置至步骤6使用。5×First-StrandBuffer4μlDTT(100mM)0.5μldNTPs(20mM)1μlTotal5.5μl2.分别在微型离心管中配置以下体系RNA5μl10×RandomPrimerMix1μlSterileH2O5μlTotal11μl3.轻吹并在微型离心机中简单离心混匀。4.离心管置于72℃孵育3分钟，再置于42℃冷却2分钟后14000×g离心10秒备用。5.向体系中加1μlSMARTerIIAOligonucleotide至使总体积为12μl。6.按以下体系配置MasterMix，并于室温下混匀BufferMix5.5μlRNaseInhibitor(40U/μl)0.5μlSMARTScribeReverseTranscriptase(100U)2.0μlTotalVolume8.0μl7.将步骤6的MasterMix与步骤5的溶液混合，得到总体积为20μl的cDNA合成体系。8.轻轻吹打并于微型离心机简单离心混匀。9.置于PCR仪进行反转录，反应条件：42℃90分钟，70℃10分钟32 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序10.加入90μl的Tricine-EDTABuffer稀释cDNA产物。11.稀释后的cDNA冻存于-20℃。2.6.45’末端PCR扩增1.MasterMix溶液配制按以下体系配置MasterMix溶液PCR-GradeH2O15.5μl2×SeqAmpBuffer25.0μlSeqAmpDNAPolymerase1.0μlTotalVolume41.5μl2.根据以下体系配置第一轮PCR反应液5’-RACE-ReadycDNA2.5μl10×UPM5μlGSP-51μlMasterMix41.5μlTotalVolume50μl3.PCR反应条件如下：94℃预变性5min,（94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min）括号内循环30次,72℃总延伸10min。4.将第一轮PCR产物用高压灭菌的去离子水稀释1000倍。根据以下体系配置第二轮PCR反应液第一轮PCR产物（稀释）5μl10×LAPCRBuffer5μlLATaq1μlUPS2μldNTP4μlNGSP-52μlddH2O31μlTotal50μl5.反应条件如下：94℃预变性5min，（94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min）括号内循环25次，72℃总延伸10min。6.取6μlPCR产物用于琼脂糖凝胶电泳，电泳结果使用凝胶成像系统观察并记录。2.6.55’RACE产物的回收将含目的DNA条带的胶块切下，使用胶回收试剂盒（Promega公司）进行产物回33 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序收和纯化，操作步骤见H片段的回收。2.6.6RACE产物的无缝克隆（In-FusionClone）使用In-FusionCloning试剂盒对RACE产物进行克隆1.连接体系如下线性化的pRACE载体（试剂盒提供）1μl回收纯化的RACE产物7μlIn-FusionHDMasterMix2μlTotalVolume10μl2.50℃孵育15分钟后转移至冰上。3.取5μl连接产物加入50μlTop10感受态细胞（北京天根），轻弹混匀后冰浴30min，42℃热激90s，再迅速置于冰上5min将连接产物转化至感受态细胞。4.分别取10μl、5μl、1μl重组菌于不同的离心管，每管加SOC培养液稀释至100μl。5.将稀释后的重组菌液分别均匀涂布于终浓度为100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB平板。6.将剩余的重组菌液6000×g离心5min，弃上清并用100μlSOC培养液重悬菌体沉淀。7.将重悬后的重组菌液均匀涂布于含100μg/mlAmp的LB平板。8.将所有的LB平板置于37℃恒温箱培养过夜。9.挑取单个菌落于含100μg/mlAmp的LB培养液，220r/min振荡培养3小时。10.以培养后的菌液做模板进行菌液PCR鉴定菌液PCR体系扩大培养的菌液2.5μl10×UPM1μlGSP-51μldNTPs1μl10×PCRBuffer2.5μlrTaq0.25μlddH2O16.75μlTotal25μl将菌液PCR鉴定为阳性的菌液送至上海生工生物有限公司测序。34 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序3.试验结果3.1JXJA全长各片段扩增结果图3-2JXJA全长各片段扩增结果Fig3-2AmplificationresultsofeachfragmentofJXJAcompletegenome图3-3JXJA3’RACE图3-4JXJA5’RACEFig3-33’RACEresultofJXJAstrainFig3-45’RACEresultofJXJA3’RACE35 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序3.2JXZS全长各扩增片段电泳结果图3-5JXZS株各片段扩增结果Fig3-5AmplificatedresultsofeachfragmentofJXZSstrain图3-6JXZS3’RACE结果图3-7JXZS5’RACEFig3-63’RACEresultofJXZSFig3-75’RACEresultofJXZS3’RACE4.猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长序列分析将所有片段序列使用DNASTAR软件中的Seqman软件进行编辑和组装，得到星状病毒JXJA株和JXZS株的完整全长序列，序列见附录。其中JXJA株全长6675nt，36 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序5’UTR长度为40nt，ORF1a长度为2631nt，编码氨基酸长度为876aa；ORF1ab长度为4077nt，编码氨基酸长度为1358aa；ORF2长度为2475nt，编码氨基酸长度为824aa；3’末端PolyA尾长度为19nt。JXZS株全长6700nt，5’UTR长度为40nt，ORF1a长度为2631nt，编码氨基酸长度为876aa；ORF1ab长度为4077nt，编码氨基酸长1358aa；ORF2长度为2508nt，编码氨基酸长度为835aa；3’末端PolyA尾长度为18nt。两株星状病毒各ORF位置表3-1。表3-1JXJA株和JXZS株各ORF位置Table3-1PositionsofeachORFofJXJAstrainandJXZSstrain病毒株ORF1aORF1abORF2全长JXJA40-267040-41154108-65826675ntJXZS40-267040-41154108-66156700nt在这两株星状病毒的ORF1a和ORF1b的重叠区域存在高度保守序列AAAAAAC作为核糖体移码信号（图3-11），其下游为可能的茎环结构，该保守序列在这两株病毒基因组的位置都为2540-2546。两株病毒的ORF1b和ORF2都存在7个碱基的重叠，并且在ORF1b末端都存在高度保守序列TTTGGAGGGGCGGACCAAAGCANAAGCCTAATG此序列在两测序株基因组的位置都为4017-4049，其中ATG为ORF2的起始密码子，两保守序列的位置关系见图3-10。4.1JXJA株和JXZS株同源性及差异分析使用Mega6.0和DNASTAR软件对这两株星状病毒的全长序列、ORF1a序列、ORF2序列分别进行同源性分析。分析结果表明猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长核苷酸同源性为82.2%，氨基酸同源性为66.3%；ORF1a核苷酸的同源性为97.6%，氨基酸同源性为94.9%；ORF1ab核苷酸同源性为94.1%，氨基酸同源性为91.9%；ORF2核苷酸同源性为62.6%,氨基酸同源性为49.9%。两株测序株的ORF1ab基因编码的非结构蛋白的氨基酸中不存在缺失和插入。而在ORF2编码的衣壳蛋白上JXJA株比JXZS株少11个氨基酸，其具体缺失和插入见图3-11。由结果可知，相比JXZS株来说，JXJA株分别在295-298aa、413aa、420-421aa、444aa、454-455aa、468aa、586aa、597aa、678-680aa、685-687aa的位置处存在共18个氨基酸缺失，在500aa、543aa、550aa、551aa、555aa、556aa、607aa的位置处存在共7个氨基酸的插入。37 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序图3-8星状病毒测序株的保守序列示意图Fig3-8ConsevativeregionsoftheJXJAandJXZSPAstVstrains图3-9测序株（黑框标记）和其它30株星状病毒核糖体移码信号保守序列（黄色部分）Fig3-9ConservativeregionsofJXJAandJXZSPAstVstrainsand30otherastroviruses38 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序图3-10测序株（黑框标记）和其它30株星状病毒ORF1b保守序列（黄色部分）以及ORF2起始密码子（红框标记）Fig3-10conservativeregionsofORF1boftheJXJAandJXZSPAstVstrains（inblackbox）and30otherastrovirusstrainsandthestarterofORF2(inredbox)图3-11JXJA株和JXZS株ORF2基因编码的氨基酸差异Fig3-11ThedifferencesofORF2aminoacidsequencesbetweentheJXJAstrainandtheJXZSstrain39 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序4.2测序株与参考株同源性分析4.2.1测序株与参考株全基因组同源性从GenBank上下载30株其他星状病毒全基因序列与本试验的测序株用ClustalW1.8方法进行核苷酸和氨基酸的比对，同源性结果见图3-13。结果显示，JXZS株和JXJA株的核苷酸序列与PAstV4USA/35株同源性最高分别为78%和80.4%，和另一株PAstV4US-IL135株同源性较高分别为76.3%和78.6%，与鸭星状病毒1型WF1201株同源性最低仅为27.4%和27.1%。氨基酸序列同源性最高的也是PAstV4USA/35株，分别为71.7%和75.4%。JXZS株和JXJA株与其它几株猪星状病毒的同源性普遍很低，核苷酸为45.1%至53.2%，氨基酸为29.8%至31.2%。值得一提的是，JXZS株和JXJA株与人星状病毒株的核苷酸同源性为43.1%至46%，氨基酸同源性为31.4%至32.8%。除此之外，两株测序株与鼠星状病毒核苷酸同源性为58%至58.2%，氨基酸同源性为40.8%至40.9%。另外两株4型猪星状病毒和鼠星状病毒的同源性，核苷酸分别为57.5%和57.1%，氨基酸分别为40.8%和40.5%。使用同样的方法将JXJA株和JXZS株与NCBI上登陆的全部11株猪星状病毒做BLAST比对并分析其同源性，氨基酸和核苷酸同源性见表3-2。从比对结果可知在目前登陆全部的猪星状病毒全长序列中，不同血清型的猪星状病毒之间同源性很低，核苷酸同源性普遍在50%以下，氨基酸同源性普遍在30%以下。而相同血清型的猪星状病毒间基因组的同源性较高，最高的为两株5型猪星状病毒，其核苷酸同源性达到96.7%，氨基酸同源性达到94.2%。而本试验的测序株JXZS株和JXJA株与两株美国4型猪星状病毒和一株比利时野猪星状病毒同源性较高，核苷酸同源性为75.8%至82.2%，氨基酸同源性为61.2%至70.4%。两株测序株分别与PAstV435/USA株同源性最高，JXJA株核苷酸同源性为82.2%，氨基酸同源性为70.4%；JXZS株核苷酸同源性为78.5%，氨基酸为66.6%。上海株虽然为猪星状病毒2型，但其与2型星状病毒美国株的同源性较低，而与Mamastrovirus3广西株的同源性较高。40 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序41 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序表3-2测序株与11株猪星状病毒参考株全长核苷酸和氨基酸同源性表，上部分为核苷酸，下部分为氨基酸Fig3-2Theidentityofcompletegenomebetweensequencedsrtrainsand11PAstVreferencedstrains,niucleotideinuppertriangle,aminoacidinlowertriangle123456789101112131PAstV3USMO12342.442.341.341.841.341.141.642.94241.442.640.42MamAstV3GX12383.445.745.444.84345.744.144.542.745.243.83PAstV2Shanghai23.272.345.645.444.742.545.444.344.942.645.343.94PAstV435/USA22.924.124.882.278.542.788.849.850.842.750.274.65JXJA23.124.225.170.483.54380.150.250.543.250.5766JXZS22.723.323.966.672.542.776.749.750.342.850.275.87PAstV5USIA12223.520.82122.323.422.44343.242.696.743.941.68PAstV4USIL13522.9242581.867.363.822.649.850.642.750.277.79PAstV2USIA12225.623.624.33132.731.924.230.480.643.287.148.110PAstV251/USA24.42424.331.831.631.423.730.968.442.689.348.711PAstV53323.420.420.922.523.722.594.222.424.323.643.841.612PAstV24325.324.724.63131.931.124.930.47882.225.148.413WBAstV/HUN21.121.822.460.861.261.821.565.430.430.321.330.54.3测序株与参考株进化树分析4.3.1全长进化树分析从GenBank上下载30株哺乳动物和禽星状病毒全长序列，使用Mega6.0对这30条序列和JXJA株、JXZS株全长序列进行multialignment比对，将比对结果按Neighbor–joining方法做遗传进化树分析。遗传进化树结果显示，本试验的两株测序株星状病毒在遗传距离上与猪星状病毒4型美国株35/USA和美国株IL135最近，最有可能属于猪星状病毒4型。从进化树上还可以看出猪星状病毒2型、Mamastrovirus3广西株和PAstV2上海株与人星状病毒遗传距离较近，表明这几株猪星状病毒和人星状病毒之间发生基因重组的可能性较大。而本试验的测序株与人星状病毒的遗传距离较远，重组可能性较低。禽星状病毒与哺乳动物星状病毒在进化树的两个分支上，差异明显。鼠星状病毒与JXJA株和JXZS株以及其他两株猪星状病毒4型的亲缘性较近，表明其可能与PAstV4之间存在基因重组。牛星状病毒与牦牛星状病毒与猪星状病毒2型遗传距离较近，表明牛星状病毒与PAstV2之间有重组可能；羊星状病毒和兔星状病毒与猪星状病毒3型在同一个分支，它们之间重组可能性较高。42 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序100Rus-Nsc05-623HAstV4KF039912100Rus-Nsc10-N358HAstV4KF03991337DresdenHAstV4AY72089168Rus-Nsc05-430HAstV2KF039910lhar/2011/korHAstV1JN88782074ATVPOLY6AHAstV1L23513100100Hu/Nyergesujfalu/HUN4520/2010/HUNHAstV1HQ398856100DL030HAstV5JQ403108Rus-Nsc06-1029HAstV2KF03991110039192-BJ07-CHNHAstV6GQ495608100KatanoHAstV6HM2373631637FelineAstV2NC022249PAstV-GX1PAstV3NC025379100100Shanghai/2008PAstV2GQ91477357100US-MO123PAstV3NC01949492SheepastrovirusY15937RabbitAstVTN/2208/2010NC025346100JXZS100JXJA3335/USAPAstV4NC023675100100AstV4-US-IL135PAstV4JX556692MurineastrovirusNC018702100100BAstV-GX7/CHN/2014NC024297YakAstVS8KM822593100AstV2-US-IA122type2JX55669043/USAPAstV2NC02367410010051/USAPAstV2JF713712AstV5-US-IA122type5NC02363610033/USAPAstV5JF713711TurkeyastrovirusNC002470DuckAstV1WF1201JF832365100100ChickenAstV4175JF8323650.1□标记的为人星状病毒，△标记的为猪星状病毒，◇标记的为鼠星状病毒，▽标记的为猫星状病毒图3-12猪星状病毒JXJA株和JXZS株（“●”标记）和其它30株星状病毒全长序列进化树Fig3-12PhylogenetictreebasedonthecompletegenomeofPAstVstrainJXJAandJXZSand30referencedastroviruses使用同样的方法，将JXJA与JXZS与猪星状病毒各血清型全长序列进行比对，并建立进化树。进化树显示，各型猪星状病毒差异较大，主要分为两个大群，一个是PAstV3US-MO123株单独为一分支，测序株和其他参考株为另一分支。相对于美国的两株4型猪星状病毒和另一株匈牙利野猪星状病毒，JXJA株和JXZS株遗传距离更近，亲缘性更高，而同为国内的猪星状病毒2型上海株和广西株处于另一分支，由于病毒血清型不同，这两株全长序列与本试验的测序株差异较大。此外，上海株和广西株之间遗传距离很近，这两株猪星状病毒与其他的2型和3型猪星状病毒处于不同分支，相43 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序对美国的2型星状病毒存在一定的变异。100NC_023675_PAstV_4_strain_35/USA43JX556692_PAstV_4_AstV4-US-IL135JXJA100100JXZS100NC_016896WBAstV-1/2011/HUNJX556690_PAstV_2_AstV2-US-IA12258100JF713712_PAstV_2_51/USA100JF713710_PAstV_2_43NC_025379_MamAstV_3_PAstV-GX1100GQ914773_PAstV_2_Shanghai/2008NC_023636_PAstV_5_AstV5-US-IA122100JF713711_PAstV_5_33NC_019494PAstV_3_US-MO1230.1图3-14测序株（“●”标记）与11株猪星状病毒全基因组进化树Fig3-14Phylogenetictreebasedonthecompletegenomeofsequencedstrains(labeledwith“●”)and11referencedPAstVstrains4.3.2ORF1ab和ORF2进化树分析使用MEGA6.0对猪星状病毒JXJA株和JXZS株的ORF1ab和ORF2序列分别和11株猪星状病毒参考株进行比对并建立进化树。从ORF1ab进化树可知，JXJA株和JXZS株基于ORF1a的高同源性，遗传距离相当近。不同于全长进化树的是，PAstV4US-IL135株原本和PAstV435/USA株是处于同一分支的，在ORF1ab的进化树中，其与WBAstV匈牙利株距离最近。而PAstV3US-MO123株在全基因上单独分支，在ORF1ab基因上与其他其他几株PAstV2相距较近。上海株和广西株仍然靠近并与其他2型和3型株相距较远。由于星状病毒ORF2基因编码的是衣壳蛋白，并且其变异性相对较高，所以相比全基因和ORF1ab基因，ORF2基因在分型上更具有参考价值。ORF2基因进化树结果显示，JXJA株和两株PAstV4美国株的遗传距离较近，而JXZS株和这几株4型猪星状病毒差异较大但与野猪星状病毒匈牙利株距离较近。由此可推测JXZS株与野猪星状病毒之间亲缘较近，可能来自同一株病毒祖先。猪星状病毒广西株和上海株依然处在一个进化分支并且遗传距离较近，其它几株星状病毒的ORF2基因进化树与其全基因进化树结构相似。44 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序PAstV243/USAJF713710100100PAstV251/USAJF713712100PAstV2AstV2-US-IA122JX55669062PAstV3US-MO123NC_019494PAstV2Shanghai/2008GQ914773100MamAstV3PAstV-GX1NC_025379PAstV4AstV4-US-IL135JX556692100WBAstV-1/2011/HUNNC_016896100PAstV435/USAJF713713JXJA9599JXZSPAstV533/USAJF713711100PAstV5AstV5-US-IA122NC_0236360.05图3-15测序株（“●”标记）与11株猪星状病毒参考株ORF1ab基因进化树Fig3-15PhylogenetictreebasedontheORF1abgeneofsequencedstrains(labeledwith“●”)and11otherPAstVstrainsUS-IL135type4JX55669210010035/USAtype4NC_023675100JXJAWBAstV-1/2011/HUNNC_01689610061JXZS51/USAtype2JF713712US-IA122type2JX55669010010043/USAtype2NC_023674PAstV-GX1type3100PAstV2Shanghai/2008GQ914773US-MO123type3NC_019494US-IA122type5NC_0236367110033/USAtype5JF7137110.1图3-16测序株（“●”标记）与11株猪星状病毒参考株ORF2基因进化树Fig3-16PhylogenetictreebasedontheORF2geneofsequencedstrains(labeledwith“●”)and11otherPAstVstrains45 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序4.4衣壳蛋白（ORF2）分析星状病毒的ORF2基因表达病毒衣壳蛋白，作为结构蛋白，衣壳蛋白具有病毒重要的抗原表位，而星状病毒的衣壳蛋白在不同种间甚至同种不同血清型之间差异很大，星状病毒之所以能感染多种动物，这与其抗原表位的变异性有很大关系，多变的抗原表位使得病毒不容易被宿主的免疫系统消灭。因此研究采用Protean软件对测序株JXJA株和JXZS株以及另外参考株PAstV4US/35株的ORF2基因进行预测蛋白分析，主要针对衣壳蛋白亲水性、表位可能性和抗原性进行比较。图3-17测序株与参考株ORF2蛋白亲水性分析Fig3-17HydrophilicanalysisofORF2proteinofsequencedstrainsandreferencedstrain由ORF2推导编码氨基酸的亲水性分析可知，测序株与参考株星状病毒在0-50aa、700-750aa位置处亲水性普遍较高。其中JXJA株在480aa附近与JXZS株和US/35株存在明显差异，而JXZS株在450aa附近与另两株存在明显差异。由这三株星状病毒ORF2氨基酸比对结果可知JXZS株在440-441aa的位置有一个谷氨酸和一个甘氨酸的插入，在439aa的位置由一个天冬氨酸突变为甘氨酸，这可能是导致其亲水性增加的原因。图3-18测序株与参考株ORF2蛋白表位可能性分析Fig3-18SurfaceprobabilityanalysisofORF2proteinofsequencedstrainsandreferencedstrain图3-19测序株与参考株ORF2蛋白抗原性分析Fig3-19AntigenicanalysisofORF2proteinofsequencedstrainsandreferencedstrain46 第三章猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长测序ORF2推导氨基酸序列的表位可能性分析显示，这三株星状病毒在0-50aa、700-750aa位置的表面可能性较高。其中JXZS株在450aa附近位置与其它两株相比具有较强的表位可能性，而JXJA株在550aa附近对比其他两株具有较强的表位性，在600aa附近两株测序株与参考株相比有较强的表位可能性。在700aa附近JXJA株的表位可能性较强，JXZS株则较弱。ORF2蛋白抗原性分析显示，JXZS株在150aa和450aa附近相比另两株猪星状病毒抗原性更强，JXJA株在300aa附近有较强抗原性，而JXJA株和JXZS株在600aa附近都比参考株抗原性更强。JXJA株和JXZS株相比PAstV4US/35株，推测衣壳蛋白的抗原表位产生了变化。5.小结与讨论本试验根据GenBank公布的猪星状病毒参考序列设计引物，结合RT-PCR、半巢式PCR和RACE、T-A克隆等技术，成功测出猪星状病毒JXJA株和JXZS株基因组全长序列，其中JXJA株全长6675nt，JXZS株全长6700nt。对得到的全长序列进行分析，发现JXJA株和JXZS株与星状病毒4型同源性较高，遗传距离相对较近，与其他型猪星状病毒株同源性很低。而对30株不同种星状病毒的同源性和进化树分析显示本试验测序株与人星状病毒遗传距离较远，与鼠星状病毒同源性最高，遗传距离最近，故推测4型猪星状病毒和鼠星状病毒之间可能存在重组，这可能是4型猪星状病毒在猪群中感染分布最广的一个原因。此外ORF2基因进化树显示JXZS株与JXJA株和另两株PAstV4处于不同分支，其变异较大可能为一株新型的猪星状病毒。JXJA株和JXZS株的ORF1ab位置相同，长度相同，不存在插入缺失现象，并且同源性高达94.1%，JXJA株在ORF2基因上与JXZS株相差很大，同源性只有62.6%，JXJA株相对JXZS株在ORF2的氨基酸序列存在18aa的缺失和7aa的插入。对于衣壳蛋白的分析表明JXZS株在450aa的位置存在氨基酸突变和插入导致亲水性增强，同时在此位置JXZS株的表位可能性和抗原性明显强于JXJA株和参考株PAstV4US/35株。此外两株测序株在600aa附近位置与参考株都存在表位性和抗原性的明显增强。与美国星状病毒4型相比，江西株的抗原表位可能产生了变化。星状病毒在猪群中虽然不是引起仔猪腹泻的主要原因，但是其在人群中造成的影[91]响很大，每年由于星状病毒感染导致腹泻的婴儿多达百万，对免疫缺陷者的研究表明星状病毒不仅在存在与胃肠组织，其还可以感染肝、肾和脾脏等组织。我们不能忽视星状病毒强大的变异能力和重组能力和其潜在的公共卫生学危险。本试验揭示了江西地区猪星状病毒的遗传和变异关系，由于目前对猪星状病毒的研究较少，本试验为猪星状病毒研究和发展提供了更多的参考依据，为更好的诊断和防控猪星状病毒提供了理论基础。47 全文总结全文总结1.本研究成功建立了一种快速高效的针对猪星状病毒的RT-PCR检测方法，并将此方法用于江西地区猪星状病毒的检测，对江西地区猪星状病毒的流行病学进行了初步调查，结果显示江西地区商业猪场的猪星状病毒在粪便中的检出率为29.2%，在肠组织中的检出率为51.7%。PAstV在健康猪和腹泻猪中都有感染，猪群中全年都存在星状病毒感染，在冬季的感染率较高。2.本研究成功扩增并克隆了两株江西地区采集的猪星状病毒JXJA株和JXZS株的基因组全长序列，对该序列进行了测序和序列分析。分析结果表明两株测序株的基因组与4型猪星状病毒亲缘性最高，与其他型的猪星状病毒差异较大。测序株与鼠星状病毒同源性较高，与人星状病毒同源性较低。JXZS株的ORF2基因和与各型猪星状病毒株相比差异较大，其可能为一株新型猪星状病毒。对两株测序株ORF2氨基酸推导蛋白结构的预测分析表明，JXJA株和JXZS株的ORF2基因推导的氨基酸在亲水性、表位可能性及抗原性上与猪星状病毒4型美国参考株有多处差异。48 参考文献参考文献[1]HoracekJ,KubesV,KaplaJ,etal.[Immunoelectronmicroscopicdetectionofvirusesinnewborninfantswithacutegastroenteritis][J].CeskEpidemiolMikrobiolImunol,1983,32(3):134-137.[2]AtkinsA,WellehanJJ,ChildressAL,etal.Characterizationofanoutbreakofastroviraldiarrheainagroupofcheetahs(Acinonyxjubatus)[J].VetMicrobiol,2009,136(1-2):160-165.[3]EnglundL,ChrielM,DietzHH,etal.Astrovirusepidemiologicallylinkedtopre-weaningdiarrhoeainmink[J].VetMicrobiol,2002,85(1):1-11.[4]GeyerA,SteeleAD,PeenzeI,etal.Astrovirus-likeparticles,adenovirusesandrotavirusesassociatedwithdiarrhoeainpiglets[J].JSAfrVetAssoc,1994,65(4):164-166.[5]WilliamsFJ.Astrovirus-like,coronavirus-like,andparvovirus-likeparticlesdetectedinthediarrhealstoolsofbeaglepups[J].ArchVirol,1980,66(3):215-226.[6]BridgerJC.Detectionbyelectronmicroscopyofcaliciviruses,astrovirusesandrotavirus-likeparticlesinthefaecesofpigletswithdiarrhoea[J].VetRec,1980,107(23):532-533.[7]TziporiS,MenziesJD,GrayEW.Detectionofastrovirusinthefaecesofreddeer[J].VetRec,1981,108(13):286.[8]HoshinoY,ZimmerJF,MoiseNS,etal.Detectionofastrovirusesinfecesofacatwithdiarrhea.Briefreport[J].ArchVirol,1981,70(4):373-376.[9]KjeldsbergE,HemA.Detectionofastrovirusesingutcontentsofnudeandnormalmice.Briefreport[J].ArchVirol,1985,84(1-2):135-140.[10]ZhuHC,ChuDK,LiuW,etal.DetectionofdiverseastrovirusesfrombatsinChina[J].JGenVirol,2009,90(Pt4):883-887.[11]ChuDK,ChinAW,SmithGJ,etal.Detectionofnovelastrovirusesinurbanbrownratsandpreviouslyknownastrovirusesinhumans[J].JGenVirol,2010,91(Pt10):2457-2462.[12]DaSS,BonettiAM,PetrocelliAT,etal.DetectionofTurkeyastrovirusinyoungpoultsaffectedwithpoultenteritiscomplexinBrazil[J].JVetMedSci,2008,70(6):629-631.[13]SmitsSL,vanLeeuwenM,vanderEijkAA,etal.Humanastrovirusinfectioninapatientwithnew-onsetceliacdisease[J].JClinMicrobiol,2010,48(9):3416-3418.[14]SnodgrassDR,AngusKW,GrayEW,etal.Pathogenesisofdiarrhoeacausedbyastrovirusinfectionsinlambs[J].ArchVirol,1979,60(3-4):217-226.[15]MandokiM,BakonyiT,IvanicsE,etal.PhylogeneticdiversityofaviannephritisvirusinHungarianchickenflocks[J].AvianPathol,2006,35(3):224-229.[16]vanHemertFJ,BerkhoutB,LukashovVV.Host-relatednucleotidecompositionandcodonusageasdrivingforcesintherecentevolutionoftheAstroviridae[J].Virology,2007,361(2):447-454.[17]ReynoldsDL,SaifYM,TheilKW.Entericviralinfectionsofturkeypoults:incidenceofinfection[J].AvianDis,1987,31(2):272-276.[18]LeeTW,KurtzJB.Humanastrovirusserotypes[J].JHyg(Lond),1982,89(3):539-540.[19]KingAMQ.Virustaxonomy:classificationandnomenclatureofviruses:ninthreportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses[M].London:AcademicPress,2012.[20]LaurinMA,DastorM,L'HommeY.Detectionandgeneticcharacterizationofanovelpigastrovirus:relationshiptootherastroviruses[J].ArchVirol,2011,156(11):2095-2099.[21]RiscoC,CarrascosaJL,PedregosaAM,etal.Ultrastructureofhumanastrovirusserotype2[J].JGenVirol,1995,76(Pt8):2075-2080.[22]陆承平.介绍新的动物病毒分类[J].动物检疫,1993(02):32-33.49 参考文献[23]DongJ,DongL,MendezE,etal.Crystalstructureofthehumanastroviruscapsidspike[J].ProcNatlAcadSciUSA,2011,108(31):12681-12686.[24]AroonprasertD,FagerlandJA,KelsoNE,etal.Cultivationandpartialcharacterizationofbovineastrovirus[J].VetMicrobiol,1989,19(2):113-125.[25]LizasoainA,TortLF,GarciaM,etal.EnvironmentalAssessmentofClassicalHumanAstrovirusinUruguay[J].FoodEnvironVirol,2015.[26]商晓桂.猪星状病毒的分离鉴定和荧光定量PCR检测方法的建立[D].内蒙古农业大学,2010.[27]KitahashiT,TanakaT,UtagawaE.[DetectionofHAV,SRSVandastrovirusgenomesfromnativeoystersinChibaCity,Japan][EB/OL].(1999-06-01)[6].http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=10423945&query_hl=1.[28]HerrmannJE,TaylorDN,EcheverriaP,etal.Astrovirusesasacauseofgastroenteritisinchildren[J].NEnglJMed,1991,324(25):1757-1760.[29]BoschA,PintoRM,GuixS.Humanastroviruses[J].ClinMicrobiolRev,2014,27(4):1048-1074.[30]LeeTW,KurtzJB.PrevalenceofhumanastrovirusserotypesintheOxfordregion1976-92,withevidencefortwonewserotypes[J].EpidemiolInfect,1994,112(1):187-193.[31]CulverF,DzivaF,CavanaghD,etal.PoultenteritisandmortalitysyndromeinturkeysinGreatBritain[J].VetRec,2006,159(7):209-210.[32]MendezE,Fernandez-LunaT,LopezS,etal.Proteolyticprocessingofaserotype8humanastrovirusORF2polyprotein[EB/OL].(2002-08-01)[16].http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=12134004&query_hl=1.[33]JiangB,MonroeSS,KooninEV,etal.RNAsequenceofastrovirus:distinctivegenomicorganizationandaputativeretrovirus-likeribosomalframeshiftingsignalthatdirectstheviralreplicasesynthesis[J].ProcNatlAcadSciUSA,1993,90(22):10539-10543.[34]MarczinkeB,BloysAJ,BrownTD,etal.ThehumanastrovirusRNA-dependentRNApolymerasecodingregionisexpressedbyribosomalframeshifting[J].JVirol,1994,68(9):5588-5595.[35]KangKI,IcardAH,LinnemannE,etal.Determinationofthefulllengthsequenceofachickenastrovirussuggestsadifferentreplicationmechanism[J].VirusGenes,2012,44(1):45-50.[36]FuY,PanM,WangX,etal.Completesequenceofaduckastrovirusassociatedwithfatalhepatitisinducklings[J].JGenVirol,2009,90(Pt5):1104-1108.[37]JacchiaS,NardiniE,SaviniC,etal.Development,optimization,andsinglelaboratoryvalidationofanevent-specificreal-timePCRmethodforthedetectionandquantificationofgoldenrice2usinganoveltaxon-specificassay[J].JAgricFoodChem,2015,63(6):1711-1721.[38]EsahliH,BrebackK,BennetR,etal.Astrovirusesasacauseofnosocomialoutbreaksofinfantdiarrhea[J].PediatrInfectDisJ,1991,10(7):511-515.[39]HerrmannJE,CubittWD,HudsonRW,etal.ImmunologicalcharacterizationoftheMarinCountystrainofastrovirus[J].ArchVirol,1990,110(3-4):213-220.[40]BelliotG,LaveranH,MonroeSS.Outbreakofgastroenteritisinmilitaryrecruitsassociatedwithserotype3astrovirusinfection[J].JMedVirol,1997,51(2):101-106.[41]PagerCT,SteeleAD.Astrovirus-associateddiarrheainSouthAfricanadults[J].ClinInfectDis,2002,35(11):1452-1453.[42]UmeshaKR,BhavaniNC,VenugopalMN,etal.PrevalenceofhumanpathogenicentericvirusesinbivalvemolluscanshellfishandculturedshrimpinsouthwestcoastofIndia[J].IntJFoodMicrobiol,50 参考文献2008,122(3):279-286.[43]GrohmannGS,GlassRI,PereiraHG,etal.EntericvirusesanddiarrheainHIV-infectedpatients.EntericOpportunisticInfectionsWorkingGroup[J].NEnglJMed,1993,329(1):14-20.[44]WunderliW,MeerbachA,GungorT,etal.Astrovirusinfectioninhospitalizedinfantswithseverecombinedimmunodeficiencyafterallogeneichematopoieticstemcelltransplantation[J].PLoSOne,2011,6(11):e27483.[45]YokoyamaCC,LohJ,ZhaoG,etal.Adaptiveimmunityrestrictsreplicationofnovelmurineastroviruses[J].JVirol,2012,86(22):12262-12270.[46]AminuM,AmehEA,GeyerA,etal.RoleofastrovirusinintussusceptioninNigerianinfants[J].JTropPediatr,2009,55(3):192-194.[47]GrayEW,AngusKW,SnodgrassDR.Ultrastructureofthesmallintestineinastrovirus-infectedlambs[J].JGenVirol,1980,49(1):71-82.[48]SmitsSL,vanLeeuwenM,KuikenT,etal.Identificationandcharacterizationofdeerastroviruses[J].JGenVirol,2010,91(Pt11):2719-2722.[49]NighotPK,MoeserA,AliRA,etal.Astrovirusinfectioninducessodiummalabsorptionandredistributessodiumhydrogenexchangerexpression[J].Virology,2010,401(2):146-154.[50]ThouvenelleML,HaynesJS,SellJL,etal.Astrovirusinfectioninhatchlingturkeys:alterationsinintestinalmaltaseactivity[J].AvianDis,1995,39(2):343-348.[51]MoserLA,CarterM,Schultz-CherryS.Astrovirusincreasesepithelialbarrierpermeabilityindependentlyofviralreplication[J].JVirol,2007,81(21):11937-11945.[52]HerrmannJE,NowakNA,BlacklowNR.DetectionofNorwalkvirusinstoolsbyenzymeimmunoassay[J].JMedVirol,1985,17(2):127-133.[53]MoeCL,AllenJR,MonroeSS,etal.DetectionofastrovirusinpediatricstoolsamplesbyimmunoassayandRNAprobe[J].JClinMicrobiol,1991,29(11):2390-2395.[54]PhillipsG,TamCC,ContiS,etal.Communityincidenceofnorovirus-associatedinfectiousintestinaldiseaseinEngland:improvedestimatesusingviralloadfornorovirusdiagnosis[J].AmJEpidemiol,2010,171(9):1014-1022.[55]ReynoldsDL,SaifYM.Astrovirus:acauseofanentericdiseaseinturkeypoults[J].AvianDis,1986,30(4):728-735.[56]ImadaT,YamaguchiS,MaseM,etal.Aviannephritisvirus(ANV)asanewmemberofthefamilyAstroviridaeandconstructionofinfectiousANVcDNA[J].JVirol,2000,74(18):8487-8493.[57]AhmedSF,SebenyPJ,KlenaJD,etal.Novelastrovirusesinchildren,Egypt[J].EmergInfectDis,2011,17(12):2391-2393.[58]LeeGC,JheongWH,KimMJ,etal.A5-yearsurvey(2007-2011)ofentericvirusesinKoreanaquaticenvironmentsandtheuseofcoliformsasviralindicators[J].MicrobiolImmunol,2013,57(1):46-53.[59]DaiYC,XuQH,WuXB,etal.Developmentofreal-timeandnestedRT-PCRtodetectastrovirusandone-yearsurveyofastrovirusinJiangmenCity,China[J].ArchVirol,2010,155(6):977-982.[60]LiuY,XuZQ,ZhangQ,etal.SimultaneousdetectionofsevenentericvirusesassociatedwithacutegastroenteritisbyamultiplexedLuminex-basedassay[J].JClinMicrobiol,2012,50(7):2384-2389.[61]NoelJS,LeeTW,KurtzJB,etal.Typingofhumanastrovirusesfromclinicalisolatesbyenzymeimmunoassayandnucleotidesequencing[J].JClinMicrobiol,1995,33(4):797-801.[62]RoyuelaE,NegredoA,Sanchez-FauquierA.Developmentofaonestepreal-timeRT-PCR51 参考文献methodforsensitivedetectionofhumanastrovirus[J].JVirolMethods,2006,133(1):14-19.[63]KuettelMR,SquintoSP,Kwast-WelfeldJ,etal.LocalizationofnuclearsubunitsofcyclicAMP-dependentproteinkinasebytheimmunocolloidalgoldmethod[J].JCellBiol,1985,101(3):965-975.[64]HolgateCS,JacksonP,CowenPN,etal.Immunogold-silverstaining:newmethodofimmunostainingwithenhancedsensitivity[J].JHistochemCytochem,1983,31(7):938-944.[65]朱文钏,孔繁德,林祥梅,等.免疫胶体金技术的应用及展望[J].生物技术通报,2010(04):81-87.[66]畅丹.猪传染性胃肠炎病毒胶体金免疫层析试纸条的研制[D].东北农业大学,2008.[67]NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,etal.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA[J].NucleicAcidsRes,2000,28(12):E63.[68]MoriY,KitaoM,TomitaN,etal.Real-timeturbidimetryofLAMPreactionforquantifyingtemplateDNA[J].JBiochemBiophysMethods,2004,59(2):145-157.[69]NagamineK,WatanabeK,OhtsukaK,etal.Loop-mediatedisothermalamplificationreactionusinganondenaturedtemplate[J].ClinChem,2001,47(9):1742-1743.[70]杨丽,何晓青,韦玉梅,等.环介导等温扩增技术(LAMP)检测人星状病毒方法的建立及其在再生水检测中的应用[J].生态毒理学报,2011(06):600-606.[71]WeiH,ZengJ,DengC,etal.Anovelmethodofreal-timereverse-transcriptionloop-mediatedisothermalamplificationdevelopedforrapidandquantitativedetectionofhumanastrovirus[J].JVirolMethods,2013,188(1-2):126-131.[72]NarushimaR,ShimazakiT,TakahashiT.Developmentofareal-timereverse-transcription-PCRmethodfordetectionofRD114virusincaninevaccines[J].Biologicals,2011,39(2):89-93.[73]MoriK,HayashiY,AkibaT,etal.Multiplexreal-timePCRassaysforthedetectionofgroupCrotavirus,astrovirus,andSubgenusFadenovirusinstoolspecimens[J].JVirolMethods,2013,191(2):141-147.[74]JiangY,FangL,ShiX,etal.SimultaneousdetectionoffiveentericvirusesassociatedwithgastroenteritisbyuseofaPCRassay:asinglereal-timemultiplexreactionanditsclinicalapplication[J].JClinMicrobiol,2014,52(4):1266-1268.[75]LiuJ,GratzJ,AmourC,etal.Alaboratory-developedTaqManArrayCardforsimultaneousdetectionof19enteropathogens[J].JClinMicrobiol,2013,51(2):472-480.[76]LeeTW,KurtzJB.Astrovirusesdetectedbyimmunofluorescence[J].Lancet,1977,2(8034):406.[77]KjeldsbergE.Serotypingofhumanastrovirusstrainsbyimmunogoldstainingelectronmicroscopy[J].JVirolMethods,1994,50(1-3):137-144.[78]SakamotoT,NegishiH,WangQH,etal.MolecularepidemiologyofastrovirusesinJapanfrom1995to1998byreversetranscription-polymerasechainreactionwithserotype-specificprimers(1to8)[J].JMedVirol,2000,61(3):326-331.[79]Sanchez-FauquierA,CarrascosaAL,CarrascosaJL,etal.Characterizationofahumanastrovirusserotype2structuralprotein(VP26)thatcontainsanepitopeinvolvedinvirusneutralization[J].Virology,1994,201(2):312-320.[80]王永霞,段招军,李宇宁.人星状病毒研究进展[J].病毒学报,2012(04):482-487.[81]ShimizuM,ShiraiJ,NaritaM,etal.Cytopathicastrovirusisolatedfromporcineacutegastroenteritisinanestablishedcelllinederivedfromporcineembryonickidney[J].JClinMicrobiol,1990,28(2):201-206.[82]刘欢.猪星状病毒分离鉴定及其全基因组序列分析和衣壳蛋白原核表达[D].广西大学,2014.52 参考文献[83]FrohmanMA.5'-EndcDNAAmplificationUsingNewRACE[J].CSHProtoc,2006,2006(1).[84]ClowneyEJ,MagklaraA,ColquittBM,etal.High-throughputmappingofthepromotersofthemouseolfactoryreceptorgenesrevealsanewtypeofmammalianpromoterandprovidesinsightintoolfactoryreceptorgeneregulation[J].GenomeRes,2011,21(8):1249-1259.[85]梁晓媛,龚瑶琴,刘奇迹,等.人胎儿骨骼和关节RACEcDNA文库的构建[J].中华医学遗传学杂志,2001(01):27-30.[86]MatzM,ShaginD,BogdanovaE,etal.AmplificationofcDNAendsbasedontemplate-switchingeffectandstep-outPCR[J].NucleicAcidsRes,1999,27(6):1558-1560.[87]MaruyamaIN,RakowTL,MaruyamaHI.cRACE:asimplemethodforidentificationofthe5'endofmRNAs[J].NucleicAcidsRes,1995,23(18):3796-3797.[88]BowerNI,JohnstonIA.TargetedrapidamplificationofcDNAends(T-RACE)--animprovedRACEreactionthroughdegradationofnon-targetsequences[J].NucleicAcidsRes,2010,38(21):e194.[89]徐烨,刘雅婷,代文琼,等.几种主要的RACE技术及应用[J].中国农业科技导报,2012(02):81-87.[90]RomaldeJL,RibaoC,LuzVM,etal.ComparisonofdifferentprimersetsfortheRT-PCRdetectionofhepatitisAvirusandastrovirusinmusseltissues[J].WaterSciTechnol,2004,50(1):131-136.[91]MeadPS,SlutskerL,DietzV,etal.Food-relatedillnessanddeathintheUnitedStates[J].EmergInfectDis,1999,5(5):607-625.53 致谢致谢时光荏苒，岁月如梭，三年的时间一晃而过。从初时的懵懵懂懂至如今的淡定从容，三年的硕士学习让我成长和成熟了很多。收获知识，转变思维，提升人格……这之间有过勤奋，有过懒惰，有过挫折，有过成就，有过失落，有过喜悦，更多的是对人生的思考和对科研的体会。这三年来，我首先要感谢我的恩师唐玉新教授，本论文是在唐老师的悉心指导下完成的，论文的每一部分都凝结着老师的宝贵心血。唐老师渊博的学识、一丝不苟的作风、严谨的科研态度、对细节的把握、耐心的指导、对学生如同慈父般的关怀都深深的铭刻在我心里。对于唐老师对我的期待，我心怀感激和愧疚。其次要感谢的是黄冬艳老师，感谢黄老师给予我的实验大量关注和指导。黄老师英俊帅气的外表，从容淡定的处事，随和亲切的为人使人印象深刻，黄老师的谆谆教诲总能令我受益匪浅。同时，我要感谢预防教研组何后军教授、王萍教授、邓舜洲老师、邬向东老师、张锦华老师、张文波老师、朱芝秀老师、陈瑞光老师在我的硕士生涯对我的支持和指导。感谢我的师姐曾珑对我如同姐姐一般的关怀和照顾，在我对实验室懵懂无知的时候是她不厌其烦地教会了我基本的实验技术和研究方法。曾珑师姐热情无私、纯真善良的为人深深地影响了我。感谢我的师兄宋德平对我实验的指导和关心，宋师兄严谨的科研态度，雷厉风行的做事风格是我今后学习的榜样；感谢张田生、聂小伟、张黎、李德峰、田光玲、曾文斌、刘悦欣、谢笑芳、樊云燕等同学这三年来与我同甘共苦，与你们相处的日子总是充满快乐；感谢师妹陈燕君、李安琪，师弟彭棋、周信荣、张帆帆对我实验的大力帮助。感谢师弟李昆陪我打了两年篮球，感谢预防组的其他师弟师妹，遇见你们是我人生的一大收获。最后，我要特别感谢我的父母和家人，感谢他们对我的无私奉献和一直以来在背后给予我的鼓励和支持，他们的殷切期望是我前进的最大动力。至此，衷心感谢所有帮助我和关心我的人们，感谢你们的支持让我得以完成学业，谢谢！54